PLoS ONE: Anti-Tumor Virkninger af en bestemt anti-ADAM17 antistof i en kræft i æggestokkene Model In Vivo

Abstrakt

ADAM 17 (TNF-α konverterende enzym, TACE) er et potentielt mål for kræftbehandling, men de små molekyleinhibitorer rapporteret til dato ikke er specifikke for denne ADAM familiemedlem. Denne membranbundne metalloproteinase er ansvarlig for ektodomæne udgydelse af patologisk signifikante substrater, herunder TNF-α og EGFR-ligander. Formålet med denne undersøgelse var at evaluere farmakokinetikken, farmakodynamik samt antitumoreffektivitet af den første specifikke inhibitor, et anti-humant IgG-antistof ADAM17, klon D1 (A12). Vi anvendte intraperitoneale xenotransplantater af den humane ovariecancer-cellelinje IGROV1-Luc i Balb /c nøgne mus, valgt, fordi det tidligere blev rapporteret, at væksten af ​​disse xenotransplantater inhiberes af knock-down af TNF-α.

In vitro

, 200 nM D1 (A12) inhiberede afgivelse af ADAM17 substrater TNF-α, TNFR1-α, TGF-α, amphiregulin (AREG), HB-EGF og IL-6Ra, fra IGROV1-Luc celler , (4,7 nM IC

50 for TNF-α udgydelse). I IGROV1-Luc implanteret

in vivo

viste D1 (A12) IgG farmakokinetiske egenskaber er egnede for undersøgelser af effekten, med en enkelt i.p. dosis på 10 mg /kg D1 (A12) tilstrækkelig til at opretholde IgG plasma- og ascitesvæske koncentrationer over 100 nM i mere end 7 dage. Plasmahalveringstiden var 8,6 dage. Dernæst blev en effekt studie udført, dosering D1 (A12) eller anti-human TNF-α antistof infliximab ved 10 mg /kg q7d, kvantificering IGROV1-Luc tumor byrde ved bioluminescens. D1 (A12) IgG viste en signifikant reduktion i tumorvækst (p = 0,005), 56% af kontrol køretøj. Overraskende havde D1 (A12) ikke reducere koncentrationen af ​​cirkulerende human TNF-α, hvilket antyder, at et andet enzym kan kompensere for inhibering af ADAM17

in vivo

(men ikke

in vitro

). Men D1 (A12) gjorde viser klare farmakodynamiske virkninger i mus, med signifikant hæmning af kaste fra tumor af ADAM17 substrater TNFR1-α, AREG, og TGF-α (4-15-fold reduktioner, p 0,0001 for alle tre) . Således D1 (A12) har anti-ADAM17 aktivitet

in vivo

, hæmmer udgyde af EGFR-ligander og har potentiale til brug i EGF ligand-afhængige tumorer

Henvisning:. Richards FM, Tape CJ , Jodrell DI, Murphy G (2012) Anti-Tumor Virkninger af en bestemt anti-ADAM17 antistof i en kræft i æggestokkene Model

In Vivo

. PLoS ONE 7 (7): e40597. doi: 10,1371 /journal.pone.0040597

Redaktør: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians University, Tyskland

Modtaget 11. april 2012; Accepteret: 11 Juni 2012; Udgivet: 11. juli 2012 |

Copyright: © 2012 Richards et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen arbejde i denne undersøgelse blev finansieret af Cancer Research UK (www.cancerresearchuk.org), tilskud nummer C96 /A8333. Prof. Murphys Chair blev finansieret af en velgørende donation til Univerity of Cambridge af Hutchison-Whampoa Ltd. Hun er ikke ansat i Hutchison Whampoa, og Hutchison Whampoa har ingen kommercielle interesser i nogen af ​​forfatternes forskning. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: CJ Tape og G . Murphy er navngivet som opfindere på en patentansøgning US61 /438.354, der dækker antistof, der anvendes i disse undersøgelser. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om deling af data og materialer. Alle forfatterne er medarbejdere fra University of Cambridge. Forfatterne erklærer, at der ikke findes andre konkurrerende interesser.

Introduktion

TNF-α konverterende enzym (TACE, ADAM17) er en membran-bundet metalloproteinase ansvarlig for spaltning og ektodomæne udgydelse af TNF-α, EGFR-ligander og andre patologisk signifikante substrater. Dysregulering af ektodomæne udgydelse er forbundet med autoimmune og cardiovaskulære sygdomme, neurodegeneration, infektion, inflammation og cancer [1].

ADAM17 har været impliceret i mange cancertyper. Det overudtrykkes i ovariecancer [2], brystcancer [3], [4], pancreas duktalt adenokarcinom [5], colorektal carcinom [6], gastriske cancer stamceller [7], GIST [8], ikke-småcellet lungekræft [9], og hoved- og halskræft [10], [11]. ADAM17 er rapporteret at have en direkte funktionel rolle i kontrollen proliferation og /eller migration af celler, der stammer fra mange tumortyper [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18] , [19], [20], og det har været impliceret i kontrollen endothelcellemigration [21] og patologisk angiogenese [22], [23], som også er relevant for tumorvækst. ADAM17 kan aktiveres ved kemoterapi, hvilket resulterer i vækst faktor udgydelse, dermed bidrager til modstanden i kolorektal cancer modeller [15], [24]. ADAM17 kan også bidrage til resistens over for trastuzumab (Herceptin

TM) i brystcancer [25]. Således ADAM17 gør et attraktivt mål for udviklingen af ​​inhibitorer, som ville have bredspektret terapeutisk potentiale i behandlingen af ​​patienter med cancer.

Små molekylære inhibitorer af ADAM17 er blevet udviklet, men ingen har endnu vist fuldstændig specificitet for ADAM17 . For eksempel INCB3619 og INCB7839 hæmmer ADAM10, ADAM17 og matrix metalloproteinaser MMP2, MMP12 og MMP15 [9], [26], [27], [28]. De to ADAM17 hæmmere, som har udviklet sig længst i udviklingen [29] er DPC 333 (BMS-561.392) [30] og TMI-005 (apratastat) [31]. Disse både vise nogle hæmmende aktivitet mod andre MMPS og ikke videre end fase II studie på grund af toksicitet eller manglende effekt. Bredspektrede MMP-hæmmere (marimastat, prinomastat, tanomastat), som også hæmmer Adams, ikke har gjort fremskridt ud over kliniske fase III-undersøgelser på grund af manglende effekt og signifikant toksicitet [32], [33], [34], [35], hvilket antyder, at specificitet er nøglen ved udviklingen metalloproteinaseinhibitorer.

Et specifikt humant ADAM17 inhiberende antistof, D1 (A12), er for nylig blevet udviklet, som inhiberer proteolyse af ADAM17 substrater (TNF-α, AREG, etc., ) i kræftceller

in vitro

[36]. Formålet med undersøgelserne rapporteret her var at vurdere egnetheden af ​​D1 (A12) antistof til terapeutisk brug, ved at undersøge dens farmakokinetik, farmakodynamik og anti-tumor effekt i mus. Vi valgte at bruge IGROV1-Luc model af ovariecancer, som er blevet rapporteret at være TNF-α- afhængige [37].

Der er observeret høje niveauer af ekspression af TNF-α i ovariecancer [38 ], [39], [40], især af den høje kvalitet serøs typen [41], og et anti-TNF-α-antistof, infliximab (Remicade

TM), er blevet undersøgt for sin effektivitet mod ovariecancer [42 ]. Den IGROV1-Luc model er en human tumor xenograft model af intraperitoneal formidles ovariekarcinom. IGROV1-Luc celler udskiller TNF-α og knockdown af TNF-α-ekspression ved transfektion af IGROV1-Luc-celler med anti-TNF-α shRNA er tidligere rapporteret at inhibere tumorvækst [37]. Inhibering af ADAM17 af D1 (A12) antistof var forventet at inhibere TNF-α sekretion og derved inhibere væksten af ​​IGROV1-Luc tumorer

in vivo

. Til sammenligning blev en gruppe af mus behandlet med infliximab, som forventedes at direkte reducere funktionel human TNF-α, også fører til hæmning af væksten af ​​IGROV1-Luc tumorer.

Materialer og Metoder

Antistoffer og kemikalier

Isolering og oprensning af humane anti-ADAM17 antistof D1 (A12) er tidligere blevet beskrevet [36]. Kort fortalt blev D1 (A12) IgG udtrykt ved transfektion af HEK293-celler og konditioneret medium blev opsamlet. Antistoffet blev oprenset fra mediet ved kromatografi på 2 Protein L-søjler (Pierce) efterfulgt af 2 Melon Gel-søjler (Pierce) og AKTA FPLC, og derefter dialyseres i sterilt phosphatbufret saltvand (PBS), pH 7,4 og filtersteriliseres. Infliximab (Remicade

TM, Janssen Biotech Inc.), en venlig gave fra Prof. Peter Taylor (Kennedy Institute of Rheumatology), blev opløst i sterilt saltvand. Styre humant plasma IgG (R D Systems DuoSet kits: human TNF-α (TNFSF1A, kat nr DY210.), human opløselig TNFR1-α (TNFRSF1A, kat nr DY225.), human TGF-α (kat nr DY239.), human AREG (kat nr. DY262), human IL-6Ra (kat. Nej DY227) og human HB-EGF (DY259). Den DY210 kit blev bekræftet at være specifikt for human TNF-α ved at teste rekombinant muse-TNF-α med dette kit, der var ingen krydsreaktivitet.

Hvor blev anvendt tumor homogenater, rå nM koncentrationer i homogenat opløsning var konverteret til nmol pr mg væv, og derefter bruge den antagelse, at vævet densitet 1 g /ml, den molære koncentration i væv blev beregnet.

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført på formalin-fikseret, paraffinindlejret sektioner af tumor og lever efter antigen-genvinding ved enzymfordøjelse (proteinase K) ved 37 ° C i 10 minutter. Det humane IgG, som musene var blevet doseret (D1 (A12) eller infliximab) blev detekteret ved binding af et biotin-SP-konjugeret AffiniPure F (ab ‘) 2-fragment æsel-anti-human IgG (H + L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), efterfulgt af farvning med DAB + kromogen. Slides blev scannet ved hjælp af en ScanScopeXT (Aperio Technologies, Inc.) på 20X forstørrelse og scannede billeder blev vist ved hjælp af Spectrum v10 software (Aperio Technologies Inc). Intet billede manipulation blev udført.

Resultater

Effekt af D1 (A12) antistof i IGROV1-Luc celler

in vitro

IGROV1-Luc tumorceller

in vitro

secerneret TNF-α, TNFR1-α, TGF-α, AREG, HB-EGF og IL-6Ra, alle kendte substrater for udgydelse aktivitet af ADAM17, i dyrkningsmediet selv når ustimuleret (figur 1A). Når de stimuleres med PMA koncentrationerne af disse proteiner udskilles til mediet steg mindst 5-fold (bortset fra IL-6R α, 2,7-fold stigning). Dette PMA-stimuleret forøgelse blev inhiberet ved tilsætning af 200 nM D1 (A12) IgG (figur 1A). Inhiberingen af ​​TNF-α udgydelse af D1 (A12) var dosisafhængig, med en IC

50 i IGROV celler fra 4,7 nM (figur 1B). D1 (A12) var en mere potent inhibitor af TNF-α udgydelse end N-TIMP-3 (IC

50 af 72 nM), en naturlig metalloproteinaseinhibitor tidligere vist at inhibere ADAM17 [43]. D1 (A12) IgG inhiberede også konstitutiv afgivelse af TNF-α i mediet over en længere periode (figur 1C). D1 (A12) ikke inhiberer proliferation af IGROV1-Luc celler

in vitro

i nærvær af normalt vækstmedium (data ikke vist), hvilket stemmer overens med virkningen af ​​TNF-α shRNA på IGROV1-Luc celler som tidligere beskrevet [37].

(A) D1 (A12) IgG inhiberer PMA-induceret afgivelse af ADAM17 substrater til IGROV1-Luc cellekulturmedium. Medium blev opsamlet 90 minutter efter tilsætning af PMA (100 ng /ml), D1 (A12) IgG (200 nM) eller kontrol opløsningsmiddel. Proteinerne blev kvantificeret ved ELISA. (B) Dosisafhængig inhibering af TNF α kaste med 1 time forbehandling med D1 (A12), N-TIMP-3 eller kontrol humant plasma IgG før PMA-stimulering. (C) D1 (A12) IgG inhiberer konstitutiv afgivelse af TNF-α fra IGROV1-Luc celler i dyrkningsmedium. Medium blev opsamlet efter 48 timers inkubation med eller uden IgG’er ved 200 nM. Fejl søjler viser standardafvigelsen.

IGROV1-Luc Tumor vækst

in vivo

IGROV1-Luc celler voksede og formidles intraperitonealt i nøgne mus (figur 2A ), som tidligere rapporteret [37], med individuelle tumormasser viser en histologisk udseende overensstemmelse med den menneskelige højkvalitets serøs ovarie adenocarcinom (M. Jimenez-Linan, personlig kommunikation). De største forekomster af tumor var i bugspytkirtlen, omentum og mesenterium fra alle mus. Ved slutpunktet omkring dag 32 – 35 havde de tumorbærende mus udviklede peritoneal ekssudat (ascitesvæske). Human TNF-α, TNFR1-α, TGF-α, amphiregulin (Areg), og HB-EGF (ADAM17 substrater) blev påvist i cirkulationen af ​​IGROV1-Luc tumor-bærende mus, med høje koncentrationer i ascitesvæske og lavere koncentrationer i plasmaet (som vist i køretøjet kontrolgrupperne af effektstudie, vist senere).

(A) Eksempel på væksten af ​​IGROV1-Luc intraperitoneal tumor, som målt ved bioluminescens, fra 11 til 29 dage efter injektion af cellerne. (B og C) Farmakokinetik af D1 (A12) i nøgne mus efter en enkelt dosis på 10 mg /kg i.p. N = 2 eller flere mus pr tidspunkt. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (B) Plasmakoncentrationer i ikke-tumorbærende mus. (C) Plasma- og ascitesvæske koncentrationer i IGROV1-Luc tumorbærende mus. (D) D1 (A12) IgG i mus plasma: kapacitet for binding til ADAM17 og FcγR1. Plasma blev opsamlet på de angivne tidspunkter efter dosering musene med en enkelt dosis på 10 mg /kg D1 (A12). Bindingsaktivitet

in vitro

blev sammenlignet med den bindingskapacitet D1A12 stamopløsning. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien.

farmakokinetik D1 (A12) IgG

farmakokinetik (PK) i D1 (A12) antistof blev undersøgt ved hjælp af en enkelt 10 mg /kg dosis ip, i ikke-tumor-bærende mus (figur 2B). Farmakokinetiske parametre blev beregnet til ikke-tumor-bærende mus ved anvendelse af WinNonLin noncompartmental analyseprogram: plasma C

max = 523 +/- 58 nM, T

max 2 dage, halveringstid 8,6 dage. Mere begrænset prøveudtagning blev derefter udført i mus med IGROV1-Luc tumorer (Figur 2C), hvor D1 (A12) IgG viste lignende kinetik til den ikke-tumorbærende mus. Efter en 10 mg /kg dosis i.p. C

max var 425 +/- 51 nM i plasma og 391 +/- 19 nM i ascitesvæske, lavere end plasma C

max i mus uden tumorer. Disse data var tilstrækkelige til at forudsige, at cirkulerende D1 (A12) koncentrationer på over 100 nM kan opretholdes ved dosering 10 mg /kg en gang hver 7. dag. 100 nM D1 (A12) er tilstrækkelig koncentration til at forårsage maksimal inhibering af ADAM17 funktion i IGROV1 cellekultur (figur 1B).

Påvisningen af ​​D1 (A12) antistof ved ELISA betyder ikke nødvendigvis, at antistoffet havde bevaret dets aktivitet, som det kunne være delvist denatureret, så bindingsaktiviteten af ​​plasmaet D1 (A12) antistof blev vurderet (figur 2D og fig S1). D1 (A12) antistof fra plasmaet fra mus på alle tidspunkter fra 1 til 9 dage bevarede evnen til at binde ADAM17 (100% på dag 9, i forhold til D1 (A12) stamopløsning). I modsætning hertil evne D1 (A12) til at binde til human FcγR1 faldt med tiden, med binding efter 9 dage i mus kun 32% af bindingen af ​​D1 (A12) stamopløsning.

Virkningsfuldhedsundersøgelser og farmakodynamik

Efter at have fastslået, at D1 (A12) antistof har egnede PK egenskaber, vi testede effekten af ​​ugentlige dosering i IGROV1-Luc xenografter med 10 mg /kg D1 (A12) (n = 11), i sammenligning med 10 mg /kg infliximab (n = 8) og PBS vehikel (n = 12). Før den første dosis på dag 4 efter celleinjektion var der ingen signifikant forskel i tumorbyrde mellem grupperne: Gennemsnitlig Radiance (x 10

6 p /s /cm

2 /Sr) 2,71 +/- 1,35 , 2,92 +/- 1,23 og 2,65 +/- 0,91 for køretøjer, infliximab og D1 (A12) grupper, hhv. Tumor størrelse ved endepunktet på dag 32 er vist i figur 3. D1 (A12) havde en signifikant mindre tumor byrde (Gennemsnitlig Radiance x 10

6 p /s /cm

2 /Sr) på dag 32 på 23,3 +/- 9,1 i forhold til køretøjets gruppe (41,8 +/- 17,2, p = 0,005). Den gennemsnitlige tumorbelastning i D1 (A12) gruppe ved endepunkt var 56% af kontrollen køretøjet. I modsætning hertil var ingen hæmning af tumorvækst hos mus behandlet med infliximab sammenlignet med bærer, med tumorbyrden på 39,1 +/- 11,6 i infliximabgruppen (p = 0,68).

Vækst af IGROV1-Luc i.p. xenotransplantater i mus doseret ugentligt med vehikel, 10 mg /kg infliximab eller 10 mg /kg D1 (A12), målt ved bioluminescens. Gennemsnittet og standardafvigelsen for dag 32 tumorbyrde er vist, udtrykt som Gennemsnitlig Radiance. N = 12 for køretøjet, n = 8 for infliximab og N = 11 for D1 (A12).

For at bekræfte var opnået, at terapeutiske koncentrationer af antistof, koncentrationen af ​​D1 (A12) og infliximab blev bestemt i plasmaet og ascitesvæske (figur 4A) og i tumor homogenater (figur 4B). Som forventet blev der ikke humant IgG detekteret i nogen af ​​prøverne fra den vehikelbehandlede gruppe. D1 (A12) og infliximab var til stede i høje koncentrationer i plasma og ascites væske i passende behandling gruppen, og begge antistoffer var påviselige i tumor fra både bugspytkirtel og omentum. Koncentrationen af ​​D1 (A12) var højere i tumoren end infliximab, men infliximab var højere i plasma og ascitesvæske end D1 (A12).

Prøver blev taget ved endepunktet (dag 33), 20 timer efter den sidste antistof dosis. (A) Koncentrationer i plasma og ascitesvæske. Vandrette søjler repræsenterer middelværdi og standardafvigelse. (B) Koncentrationer i homogenater af væv fra tumor i bugspytkirtlen og omentum. (C) Immunhistokemi at detektere human IgG i IGROV1-Luc tumor og lever. Top: muse ID 901, behandlet med D1 (A12), med en pil markering af placeringen af ​​et blodkar; midten: mus ID 903, behandlet med infliximab; bund: mus ID 902, behandlet med køretøjet. Billeder blev taget ved 20X forstørrelse.

For at undersøge fordelingen af ​​D1 (A12) og infliximab i tumorvævet, blev anti-humant IgG immunhistokemi udført på paraffinsnit fra tumorerne (figur 4C). De to terapeutiske antistoffer var påviselige så stærk IHC-farvning i leveren, og begge var også påviselige i tumorvævet, men fordelingen syntes at være begrænset til blodkar.

For at bestemme om nogen af ​​antistofferne havde farmakodynamiske virkninger analyserede vi koncentrationen i plasma og ascitesvæske af produkterne af ADAM17 sheddase aktivitet, dvs. opløselig human TNF-α, opløselig TNFR1-α, TGF-α og amphiregulin (AREG) (figur 5). Alle fire af de analyserede proteiner viste signifikant højere koncentrationer i ascitesvæske end i plasma. Som forventet var der en signifikant reduktion i sTNF-α i ascitesvæsken af ​​infliximabbehandlede mus sammenlignet med vehikel (3,7 gange reduktion, p 0,0001). Overraskende var der ingen signifikant reduktion i sTNF-α i D1 (A12) -behandlet mus (P = 0,06). Imidlertid D1 (A12) gjorde viser klare farmakodynamiske virkninger ved at reducere ascitesvæsken koncentrationer af opløseligt TNFR1-α (4,4 gange reduktion, P 0,0001), AREG (5,4 gange reduktion, P 0,0001) og TGF-α ( 15-fold reduktion, P 0,0001). D1 (A12) også væsentligt reduceret plasmakoncentrationen af ​​opløselig TNFR1-α (P 0,0001), Areg (P = 0,012) og TGF-a (P = 0,005)

koncentrationer af det spaltede produkter af ADAM17. substrater i plasma og ascitesvæske ved endepunktet (dag 33), som målt ved ELISA. Vandrette søjler repræsenterer middelværdi og standardafvigelse. Stjernerne viser grupperne signifikant forskellige (P 0,05). Fra PBS kontrolgruppen i samme væske typen

Diskussion

Vi har undersøgt den biologiske aktivitet af D1 (A12), et monoklonalt antistof specifikt for human ADAM17, der inhiberer ADAM17 funktion ved cross-domæne inhibering af ektodomænet. Vi har vist, at antistoffet (ved nanomolære koncentrationer) hæmmer udgyde af ADAM17 substrater, herunder TNF-α og AREG i IGROV1-Luc celler

in vitro

.

PK egenskaber af D1 (A12 ) IgG i mus viste sig at være egnet til undersøgelser af effekten. Plasmahalveringstiden er konsistent med publicerede værdier for halveringstiden for humane IgG-antistoffer i mus plasma [46]. Plasma og ascites C

max var lavere i tumoren bærende mus end plasma C

max i mus uden tumorer. Men dette er ikke overraskende i betragtning af den større kroppens samlede fluidvolumen i tumorbærende mus på grund af de ascitesvæske rum. Plasma og ascitesvæske koncentrationer af D1 (A12) IgG var meget ens inden for hver individuel mus, fra både PK og effektivitetsundersøgelser, hvilket antyder, at antistoffet er i stand til at ækvilibrere mellem disse to rum efter enten IP eller IV-dosering. Vi har vist, at D1 (A12) antistof er strukturelt stabil i musen omløb, bevarer evnen til at binde til humant ADAM17 op til 9 dage efter dosering. Imidlertid evne D1 (A12) til at binde til human FcγR1 faldt med tiden i museplasma, således at kun 32% af bindingsaktiviteten var tilbage efter 9 dage i musen. Den reducerede FcγR1 bindingskapacitet kan skyldes opløselige Fc-receptorer til stede i museserum. For eksempel mus FcRn binder humant IgG1 med høj affinitet [47] og er ansvarlig for den lange

in vivo

halveringstid af antistoffer [48].

PK egenskaber og stabilitet i D1 (A12) IgG i musen omløb tilkendegivet, at ugentlig dosering bør holde koncentrationerne høje nok til at være biologisk aktive

in vivo

, så effektstudier blev udført i IGROV1-Luc model. D1 (A12) antistof viste antitumorvirkninger, med tumorbelastning ved afslutningen af ​​studiet ca. 56% af køretøjets kontrolgruppen. Dette var en beskeden antitumorvirkning, og nogle mulige forklaringer på dette er beskrevet nedenfor.

Tumor homogenater havde koncentrationer af D1 (A12) IgG over det cellulære IC

50, men analyse ved IHC viste begrænset penetration uden for tumor blodkarrene. Tilsvarende begrænset indtrængning er blevet observeret i xenotransplantattumorer for højaffinitets-anti-HER2-antistof trastuzumab [49], hvilket dog et effektivt lægemiddel

in vivo

. Fordeling af monoklonale antistoffer i tumorvæv har vist sig at være begrænset af penetration gennem kapillære vægge og også ved andre faktorer, når antistoffet har krydset blodkarvæggen [50]. Penetration af D1 (A12) kan være bedre i tumorer med mere gennemtrængelige fartøjer end dem i IGROV1 tumorer. Men begrænset tumor penetration af D1 (A12) IgG i IGROV1-Luc tumorer ikke forhindre antistoffet forårsager klare farmakodynamiske virkninger (udgydelse af ADAM17 substrater, se nedenfor). Interessant, D1 (A12) koncentration var højere i tumoren end infliximab, men lavere i plasma og ascitesvæske end infliximab, måske afspejler placeringen af ​​målet for hvert antistof (ADAM17 på tumorcellen plasmamembranen, versus cirkulerende TNF-α som er stede i høje koncentrationer i plasma og ascites).

for at bestemme om antistofferne blev trykke deres mål og have farmakodynamiske virkninger blev ELISA assays af ADAM17 substrater udført på plasma og ascitesvæske prøver ved slutningen af ​​effekten studere. Vehikelbehandlede mus udviste meget højere koncentrationer af opløselig TNF-α, TNFR1-α, AREG og TGF-α i ascitesvæske end i plasma, hvilket antyder, at disse proteiner ikke frit ækvilibrere mellem plasma og ascites rum, i modsætning til den doserede IgG’er som ikke ligevægt mellem rummene.

Sammenligning af D1 (A12) behandlet gruppe med kontrollerne køretøjets viste, at D1 (A12) har signifikant hæmmer udgyde af ADAM17 substrater, EGFR ligander TGF-α og AREG, og TNFR1-α. Imidlertid D1 (A12) ikke signifikant inhiberer TNF-α kaste

in vivo

, hvilket var overraskende, fordi TNF-α udgydelse blev inhiberet af D1 (A12) i IGROV1-Luc celler

in vitro

. Den manglende hæmning af TNF-α udgyde

in vivo

kunne forklare den relativt beskedne antitumor effekt af antistoffet, fordi TNF-α blev anset for at være en vigtig drivkraft for tumorvækst i denne model, baseret på shRNA arbejde Kulbe,

et

al

[37], men det infliximab data forvirrer denne hypotese (se nedenfor).

ADAM17 er blevet betragtet den centrale enzym ansvarlig for at kaste af TNF-α, men vores resultater med D1 (A12) antistof antyder, at et andet enzym kan kompensere når ADAM17 aktivitet inhiberes i IGROV1-Luc celler dyrket

in vivo

(men ikke

in vitro

). Dette kan være ADAM10: ADAM10 har vist TNF-α sheddase aktivitet i ADAM17-deficiente murine fibroblaster [51] og er blevet impliceret i TNF-α-produktion i mantlecellelymfom [52]. Også Hikita et al [53] viste, at mens ADAM17 er faktisk den vigtigste TNF-α sheddase i makrofager, ADAM10 er også en TNF-α sheddase i adenovirus-transformerede humane embryo nyre 293A-celler, NIH3T3 muse-fibroblaster og murine endothelceller. Også, når overudtrykt kan ADAM19 kunne bidrage til TNF-α udgyde [54]. Disse data antyder, at for inhibering af TNF-α kaste fra tumorer

in vivo

, kan der kræves inhibering af både ADAM17, ADAM10 og ADAM19. I

in vivo

undersøgelser tumorcellerne ville have været udsat for D1 (A12) i 28 dage, og hvis de kompenserende mekanismer var langsomme til at udvikle sig, det kunne forklare, hvorfor denne kompensation ikke blev observeret i

in vitro

assays, der blev udført i løbet af 48 timer eller mindre. En anden mulig forklaring på den manglende hæmning af TNF-α udgyde

in vivo

er, at kaste i trans være opstået, hvor murine ADAM17 på værtsceller, som ikke ville være reguleret af D1 (A12), kunne kløve TNF-α på tilstødende humane tumorceller. Så vidt vi ved trans-udgydelse ikke er blevet rapporteret for ADAM17, men det har for ADAM10 spaltning af ephrin A5 [55]. Dette tyder på, at TNF-α udgydelse var begrænset til meget aktive områder af host-tumor interaktion såsom på de invaderende marginer.