PLoS ONE: CCR6 Er prognostisk markør for Samlet overlevelse hos patienter med kolorektal cancer, og dens overekspression Forbedrer Metastase In Vivo

abstrakt

kemokinreceptor CCR6 er for nylig blevet vist at være associeret med kolorektal cancer (CRC) progression. Men den direkte bevis for, om CCR6 i tumorer er en prognostisk markør for overlevelsen af ​​patienter med CRC og om den spiller en kritisk rolle i CRC metastase

in vivo

mangler. Her viser vi, at niveauerne af CCR6 blev opreguleret i CRC cellelinjer og primære CRC kliniske prøver. CCR6 opregulering var tæt korreleret med sygdom etaper og overlevelsestiden af ​​CRC-patienter. Knockdown af CCR6 hæmmede migration af CRC celler

in vitro

. Overekspression af CCR6 i CRC celler øget deres proliferation, migration og kolonidannelse

in vitro

og fremmet deres metastatiske potentiale

in vivo

. CCR6 aktiveret Akt signalering, opreguleres metastase gener og nedreguleret metastase suppressor gener. Selektiv målretning af CCR6 i tumorer hæmmede væksten af ​​CRC i mus drastisk. Således tumor ekspression af CCR6 spiller en kritisk rolle i CRC metastase, opreguleret CCR6 forudsiger ringe overlevelse i CRC patienter, og målretning CCR6 ekspression i tumorer kan være en potentiel terapeutisk strategi til CRC

Henvisning:. Liu J, ke F, Xu Z, Liu Z, Zhang L, Yan S, et al. (2014) CCR6 Er prognostisk markør for Samlet overlevelse hos patienter med kolorektal cancer, og dens overekspression Forbedrer Metastase

In Vivo

. PLoS ONE 9 (6): e101137. doi: 10,1371 /journal.pone.0101137

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina

Modtaget: Januar 26, 2014 Accepteret: 3 juni 2014; Udgivet: 30 juni 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China og 973 Program (No: 91.029.730, No: 81.202.304, No: 2012CB917100, No: 2010CB529700 og nr: 30972787), af programmet for professor i Special Udnævnelse (Eastern Scholar) på Shanghai institutioner for videregående uddannelse, ved Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (No: 09140902600), af den førende Akademisk Disciplin projekt Shanghai Municipal Education Kommissionen (No: J50208 og nr: J50207) ved Shanghai Pujiang Program (No: 10PJ407300 ), og ved Shanghai Udvalget for Videnskab og Teknologi (11DZ2260200). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er et stort sundhedsproblem i hele verden. Selv om der er gjort betydelige fremskridt i det seneste årti, udfordringerne ved behandling af CRC og dens metastaser forblive formidabel [1]. I øjeblikket, på trods af anvendelse af specifikke aktive lægemidler til behandling af metastaserende CRC at blive mere populære, helbrede satser er lave, og de underliggende molekylære mekanismer for orgel-orienterede metastase af CRC er ikke fuldt forstået.

Kemokiner er 8 – til 12-kDa peptider, der fungerer som Kemoattrahentcytokiner og udøver deres biologiske virkninger ved at interagere med G-protein-koblede transmembrane kemokinreceptorer. En række kemokiner og deres tilsvarende receptorer er kendt for at spille en vigtig rolle i leukocyt-trafik og homing, især på steder med inflammation, vævsbeskadigelse og malign celle migration [2], [3]. Interessant, mens de fleste chemokinreceptorer binder til multiple chemokiner, kemokinreceptoren CCR6 har kun én kemokinligand, CCL20 (tidligere kendt som makrofag inflammatorisk protein-3α eller MIP-3α) [4].

CCR6 udtrykkes primært på leukocytter, med udtryk i modne lymfocytter, især i hukommelse celler [4], umodne dendritiske celler (DCS) af bestemte slægter [5] og migrerer regulatoriske T-celler [6]. I de fleste tilfælde CCR6 er fraværende fra granulocytter (undtagen aktiverede neutrofiler), monocytiske celler, umodne lymfocytter og modne DC’er [7] – [9]. CCL20 viser både konstitutiv og inducerbar ekspression, hovedsageligt i mucosa-associeret lymfoidt væv og lever [10], og den basale ekspression forøges under inflammatoriske tilstande [11]. Det basale ekspressionsniveau af CCL20 menes at regulere migrering af CCR6-udtrykkende umodne DC’er og memory-lymfocytter fra blodet til homeostatiske overvågning. Opregulering af CCL20 under inflammation kan forstærke migrationen af ​​begge disse celletyper i vævet [12] – [14]. For humane cancere, akkumulerede data indebærer en associering mellem chemokin-kemokinreceptor-system og metastatiske potentiale af cancerceller. For eksempel tumorceller fra mindst 23 forskellige typer af humane cancere af epitel, mesenchymal og hæmatopoietisk oprindelse express CXCR4 [15], [16]. CCR7 blev også fundet i bryst, mave, og esophageal skællede kræft, og dens udtryk var korreleret med dårlig prognose [15], [17], [18]. Alle disse undersøgelser viser, at ekspressionen af ​​chemokinreceptorer i cancermetastase er ikke tilfældig.

kemokinreceptor CCR6 er af særlig interesse for levermetastaser af colorektal cancer. Dens unikke kemokinligand CCL20 udtrykkes overvejende i lymfevæv og i leveren [19]. Den afvigende ekspression af kemokinreceptoren CCR6 på CRC-celler er angiveligt involveret i orgel-selektive tumormetastase [20], [21]. Men den direkte

in vivo

dokumentation for en rolle for CCR6 i metastase af CRC mangler. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at opreguleret CCR6 ekspression i metastatiske CRC cellelinier forudsagt ringe overlevelse for CRC patienter. Den overekspression af CCR6 var tilstrækkelige til at fremme CRC celle metastase både

in vitro

in vivo

. Selektivt blokerer CCR6 funktion hæmmede væksten af ​​CRC i mus drastisk. CCR6 udviser en direkte rolle i metastaser af humane CRC, eventuelt ved at regulere metastase-relaterede gener.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske udvalg af Sygehus Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kina.

Alle mus blev holdt under specifik patogen-fri (SPF) forhold overensstemmelse med National Institutes of Health guide til pasning og anvendelse af Laboratorium Dyr og med godkendelse (SYXK-2003-0026) den Videnskabelige Investigation Board i Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, Kina. For at forbedre enhver lidelse af mus observeret under disse eksperimentelle undersøgelser blev mus aflivet ved CO

2 inhalation.

Et væv microarray herunder 191 menneskelige kolorektal cancer og tilsvarende para-tumor prøver blev købt fra National Engineering Center for biochips på Shanghai. Skriftligt informeret samtykke fra donor blev opnået for brug af deres prøver til forskningsformål. Ingen af ​​patienterne modtog kemoterapi eller strålebehandling inden kirurgisk resektion. De tilstødende ikke-kræft colonvæv blev opnået fra et minimum på 2 cm væk fra tumoren at sikre, at disse væv var fri for kræftceller. Prøver blev rutinemæssigt fikseret i 10% formalin i den umiddelbare postoperative periode og indlejret i paraffin inden 24 timer af fjernelse.

Mus

C57BL /6J, Balb /c og B6.129P2-Ccr6tmlDgen /J (betegnet som CCR6

– /-). mus blev indkøbt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)

CRC Cellelinjer og cellekulturer

En udødeliggjort humane embryonale nyre-celle line, HEK293T, blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Hyclone) med 10% føtalt bovint serum (FBS). Musen kolorektal cellelinie CMT93 blev opretholdt i DMEM suppleret med 10% FBS. En anden mus kolorektal cellelinie, CT26, blev opretholdt i RPMI-1640 medium med 10% FBS. HEK293T, CMT93, CT26 og syv humane CRC cellelinjer, Caco-2, SW480, HT-29, HCT116, SW1116, SW620 og LoVo, blev alle opnået fra Cell Bank for Udvalget om Type Culture Collection af det kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina), hvor de blev karakteriseret ved DNA-fingeraftryk, mycoplasma detektion, og celle vitalitet. Caco-2 celler blev dyrket i Eagles minimale essentielle medium (Gibco) med 20% FBS. HT-29 og HCT116-celler blev dyrket i McCoys 5a Medium (Gibco) med 10% FBS. SW1116, blev SW480 og SW620-celler dyrket i Leibovitz L-15-medium (Gibco) med 10% FBS. LoVo blev dyrket i F-12K medium (Gibco) med 10% FBS. Alle celler blev dyrket i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 og 95% luft undtagen SW1116, SW480 og SW620, der blev dyrket i 100% luft ved 37 ° C.

Immunhistokemi

i immunohischemistry, vævssnit (5

um) blev skåret fra rutinemæssige blokke, de-paraffinized med xylen, rehydratiseret, og udsat for varme epitopgenfinding (HIER) metoder før inkubering med de passende antistoffer. Snit blev nedsænket i 10

mM natriumcitratbuffer ved pH 6,0 og blev efterfølgende opvarmet i en trykkoger i 10

min. Efter skylning i rindende vand og PBS blev snittene inkuberet i TBST /5% normalt gedeserum blokerende opløsning i 0,5 timer ved stuetemperatur og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med et monoklonalt anti-humant CCR6 antistof (1:50 fortynding; R 1, 1-24%; 2, 25-49%; 3, 50-74%; og 4, 75-100%. Immunfarvning intensitet blev bedømt som følger: 0, ingen; 1, svag; 2, mellemliggende; og 3, intens. Vi delte alle prøver (n = 191) i to grupper (lav eller høj CCR6 udtryk) ifølge medianen princip. At sammenligne forskellen CCR6 udtryk i kræft colon væv og matchede normale tilstødende væv i hvert klinisk fase blev kvantificering af specifikke CCR6 immunfarvning intensitet udført ved hjælp af billede gel software (IPWIN60). Kort fortalt blev den CCR6 immunfarvning af alle ondartede colonvæv og matches hosliggende ikke-kræft colonvæv på vævsarray chip fotograferet med et mikroskop ved 100 ganges forstørrelse (Carl Zeiss). Billedet gel software (IPWIN60) blev anvendt til at beregne OD-værdierne i fanget billeder. Medianen OD værdi på tre billeder fra hver kerne på væv array-slides blev brugt, og forskellen CCR6 udtryk i tumoren og matches normale tilstødende væv på hver klinisk fase blev sammenlignet.

Sårheling Assay

HCT116

Ctr, HCT116

CCR6, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr, SW1116

CCR6, SW480

shCtr, SW480

shCCR6, LoVo

shCtr og LoVo

shCCR6 celler blev separat podet i seks brønde, dyrket indtil næsten 80% sammenflydende, og serum sultet til 24

timer. Kunstige sår blev skabt ved at skrabe monolag med en steril 10

μ

l spids, og cellerne blev vasket med PBS flere gange for at fjerne flydende celler. Repræsentative billeder af celler migrerer ind i sårene blev taget til fange efter 0 timer og 24 timer under et mikroskop (20 ×).

Transwell Migration Assay

Transwell kamre bestående af 8-um porestørrelse membran filter inserter (Corning, USA) blev anvendt til bestemmelse cellemigrering evne. FBS blev anvendt som kemoattraktant. Kort fortalt HCT116

Ctr, HCT116

CCR6, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr, SW1116

CCR6, SW480

shCtr, SW480

shCCR6, LoVo

shCtr og LoVo

shCCR6 celler blev høstet og resuspenderes i serum-frie medier. En mængde på 3 × 10

4-celler blev tilsat til det øvre kammer og inkuberet i 24

timer ved 37 ° C. Celler, der var migreret gennem membranen til den nedre overflade blev fikseret med kold methanol i 10

min, farvet med 0,1% krystalviolet i 30

min, vasket, lufttørret fotograferet og tegnede .

Colony Formation Assay

HCT116

Ctr, HCT116

CCR6, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr og SW1116

CCR6 celler blev separat podet i seks-brønds plader ved en densitet på 600 celler /brønd. Medierne blev skiftet to gange om ugen, og efter 14 dage blev celler fikseret med methanol i 10 minutter, farvet med 0,5% krystalviolet i 15 minutter, skyllet tre gange med PBS til fjernelse af overskydende farvestof, fotograferet og talt.

Western blot analyse

følgende primære antistoffer blev anvendt til western blotting: menneskelig CCR6 (# 14-1969, eBioscience ™ San Diego, USA), mus CCR6 (# ab78429, Abcam), β-actin ( CP01, Calbiochem), Akt (pan) (C67E7) Kanin mAb (# 4691, cellesignalering teknologi), phospho-Akt (Ser473) Kanin mAb (# 4060, cellesignalering teknologi), phospho-Akt (Thr308) (C31E5E) Kanin mAb (# 2965, cellesignalering teknologi), P44 /42 MAPK (Erk1 /2) (137F5) Kanin mAb (# 4695, cellesignalering teknologi), phospho-p44 /42 MAPK (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204) ( 20G11) Kanin mAb (# 4376, cellesignalering teknologi). FXYD5 (# AP14909c, Abgent), SYK (# 626.201, Biolegend), uPAR (# sc-10815, Santa Cruz Biotechnology), CDH1 (# 3195P, cellesignalering teknologi), KISS-1 (# sc-18134, Santa Cruz Biotechnology ), og TIMP2 (# 635.401, Biolegend). Western blot-analyse blev udført som tidligere offentliggjort [22].

Vektorkonstruktion

lentivirusvektoren pGC-FU-Luc blev konstrueret ved indføring af ildflue-luciferase-genet (Luc) nedstrøms for CMV-promotoren i plasmidvektoren pGC-FU bærer neomycinresistensgenet. Den lentivirale shuttlevektoren pLVX-IRES-ZsGreen1-CCR6 blev konstrueret til stabilt overudtrykker CCR6 i Luc-HCT116. Kort fortalt blev 1125 bp kodende sekvens af human CCR6 (NM_004367) amplificeret fra cDNA template af humane PBMC’er og subklonet ind i Xhol- og BamHI-stederne i den pLVX-IRES-ZsGreen1 vektoren (Clontech Laboratories, USA). Den lentivirale shuttlevektor pLVXshRNA2 (Clontech Laboratories, USA) blev anvendt til at udtrykke shRNAs fra U6 promotoren. Ud over at udtrykke shRNAs, pLVX-shRNA2 udtrykker også det grønne fluorescerende protein ZsGreen1. For knockdown af CCR6 blev fire målsekvenser designet. Målsekvenserne var som følger: shCCR6-1, 5′-TCGACTCCAGTGAAGATTATT-3 ‘; shCCR6-2, 5’-GGTCTATGACAGACGTCTATC-3 ‘; shCCR6-3, 5’TTTGTAGCTCTAGGGTATATA-3 ‘; shCCR6-4, 5’GACCAGTGAGACCGCAGATAA-3 ‘. Scrambled kontrol, 5’TGTTCGCATTATCCGAACCAT-3 ‘. Kort beskrevet de komplementære DNA-oligonukleotider, som bestod af en sekvensspecifik 21 nukleotid efterfulgt af loop-sekvensen (CTCGAG) og endelig den reverse komplement af den målsøgende sekvens blev syntetiseret, annealet og indsat i pLVX-shRNA2 vektor (Clontech) mellem BamHI og EcoRI-steder nedstrøms for U6 promotoren. Fire pLVX-shRNA2-CCR6 shuttle-plasmid var forbigående transficere ind i HEK 293 T-celler med lipofectine blev RT-PCR screenet for den mest effektive CCR6 mRNA-ekspression knockdown, én ShCCR6-1 plasmid viser næsten 75% faldt CCR6 mRNA i SW480 celler samle op for følgende stabil CCR6 knockdown CRC cellelinje konstruktion.

lentivirus Produktion og transduktion

lentivirus blev produceret og høstet 72 timer efter transfektion af 293 T celler med lentivira og emballage plasmider pMD2.G og psPAX2 hjælp profection Mammalian transfektion System (Promega). Efter filtrering gennem et 0,45 um lav proteinbinding-polysulfonsyrer filter (Millipore), blev supernatanten opsamlet separat og centrifugeret i 10 min ved 2000 x g, 4 ° C før filtrering gennem et 0,45 um porestørrelse filter igen. Gennemløbet blev anvendt direkte til transduktionen af ​​humane colorektale cancerceller. For knockdown eksperiment blev seks klonale linjer screenet for CCR6 ekspression ved Western blotting. Stabilt transficerede SW480 og LoVo cellelinier viser effektivt formindsket CCR6 protein blev screenet og yderligere oprenset ved fluorescensaktiveret cellesortering for downstream eksperimenter. For overekspression eksperimentet blev to transduceret HCT116 cellelinjer genereret: HCT116 overekspression ZsGreen1 (HCT116

Ctr) og HCT116 overekspression de bicistroniske CCR6-ZsGreen1 gener (HCT116

CCR6). Den ZsGreen1

+ HCT116 celler eller ZsGreen1

+ CCR6

+ HCT116-celler blev yderligere oprenset ved fluorescensaktiveret cellesortering og ekspanderet i dyrkningsmedierne. Tilsvarende Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr og SW1116

CCR6 celler blev også genereret. Endvidere blev tre transducerede HCT116 cellelinier produceret til

in vivo Salg eksperimenter: HCT116 stabilt overudtrykker Luc-genet (Luc-HCT116) med G418-selektion, HCT116 med overekspression af Luc-genet og ZsGreen1 genet (Luc-HCT116

Ctr), og HCT116 med overekspression af Luc genet og de bicistroniske CCR6-ZsGreen1 gener (Luc-HCT116

CCR6). ZsGreen1

+ Luc-HCT116 celler eller ZsGreen1

+ CCR6

+ Luc-HCT116 celler blev yderligere oprenset ved fluorescens-aktiveret celle sortering og udvidet i dyrkningsmedier.

Menneskelig tumormetastaser PCR Array

HCT116

Ctr eller HCT116

CCR6 celler blev lyseret direkte i TRIzol-reagens, og totalt RNA blev ekstraheret ifølge producentens anvisninger (Invitrogen, Carlsbad, CA). Efterfølgende blev Super Script III syntesesystem (Invitrogen) anvendt til cDNA-syntese. Real-time PCR blev udført på hver prøve ved anvendelse af det menneskelige tumormetastase RT

2 Profiler PCR Array (Super Array Bioscience, USA) på en ABI 7900HT hurtig realtids-PCR-system (Applied Biosystems, USA). Menneskelig β-Actin var ansat til normalisering af ΔΔCt metoden.

Eksperimentel

in vivo

levermetastaser Model

Lever metastatisk kapacitet blev bestemt ved at injicere 1 × 10

6 celler per mus i milten hos BALB /c nøgne mus. Kort fortalt blev BALB /c nøgne mus bedøvet ved i.p. injektion af Pelltobarbitalum Natricum, og 1 x 10

6 HCT116

Ctr eller HCT116

CCR6 tumorceller i 25 pi blev injiceret i eksterioriseret milten med en insulinsprøjte (BD selskab) efter abdominal incision. Fem minutter efter celle injektion blev milten blodkar ligeres, og milten blev fjernet. Endelig blev den abdominale sår lukkes med hæfteklammer. Efter 5 uger blev musene aflivet, og leverne blev derefter fjernet og fotograferet.

Eksperimentel

in vivo

lunge metastase

Seven 7 uger gamle BALB /c nøgne mus i hver gruppe blev injiceret med Luc-HCT116

Ctr eller Luc-HCT116

CCR6 celler. Kort fortalt, 5 × 10

6 celler suspenderet i 200 pi PBS blev injiceret i halevenen af ​​hver BALB /c nøgne mus. Efter 6 uger blev dyrene aflivet og undersøgt makroskopisk og mikroskopisk for tilstedeværelsen af ​​metastaser. For hele kroppen lille dyr billeddannelse blev mus givet 150 ug /g D-luciferin substrat i sterilt PBS ved intraperitoneal injektion og bedøves derefter med isofluran. Bioluminescens billeder blev taget med en ladningskoblet enhed (Xenogen IVIS 200 System, Xenogen Inc., Hopkinton, MA, USA) inden for 15 minutter efter substrat injektion.

Syngene Graft CRC Model og anti-CCR6 Therapy

CMT93 celler i 100 pi PBS blev injiceret subkutant (sc) i 6 uger gamle mandlige CCR6

– /- mus (1 x 10

6 celler /mus), eller CT26-celler i 100 pi PBS blev injiceret sc i 7 uger gamle BALB /c-mus (1 x 10

6 celler /mus). Ti dage efter tumorcelleinokulering, når tumorcellerne dannede faste tumorvæv, podet CCR6

– /- mus eller BALB /c-mus blev tilfældigt opdelt i to grupper til behandling med IgG kontrol eller anti-CCR6. Tyve mikrogram IgG

2A (R 0,05, **

s

0,01, og ***

s

0,001.

Resultater

opregulering af CCR6 er korreleret med Tumor Progression

for at undersøge den kliniske relevans af opreguleret CCR6 i CRC, vi indsamlede 191 paraffinindlejrede primære CRC vævsprøver (tabel S1), og CCR6 ekspressionsniveauer blev undersøgt i hver af disse prøver ved hjælp af immunhistokemi. Korrelationen af ​​CCR6 udtryk med klinisk-patologiske træk og overlevelsen af ​​CRC patienter blev opsummeret (tabel S2). Statistiske analyser viste, at CCR6 udtryk var signifikant korreleret med det kliniske fase (

s

= 0,0117), N klassifikation (

s

= 0,0309), M klassifikation (

s

= 0,0334) og vital status (

s

= 0,0019) hos patienter med CRC (tabel S2). Endvidere fandt vi, at CCR6 ekspression blev markant opreguleret i alle analyserede kliniske CRC prøver men var kun detekterbar i lave niveauer i paratumor væv (figur 1A), og univariat analyse afslørede en stærk association mellem CCR6 farvningsintensitet og tumor stadier (n = 14,

s

= 0,0039, n = 104,

s

0,0001, n = 57,

s

0,0001, n = 16,

p

= 0,0005) (figur 1B). Disse data antyder, at CCR6 opregulering er stærkt forbundet med den kliniske progression af human CRC.

(A) immunhistokemisk farvning af CCR6 i primær CRC afledt fra 191 CRC patienter med klinisk fase I-IV. (B) Digital billedanalyse blev udført for at tælle farvning intensitet CCR6 området fraktion (CCR6-AF) værdier af parrede para-tumor /tumor prøver i hvert klinisk fase, Wilcoxon test.

opreguleres CCR6 Angiver dårlig prognose for CRC Patienter

det er vigtigt, vi viste, at CCR6 udtryk omvendt var korreleret med overlevelsestiden (

s

0,001) (figur 2A). Endvidere blev CCR6 udtryk korreleret med samlet overlevelse for undergruppe af patienter på forskellige kliniske fase, betydeligt på trin IV (

s

0,05) (Figur 2B-E). Desuden univariate og multivariate analyser viste, at M klassificering og CCR6 udtryk blev hver anerkendt som uafhængige prognostiske faktorer i CRC (tabel S3). Tilsammen antyder disse data at CCR6 har potentielle kliniske værdi som en prædiktiv biomarkør for sygdom resultat i CRC patienter.

(A) Kaplan-Meier-kurver for CRC patienter med lav versus høj ekspression af CCR6 (n = 191,

s

0,001, log-rank test). (B) Kaplan-Meier kurver af CRC patienter med lav versus høj ekspression af CCR6 i klinisk fase I (n = 14,

s

= 0,0679, log-rank test). (C) Kaplan-Meier kurver af CRC patienter med lav versus høj ekspression af CCR6 i klinisk fase II (n = 104,

s

= 0,0738, log-rank test). (D) Kaplan-Meier kurver af CRC patienter med lav versus høj ekspression af CCR6 i klinisk fase III (n = 57,

s

= 0,1749, log-rank test). (E) Kaplan-Meier kurver af CRC patienter med lav versus høj ekspression af CCR6 i klinisk fase IV (n = 16,

s

= 0,0429, log-rank test).

Knockdown af CCR6 Hæmmer migration af CRC Cells

in vitro

den observerede CCR6 overekspression havde en stærk tilknytning til CRC progression, som fik os til at undersøge virkningen af ​​CCR6 på CRC cellemigration kapacitet . To CRC cellelinjer, SW480 og LoVo, som udtrykte den højeste CCR6 udtryk for kolorektale cellelinjer vi analyserede, blev brugt til at skabe underlinjer med CCR6 stabilt slået ned af shRNA (figur 3A, B). Slående, viste resultaterne, at knockdown af CCR6 forårsagede en signifikant undertrykkelse af cellemigrering i både SW480 og LoVo cellelinier i en sårhelende assay (

s Restaurant 0,05, figur 3C). Vi brugte også en anden klassisk transwell assay til at vurdere bidraget fra CCR6 på cellen migration. Vi viste, at fjernelse af CCR6 markant reduceret migration af både SW480 og LoVo cellelinjer (

s

0,01, figur 3D). Tilsammen vores data viste, at den specifikke knockdown af CCR6 i CRC-cellelinjer i væsentlig grad kan reducere cellemigration

in vitro.

(A) Western blotting-analyse af CCR6 niveauer i 7 dyrket CRC-celle linjer. Værdier blev udtrykt som fold ændringer i forhold til Caco-2 og normaliseret for p-actin. (B) Western blotting-analyse af knockdown af CCR6 i SW480 og LoVo celler, β-actin tjente som en loading kontrol. Værdier blev udtrykt som fold ændringer i forhold til kontroller (ShCtr) og normaliseret til p-actin. (C) sårheling assays til motilitet af CCR6-tavshed SW480 og LoVo celler og kontrol celler. Repræsentative billeder af et felt i begyndelsen (t = 0 timer) (øverste felt) og i slutningen af ​​optagelsen (t = 24 timer) (nedre felt) i hver tilstand er vist. Den relative celle migration i ShCtr og shCCR6 grupper er vist i højre panel. (D) Repræsentative billeder af Transwell migrerede celler i CCR6-tavshed SW480 og LoVo celler (nederste panel) eller kontrol celler (øverste panel) celler. Antallet af migrerede celler i ShCtr og shCCR6 grupper er vist i højre panel. Værdier repræsenterer middelværdier fra tredobbelte brønde, ± S.D. *

s

0,05, **

s

0,01, Wilcoxon test. Data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

CCR6 Fremmer aggressivitet CRC Cells

in vitro

For at undersøge om den ektopisk overekspression af CCR6 kunne øge aggressivitet CRC celler, HCT116 blev Caco-2 og SW1116 cellelinjer der stabilt udtrykker ektopisk CCR6 fastsat (figur 4A). Slående, afslørede både sårheling og migration kammer analyser, CCR6 overekspression udpræget forbedret celle migration i forhold til kontrolgrupper (

s

0,05 eller

s

0,01) (Figur 4B, C) . Derudover under processen med at etablere CCR6 stabile cellelinier, bemærkede vi, at der var mere kolonidannelse i CCR6-transficerede celler end kontrol transficerede celler. Vi har derfor foretaget kolonidannelse analyser ved hjælp af stabilt transficeret HCT116

CCR6, HCT116

Ctr, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr og SW1116

CCR6 celler . Igen, vi bemærkede, at i forhold til kontrol (CTR) celler, størrelsen og antallet af kolonier dannet i CCR6 overekspression HCT116, Caco-2 og SW1116 celler var signifikant forhøjet (

s

0,05) (Figur 4D) . Tilsammen vores data dokumenterer, at den forhøjede udtryk for CCR6 spiller en afgørende rolle i den aggressive fænotype af CRC celler

in vitro

.

(A) Western blotting analyse af ektopisk udtryk for CCR6 i HCT116

Ctr og HCT116

CCR6 celler eller Caco-2

Ctr og Caco-2

CCR6 eller SW1116

Ctr og SW1116

CCR6 celler. β-actin tjente som en loading kontrol. Værdier blev udtrykt som fold ændringer i forhold til kontroller (CTR) og normaliseret til p-actin. (B) sårheling assay for motilitet HCT116

Ctr og HCT116

CCR6 eller Caco-2

Ctr og Caco-2

CCR6 eller SW1116

Ctr og SW1116

CCR6 celler . Repræsentative billeder af et felt i begyndelsen (t = 0) (øverste felt) og i slutningen af ​​optagelsen (t = 24 h) (nedre felt) i hver tilstand er vist. Den relative cellemigrering i CCR6 og kontrolgrupper er vist i højre panel. (C) Repræsentative billeder af Transwell migrerede celler i stabilt transficeret HCT116

Ctr, Caco-2

Ctr, SW1116

Ctr (øverste panel) eller HCT116

CCR6, Caco-2

CCR6, SW1116

CCR6 (lavere panel) celler. Gennemsnitligt antal af migrerede celler af HCT116

Ctr og HCT116

CCR6 eller Caco-2

Ctr og Caco-2

CCR6 eller SW1116

Ctr og SW1116

CCR6 celler er vist i højre panel. (D) Repræsentant billede af kolonidannelse i HCT116

Ctr, Caco-2

Ctr, SW1116

Ctr (øverste panel) eller HCT116

CCR6, Caco-2

CCR6, SW1116

CCR6 celler (nederste panel). Værdier repræsenterer middelværdier fra tredobbelte brønde, ± S.D. *

s

0,05, **

s

0,01, Wilcoxon test. Data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

Overekspression af CCR6 Letter Metastase af CRC Cells

in vivo

Leveren er den mest almindelige site af kolorektal cancermetastase. For at bestemme om CCR6 specifikt spiller en vigtig rolle i leveren metastase af CRC, vi etableret en eksperimentel

in vivo

levermetastaser model ved at injicere humane tumorceller i miltene fra BALB /c nøgne mus og fulgte deres evne til at invadere via portåren ind i leveren til dannelse af metastaser. For at definere forholdet mellem CCR6 og CRC levermetastaser

in vivo

, seks syv uger gammel mand BALB /c nøgne mus i hver gruppe blev injiceret med HCT116

Ctr eller HCT116

CCR6 celler i milten før splenektomi. Efter 5 uger blev musene aflivet, og de metastatiske tumorknuder der dannes i leveren blev undersøgt. Slående, blev metastatiske tumor knuder oftere fundet i lever i HCT116

CCR6 gruppe end HCT116

Ctr gruppe (figur 5A, angivet med hvide pile). Disse resultater antyder, CCR6 overekspression i cancerceller kan forbedre levermetastaser af CRC. Derudover brugte vi hele kroppen lille dyr fluorescens imaging system (IVIS) at overvåge migrationen af ​​tumorceller

in vivo

. Først konstruerede vi den stabilt udtrykker luciferase cellelinie, luciferase-HCT116 ved transfektion HCT116 celler med luciferase lentivirus, og valgt disse celler med G418.