PLoS ONE: Den rolle Transskription Factor SIM2 i prostata Cancer

Abstrakt

Baggrund

De seneste rapporter har antydet en mulig inddragelse af målbevidst homolog 2 (SIM2) i humane solide cancerformer , herunder prostatacancer. Men den nøjagtige rolle SIM2 i cancer i almindelighed og i prostatacancer i særdeleshed, fortsat stort set ukendt. Denne undersøgelse blev designet til at belyse den rolle, som SIM2 i prostatacancer ved anvendelse af en shRNA tilgang i PC3 prostatacancer-cellelinie.

Metoder

Lentiviral shRNAs blev anvendt til at inhibere SIM2 gen og protein niveauer i PC3-celler. Kvantitativ RT-PCR og forgrenet DNA blev udført for at evaluere transkript ekspression. SIM2 proteinekspression blev målt ved Western blot. Profilering af genekspression spænder over hele genomet, samt polære metabolomics af flere store metaboliske veje blev udført for at identificere de vigtigste pathway dysregulations.

Resultater

SIM2 gen- og proteinprodukter blev væsentligt nedreguleres ved Lenti -shRNA i PC3 cellelinje. Denne lave udtryk for SIM2 påvirkede genekspression profil, afslører væsentlige ændringer i de store signalveje, netværk og funktioner. Desuden blev store metaboliske veje påvirket.

Konklusion

Samlet set vores resultater tyder på en involvering af SIM2 i vigtige træk af prostata tumor cellebiologi og kan ligge til grund et bidrag på denne transskription faktor prostatakræft debut og progression

Henvisning:. Lu B, Asara JM, Sanda MG, Arredouani MS (2011) den rolle Transskription Factor SIM2 i prostatakræft. PLoS ONE 6 (12): e28837. doi: 10,1371 /journal.pone.0028837

Redaktør: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Tyskland

Modtaget: 26 august, 2011; Accepteret: November 16, 2011; Udgivet: 9. december 2011

Copyright: © 2011 Lu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af NIH-NCI Early Detection Research Network giver UO1-CA11391 (M. Sanda), Department of Defense Prostata Cancer Training Award W81XWH-09-1-0626 (B. Lu), og prostatakræft Foundation Young Investigator Award (MS Arredouani ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

målbevidst homolog 2 (SIM2) genet er placeret på den menneskelige kromosom 21q22.2 og er medlem af de grundlæggende helix-loop-helix PAS [per-Arnt-Sim] (bHLH-PAS) familie af transkription faktorer [1], [2]. SIM2 blev oprindeligt menes at bidrage til Downs syndrom (DS) [3]. Som en transkriptionsfaktor (TF), murine SIM2 (mSIM2) medierer genekspression gennem CNS midtlinie enhancer (CME) elementet med dets dimerisering partner ARNT via ARNT carboxyterminal [4]. Transskriptionsfaktoren c-myb regulerer SIM2 transskription i glioblastom celler, og en nuklear lokalisering signal (NLS) medierer nukleare lokalisering af SIM2 [5].

En tidligere

i silico

bioinformatik nærmer bruge Kræft Genome Anatomy Project (CGAP) database af National Cancer Institute (NCI) identificeret SIM2 som er forbundet med kolon, bugspytkirtel og prostata carcinomer, mens fraværende i de tilsvarende normale væv [6]. To forskellige splejsede isoformer af SIM2 udskrift, SIM2-lang (SIM2-l) og SIM2-kort (SIM2-s), er blevet rapporteret, mens deres differential funktion hos mennesker ikke er kendt endnu [1]. SIM2-s blev specifikt udtrykt i tidlige stadier af tyktarmskræft. Antisense-hæmning af SIM2-s ekspression ved antisense-oligoer forårsaget vækstinhibering og apoptose i coloncancercellelinie RKO og tumorvækst i nøgne mus og også i pankreatisk cancercellelinie Capan-1 [7], [8]. Apoptose blev induceret ved SIM2-s inhibering i RKO coloncancercellelinie [9]. SIM2-s blev også fundet at have tumor suppressive aktivitet i brystcancer [10]. Invasionen potentiale glioblastom blev reduceret betydeligt ved SIM2s inhibering, svarer til en formindskelse i ekspressionen af ​​matrixmetalloproteinase 2 ved både mRNA og protein niveauer [11].

Vi har tidligere rapporteret SIM2 som en potentiel biomarkør og immunterapi målet for human prostatacancer [12]. Selvom SIM2-s udtryk (som målt ved immunhistokemi af prostatektomi eksemplarer) er blevet forbundet med aggressiv histopatologi i prostatakræft, og overudtrykker ektopiske SIM2s forbedret overlevelse i visse betingelser i PC3AR + celler [13], [14], den funktionelle rolle af SIM2 gen i prostatacancer celle er stort set ukendt.

i denne undersøgelse har vi forsøgt at belyse den funktionelle rolle af SIM2 i PCa anvendelse af en gendæmpning tilgang og karakterisering af molekylære og funktionelle ændringer ved både genekspression profilering og metabolomiske profilering.

Materialer og metoder

cellelinjer

den menneskelige PC3, blev LNCaP, VCAP og DU145 cellelinjer købt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket som pr ATCC protokol. Godartede Prec celler, som beskrevet i Berger R et al, 2004, blev venligst stillet til rådighed af Dr. W. Hahn Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA.

Transduktion Partikler

pLKO 0,1-Puro kontrol lentiviral transduktion partikler, MISSION luciferase shRNA kontrol lentiviral transduktion partikler og MISSION SIM2 shRNA lentiviral transduktion partikler blev brugt til at inficere PC3 cellelinje (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO).

Sample udvælgelse, RNA oprensning og revers transkription

Ti benigne og fjorten tumor radikale prøver prostatektomi væv blev opnået og totale RNA’er blev forarbejdet som beskrevet i vores tidligere arbejde [12]. Cellelinie totalt RNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Oprenset RNA blev kvantificeret ved NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop, Wilmington, DE). 500 ng af hver celle total RNA blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse af oligo dT og hævet III reverse transkriptase (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) under producentens instruktioner.

Gene udtryk microarrays og analyser

250 ng total RNA blev amplificeret ved anvendelse Ambion s MessageAmp II mRNA Amplification kit. Biotin-UTP blev inkorporeret under overnight in vitro transcription trin ifølge fabrikantens protokol. Genekspression blev vurderet ved hjælp af Affymetrix s (Santa Clara, Californien) GeneChip U133 array (Plus 2,0 chip) arrays, der repræsenterer hele den menneskelige genom udskrifter. 15 ug cRNA var fragmenteret og hybridiseret til arrays ‘i overensstemmelse med producentens protokoller som tidligere [15] beskrevet. Kvaliteten af ​​scannede arrays billeder blev fastsat på grundlag af baggrundsværdier, procent tilstedeværende opkald, skaleringsfaktorer og 3’-5 ‘forholdet mellem β-actin og GAPDH hjælp af BioConductor R pakker. Signalet for hver udskrift blev opsummeret ved hjælp PM-only baseret signal modellering algoritme beskrevet i dchip. PM kun baseret modellering baseret algoritme udbytter mindre antal falske positiver sammenlignet med PM-MM-model. På denne måde signalværdien svarer til det absolutte niveau af ekspression af et udskrift [16]. Disse normaliserede og modellerede signalværdier for hvert transkript blev anvendt til yderligere højt bioinformatik analyse. Under beregningen af ​​model baseret udtryk signalværdier, matrix og probe outliers er afhørt og billeder spike behandles som signal outliers. Påvisningen outlier blev udført under anvendelse dchip outlier detekteringsalgoritme. En chip betragtes som en outlier hvis proben, enkelt eller matrix outlier procentdel overstiger en standard tærskel på 5%. Ved sammenligning af to grupper af prøver for at identificere gener, der er beriget i en given fænotype, hvis 90% lavere konfidensgrænse (LCB) af folden ændring (FC) mellem de to grupper var over 1,2, blev det tilsvarende gen anses for at være differentielt udtrykt. LCB er en stringent estimat af FC og har vist sig at være den bedre placering statistik [17] Det er blevet foreslået, at et kriterium for udvælgelse af gener, der har en LCB over 1,2 sandsynligvis svarer til gener med en “faktisk” fold ændring på mindst 2 i genekspression [18]. Data blev udvundet fra CEL filer og normaliseret ved hjælp RMAexpress (https://rmaexpress.bmbolstad.com/). Data blev analyseret ved hjælp MeV software (https://www.tm4.org/mev/)

Cell signalvej analyse

Opfindsomhed Pathways Analysis (Ingenuity Systems®, http:. //www.ingenuity.com) ansøgninger blev brugt til at generere netværk og vurdere statistisk relevante biofunctions, kanoniske veje og netværk forbundet med de differentielt udtrykte gen profiler udvundet fra transkriptom data.

forgrenet DNA og kvantitativ realtids-PCR ( QRT-PCR)

forgrenede DNA blev udført for at vurdere SIM2s og SIM2L genekspression i de menneskelige prostata samlede RNA-prøver og normaliseres med 2 kontrolpunkter gener ALSA1 og HPRT (QuantiGene 2,0 reagenssystem, Affymetrix Inc, Fremont, CA ). Til kvantitativ RT-PCR blev 1 pi cDNA anvendes til hver brønd RT-PCR-reaktioner. Prøver blev udført i triplikater. Taqman universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) blev anvendt til to-trins real-time RT-PCR-analyse på Applied Biosystems 7900HT Prism instrument. Taqman real time PCR primere for GAPDH (4310884E) og SIM2L (hs00231925_m1) blev erhvervet fra Applied Biosystems (Foster City, CA). Taqman real time PCR primere til SIM2s designet af vores gruppe og købt fra Biosearch Technologies (Novato, Californien). SIM2s forward primer: 5′-gtgccaagct acgaaggtg-3 ‘; SIM2s revers primer: 5’-acttagaagcagaaagagggcaag-3 ‘; sonde: TCAGGTCTGCTCGTGGGGAAGGTG. Ekspression værdi SIM2s eller SIM2L i en given prøve blev normaliseret til den tilsvarende ekspression af GAPDH. De 2

-ΔΔCt metode blev anvendt til at beregne relative udtryk for SIM2 gen som beskrevet tidligere [19], [20].

Lentiviral transduktion og stabil cellelinje valg

1,6 x 10

4 PC3-celler blev udpladet i 96-brønds plade og inkuberet i 20 timer. Medium blev fjernet, og 110 ul af frisk medium indeholdende hexadimethrinbromid til en slutkoncentration på 8 ug /ml blev tilsat. Lentivirale partikler blev tilsat til passende brønde ved 5 MOI (infektionsmultiplicitet) og inkuberet natten over. Frisk medium blev derefter tilsat, og celler dyrket i 2 dage, efterfulgt af en 10-12 dages dyrkning med puromycin (2 ng /ml) tilsat hver 3. dag.

Forbigående transduktion blev opnået over en 3-dages inkubation.

Western blot

Celler blev vasket to gange med PBS to gange, før de blev høstet ved afskrabning. Cellelysater blev fremstillet i cellelyse-buffer (50 mmol /L Tris-HCl pH 8,0, 20 mM EDTA, 1% SDS og 100 mM NaCl) indeholdende en inhibitor-blanding enzym tablet (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) og PMSF ( Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af BCA protein assay kit (Thermo Scientific, Rockford, IL). I alt 20-50 ug protein ekstrakt blev fraktioneret ved SDS-PAGE og overført til en polyvinylidendifluoridmembran (Immobilon-P, Millipore). Membranen blev blokeret med TBS-T (0,1% Tween 20 i PBS) indeholdende 3% tørmælk og inkuberet med SIM2s primært antistof (Santa Cruz, sc-8715, isoform NM_009586) natten over ved 4 ° C. Efter tre vaske med TBS-T, blev membranen inkuberet med HRP-konjugeret sekundært Ab i 1 time og derefter vasket med 0,05% Tween 20 i PBS. De immunkomplekser blev opdaget af ECL metoder (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Metabolit profilering hjælp Målrettet Liquid-Kromatografi Tandem massespektrometri (LC /MS /MS)

10

6 celler eksponentielt voksende i basal medier med dialyseret serum blev høstet i 3 ml 80% v /v HPLC-kvalitet methanol ved tøris temperaturer. Frisk medium blev tilsat 24 timer og 2 timer før ekstraktionen. Uopløseligt materiale i lysater blev centrifugeret ved 4000 rpm i 15 minutter, og den resulterende supernatant (metabolit indhold) blev inddampet under anvendelse af en nedkølet SpeedVac til en pellet. Prøver blev resuspenderet under anvendelse af 20 pi HPLC-kvalitet vand til massespektrometrianalyse. 10 pi blev injiceret og analyseret ved anvendelse af en 5500 QTRAP tripel kvadrupol massespektrometer (AB /Sciex) koblet til en Prominence UFLC HPLC-system (Shimadzu) via måling af udvalgte reaktioner (SRM) af i alt 255 endogene vandopløselige metabolitter for steady-state analyser af prøver. Nogle metabolitter blev rettet i både positiv og negativ ion-mode for i alt 298 SRM overgange. ESI spænding var + 4900V i positiv ion-mode og -4500V i negativ ion-mode. Opholdstiden var 5 ms pr SRM overgang og den totale cyklustid var 2,09 sekunder. blev erhvervet Ca. 8-10 datapunkter pr detekteret metabolit. Prøver blev leveret til MS via normal fase under anvendelse af en 2,0 mm i.d x 15 cm Luna NH2 HILIC søjle (Phenomenex) ved 285 uL /​​minut. Gradienter blev kørt ud fra 85% puffer B (HPLC-kvalitet acetonitril) til 42% B fra 0-5 minutter; 42% B til 0% B fra 5-16 minutter; 0% B blev afholdt fra 16-24 minutter; 0% B til 85% B fra 24-25 minutter; 85% B blev holdt i 7 minutter for at re-ækvilibrering af søjlen. Buffer A bestod af 20 mM ammoniumhydroxid /20 mM ammoniumacetat (pH = 9,0) i 95: 5 vand: acetonitril. Peak områder fra den samlede ion strøm for hver metabolit SRM overgang blev integreret ved hjælp MultiQuant v1.1 software (AB /Sciex).

Målinger blev udført i tre eksemplarer og data blev normaliseret per celle nummer. Kun metabolitter, der blev bestemt i alle 6 prøver blev holdt og analyseret ved hjælp MetaboAnalyst [21], [22].

Statistisk analyse

Gene udtryk array-data blev analyseret som beskrevet under materialer og metoder. Baseret på vores tidligere arbejde [12], vi testet for SIM2 opregulering i tumorer versus kontrol med en ensidig t-test og sammenlignet mod en p-værdi tærskel på 0,05.

Kvantitative Real-Time PCR (QRT -PCR).

Validering af differentielt udtrykte gener blev udført af QRT-PCR. 200 ng af høj kvalitet RNA-prøver blev revers transkriberet til første streng cDNA og 1 pi cDNA blev anvendt til hver brønd RT-PCR-reaktion. Prøver blev udført i triplikater. SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) blev anvendt til to-trins real-time RT-PCR-analyse på Applied Biosystems 7900HT Prism instrument. PCR-primere sekvenser for målrettede gener er vist i tabel S3. Sekvenserne for GAPDH: GAPDH-F (5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC 3 ‘) og GAPDH-R (5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG 3’). Ekspression værdi af det målrettede gen i en given prøve blev normaliseret til den tilsvarende ekspression af GAPDH. De 2

-ΔΔCt metode blev anvendt til at beregne relative ekspression af de målrettede gener.

Resultater

SIM2 genet udtrykkes differentielt i prostata normal og cancer prostatektomi og cellelinier

vi har vurderet SIM2 genekspression i alt 24 normale og tumor prostatektomi prøver er vist i tabel 1. Da SIM2 genet findes i to isoformer, SIM2 korte (SIM2s) og SIM2 lang (SIM2L), bekræftede vi ekspressionen af ​​begge isoformer i RNA ekstraheret fra prostatektomi hjælp forgrenet DNA-teknik (fig 1A . 1B). SIM2s og SIM2L viste signifikant overekspression i tumorprøver i sammenligning med godartede prøver, med p 0.000003 og p 0,00005 hhv. Imidlertid er forholdet mellem SIM2s at SIM2L ekspression var ingen forskel mellem godartet og tumor (tabel 1, T-test med p = 0,85). Den SIM2s og SIM2L udtryk var 7.03 og 6.95 gange højere henholdsvis i tumorerne sammenlignede hjælp af de to grupper efter en justering log for at forsikre normalitet og konstant varians inden for hver gruppe. Ekspression af SIM2s og SIM2L blev også evalueret i fire human prostatacancer-cellelinier, PC3, LNCaP, DU145 og VCap, og i den normale prostata epitelial cellelinje Prec. Både SIM2s og SIM2L isoformer var stærkt udtrykt i VCAP celler, mens der var en moderat udtryk niveau i PC3 celler og meget lav udtryk i DU145, LNCaP, og Prec celler (Fig. 1C). Fordi der er kun få tilgængelige antistoffer til SIM2, har vi kun været i stand til klart at identificere den korte isoform af SIM2 (SIM2s) i cellulære protein ekstrakter ved Western blot. Denne mangel på antistoffer kompliceret vores opgave at studere funktionen af ​​SIM2 lang isoform. Den SIM2s proteinekspression niveau var i overensstemmelse med dens genekspression i prostata normale og cancer-cellelinjer. (Fig. 1D).

kvantitativt udtryk for SIM2 short isoform (A) og SIM2 lang isoform (B) blev evalueret ved forgrenede DNA-teknik i 10 normale og 14 humane cancer prostatektomi prøver. Data blev kvantificeret ved anvendelse ALSA1 og HPRT som normalizers. (C) Kvantificering af SIM2 korte og lange isoformer ‘udtryk i menneskelig prostata normal og cancer cellelinier ved real time RT-PCR. Data blev kvantificeret ved metode ΔΔC

T og normaliseret til GAPDH. Kolonne i hvid repræsenterer SIM2 kort isoform og søjle i grå repræsenterer SIM2 lang isoform. (D) Western blot blev udført i prostata normale og cancer cellelinjer for SIM2s.

Silencing SIM2 udtryk i PC3 celler

For at opnå den højeste nedregulering af SIM2 udtryk ved hjælp lentiviral shRNA, har vi udvalgt PC3 cellelinjen som model. PC3 celler blev transduceret med fem forskellige SIM2 shRNA ekspressionsvektorer, hvoraf fire (shRNA48, shRNA49, shRNA50 og shRNA51) viste signifikant hæmmende effekt i forhold til at styre shRNAs. Over 80% silencing af genekspression blev opnået under anvendelse shRNA51 (Fig 2A . B). To kontrol-cellelinier blev dannet under anvendelse af enten en vektor, der stabilt udtrykker shRNA målretning luciferase eller en tom vektor. Et lignende inhiberende mønster blev observeret for SIM2L genekspression i disse stabilt inficerede PC3 cellelinier. Tilsvarende blev effektiv forbigående silencing af SIM2S og SIM2L opnået i PC3 (Fig S1).

Real time RT-PCR blev udført i triplikater (A) og protein-ekspression blev vurderet ved Western blot (B). Kontrol 1: Luciferase shRNA vektor, Kontrol 2: PLKO vektor. sh48, sh49, sh50, sh50, SH51 og sh52: vektorer, der udtrykker shRNAs målrettet SIM2 gen på forskellige steder. Kolonne med “*” repræsenterer et betydeligt nedregulering af SIM2 genekspression ved shRNA sammenligne både af kontrol 1 og kontrol 2 (P 0,05).

indvirkning SIM2 lyddæmpning på genekspression profil i PC3-celler

på trods af sin mistanke rolle i cancer, meget lidt er kendt om bidraget fra transskription faktor SIM2 til reguleringen af ​​genekspression [23]. Vi har derfor undersøgt virkningerne af nedregulering af SIM2 i prostata kræftceller. Til dette formål shRNA som gav det højeste lyddæmpende på SIM2, dvs. shRNA51, blev valgt. PC3 celler behandlet med shRNA51 blev sammenlignet med en kontrol shRNA (shRNAc).

genekspressionsprofiler af PC3 SIM2

lave og kontrol PC3-cellelinjer blev vurderet ved anvendelse Affymetrix GeneChip U133 array (Plus 2.0 chip), der består af 52.000 udskrifter fra hele menneskelige genom udskrifter. Figur 1 er en varme kort, der viser det gen dysregulering efter banker ned ekspressionen af ​​SIM2 i PC3-celler. Ekspressionen af ​​et stort antal transkripter udviste en ændring på mindst 2-fold (figur 3A og tabel S4). Pathway analyse afslørede, at mange højt differentielt udtrykte transkripter repræsenterer gener, der hører til kendte signalveje, såsom PTEN og PI3K /AKT signalveje (figur 3B), hvis medvirken i tumorigenese er veldokumenteret [24], [25]. Specifikke gener involveret i hver signalvej er vist i tabel S1. Blandt de gener, CCL5, MAPK1, P38, DDR1 og ERK spillede en central rolle i forløbet netværk (figur 4). Generne i dette netværk har været involveret i celledød, stofskifte, cellulære udvikling, og tumor antigen præsentation. Flere gener involveret i den højeste score net er vist i tabel S2. Yderligere analyse viste, at en række vigtige biologiske funktioner dysreguleret efter SIM2 silencing (figur 3C). Interessant, flere celle funktioner i forbindelse med stofskiftet, såsom stofskiftet narkotika og metabolisk sygdom, er blandt de højest rangerede funktioner.

A. Kontrol A: PC3 luciferase shRNA; Kontrol B: PC3 PLKO vektor; SIM2 C: SIM2 sh48; SIM2 D: SIM2 SH51. Gene udtryk var enten op eller ned mere end 2 gange i SIM2

lav blev noteret. B. Top dysreguleret signalveje i SIM2

lave PC3 celler. C. Top dysreguleret cellefunktioner i SIM2

lave PC3 celler.

Dette netværk indeholdt 16 fokus gener med en score på 29. Forskellige former for node repræsenterer forskellige grupper af fokus gener. Intensiteten af ​​knudepunktet farve indikeret graden af ​​den op (rød) og ned (grøn) genekspression niveau. De øverste funktioner i dette netværk er cellulær bevægelse, immun celle menneskehandel, organismal skade og abnormiteter.

Validering af RT-PCR af en gruppe af differentielt udtrykte gener (Tabel S3) delvist bekræftet vores i silico analyse af stabile og forbigående transfektant PC3 celler (figur 5 6)

QRT-PCR validering af mRNA ekspressionsniveauer af enkelte gener blev udført af to-trins real-time RT-PCR-analyse på Applied Biosystems 7900HT Prism. instrument. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001. Målinger blev udført i tre eksemplarer og data præsenteret som gennemsnit ± SD.

QRT-PCR validering af mRNA ekspressionsniveauer af enkelte gener blev udført ved to-trins real-time RT-PCR-analyse på Applied Biosystems 7900HT prisme instrument. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001. Målinger blev udført i tre eksemplarer og data præsenteret som gennemsnit ± SD.

PC3 SIM2

lave celler viste større ændringer i deres metaboliske profil

Vi søgte at afgøre, om genekspression ændringer medføre betydelige ændringer i metaboliske veje i PC3 SIM2

lave celler. Dette blev rettet ved at måle 255 polære metabolitter hjælp målrettet massespektrometri (LC /MS /MS). Sammenligning af den metaboliske profil kontrolceller til shRNA-SIM2-behandlede celler viste væsentlige ændringer i flere metaboliske veje og produktion af 39 metabolitter (tabel 2 3). Den purinmetabolisme vej var den øverste dysreguleret vej med 11 metabolitter markant op- eller ned-regulerede niveauer ud af de samlede 92 metabolitter i denne vej i SIM2 lukke munden PC3 celler. Pyrimidin stofskifte vej opført som den anden dysreguleret vej med 6 ud af i alt 60 metabolitter med betydelige ændrede niveauer (tabel 2, fig. 7). De væsentlige ændringer af nukleinsyre metabolisme kan indikere sin vigtige rolle i udviklingen af ​​prostatakræft.

metabolitter blev udvundet fra SIM2

lave og normale PC3 celler ved hjælp methanol og den overflod af 239 metabolitter blev målt ved hjælp af målrettet LC /MS /MS. Data blev analyseret under anvendelse MetaboAnalyst software. De metaboliske veje, der er anbragt ifølge scorerne fra berigelse analyse (y-akse) og fra topologi analyse (x-akse). Tredobbelte målinger blev foretaget. Vejviser

Diskussion

I vores tidligere biomarkør identifikation indsats, vi har identificeret SIM2 som en potentiel biomarkør for PSA. Takket være dets overekspression i prostatatumorer og dens meget begrænsede ekspression i mennesker, foreslog vi at bruge SIM2 som immunterapi mål og var i stand til at identificere 5 HLA-A2.1, SIM2-afledte immunogene epitoper [12]. I den foreliggende undersøgelse forsøgte vi at karakterisere rollen som SIM2 i prostatacancer ved anvendelse af en kort hårnål RNA-induceret gene silencing tilgang i PC3-celler som en model. Vi fokuserede på at profilere både transkriptom og metabolomet i SIM2

lave og normale PC3 celler, og evaluerede virkningen af ​​SIM2 lyddæmpning på cellesignalering og funktion.

SIM2s isoform er blevet rapporteret at blive udtrykt i tyktarmen , bugspytkirtel og prostatatumorer mens fraværende i de tilsvarende godartede væv [8]. Vi fandt, at SIM2 gener er påviselige i alle disse prostatacancerceller efter real time PCR. ekspressionsniveauerne i DU145 og LNCaP er imidlertid relativt lavere end andre prostatacancerceller mens PC3 celler udtrykker moderat SIM2 gener, som er i overensstemmelse med andre rapport [14].

Hele spektret af regulering af genekspression ved transkriptionsfaktoren SIM2 er stadig dårligt defineret. Niveauet af regulering kan afspejles den differentielle ekspression af omkring 200 gener som åbenbaret gennem genekspression profilering af PC3 SIM2

lave celler. Andre grupper har rapporteret specifikke gener, der er reguleret af SIM2. De bHLH /PAS transskription faktor enkelt minded 2s blev rapporteret at fremme mælkekirtlerne lactogenic differentiering ved regulering af Csn2 udtryk [26]. SIM2 regulerer ekspressionen af ​​MMP-2 og TIMP-2, hvilket drev dens rolle i glioblastomceller [11]. SIM2s undertrykker BNIP3, en pro-apoptotisk gen, gennem sin hypoxisk responselement i PC3-celler [14]. Vores genekspression profil i PC3 SIM2

lave celler viste signifikant ændring i PTEN, PI3K /AKT og Toll-lignende receptor (TLR) signalveje, der er involveret i vid udstrækning i tumoren progression. PTEN kontrollerer negativt PI3K signalvejen for cellevækst og overlevelse ved dephosphorylere 3-positionen af ​​phosphoinositider [24], [25]. TLR regulerer celledeling og overlevelse og centrale signalmolekyler mitogenaktiveret protein kinase (MAPK) og PI3K spiller nøgleroller [27]. Vore data viser, at inhibering af Sim2 genet i PC3-celler påvirker ekspression af flere gener, der koder proteiner, der er organiseret i et netværk omkring p38MAPK. Disse proteiner, som omfatter CCL5, MAPK’er, ERK og DDR1 (figur 4), er blevet rapporteret at være involveret i tumor udvikling. Chemokin CCL5 er blevet rapporteret at blive udtrykt af prostataceller og påvirke deres vækst og overlevelse. Efter aktivering af MAPK’er p38 og ERK1 /2 i LNCaP-celler, ekspression af CCL5 stiger, hvilket resulterer i øget celleproliferation [28], [29]. PC3 celledeling og invasion blev også signifikant undertrykt efter DDR1 knockdown af siRNA [30], [31].

Vores RT-PCR-data afslørede uoverensstemmelser mellem forbigående og stabil dæmpning af SIM2 i PC3 celler. Dette kan være et resultat af en) tilstedeværelsen af ​​to isoformer af SIM2 der er tavse i forskelligt omfang i begge opsætninger, eller 2) SIM2 kan regulere genekspression af andre gener, enten direkte eller indirekte.

Funktion analyse også afslørede, at tre funktioner i forbindelse med cellens stofskifte var blevet dysreguleret i PC3 SIM2

lave celler. Dette antydede, at SIM2 kan have metaboliske konsekvenser. Vi har vurderet produktionen af ​​PC3 celler i 255 metabolitter, som omfatter et stort antal humane metaboliske veje. Af disse blev opnået data for 239 metabolitter. Vores analyse afslørede betydelige ændringer i metabolitter, som er af central pathways, såsom purin- og pyrimidin pathways.

Suppression af SIM2 short isoform (SIM2s) ved antisense-oligonukleotider reducerede tumorvækst i colon cancerceller og induceret Capan-1 pancreatisk celledød via apoptose [7], [8], [9]. SIM2s blev også rapporteret at være en aggressiv prostatakræft biomarkør siden SIM2s protein blev forbundet med øget præoperativ serum prostataspecifikt antigen (PSA), høj histologisk grad, invasiv tumor vækst og øget tumorcelleproliferation [13]. En nylig undersøgelse viste, at SIIM2s kan dæmpe celledød processer gennem BNIP3 undertrykkelse i PC3AR + celler. Imidlertid knockdown af SIM2s i brystkræft MCF-7-celler forøget tumorigenese og viste således tumorsuppressoraktivitet [32], [33]. De fleste af de tidligere undersøgelser fokuseret på de SIM2s ved enten at trænge eller knockdown af SIM2s, vi mangler af data præciserer funktionelle rolle af SIM2 protein, herunder begge sine isoformer. Vores undersøgelse rapporterede en samlet rolle begge isoformer af SIM2 impliceret i prostatacancer celle. Skelne roller SIM2s og SIM2L kan have mere dybere mening at forstå den funktionelle rolle af SIM2 i prostatakræft progression, som er vores næste skridt at afdække mere betydning af dette gen.

Støtte Information

Figur S1 .

Forbigående lyddæmpning af SIM2s og SIM2L udtryk i PC3 celler. PC3-celler blev transduceret med enten en kontrol (Ctrl) eller shRNA51 (SH51) og dyrket i nærvær af puromycin i 3 dage. Real time RT-PCR blev udført i tre eksemplarer til at vurdere genekspression af SIM2 s (øverste panel) og SIM2L (Lower Panel)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0028837.s001

(TIF)

tabel S1.

Den øverste dysreguleret signalveje i SIM2

lave celler. Top dysreguleret kanoniske veje blev identificeret ved analyse af differentielt udtrykte gen data, ved hjælp af Ingenuity Pathway Analyse pakke

doi:. 10,1371 /journal.pone.0028837.s002

(DOC)

tabel S2.

Molekyler i den højeste score Netværk i SIM2

lave celler. Data, der repræsenterer differentielt udtrykte gener blev forelagt Ingenuity Pathway Analyse pakke og høj score netværk blev identificeret

doi:. 10,1371 /journal.pone.0028837.s003

(DOC)

tabel S3.

Liste over anvendte primere til RT-PCR kvantificering af ekspression af udvalgte gener. Primerne blev designet ved hjælp Pimer3 program:. https://frodo.wi.mit.edu/primer3/

doi: 10,1371 /journal.pone.0028837.s004

(DOC)

Tabel S4.

Gene udtryk, der enten op- eller nedreguleret større end 2 gange i SIM2

lav

doi:. 10,1371 /journal.pone.0028837.s005

(XLSX)