PLoS ONE: ABCC1 er relateret til beskyttelse af den distale Nephron mod hyperosmolalitet og High Sodium Miljø: mulige implikationer for Cancer Chemotherapy

Abstrakt

Mål

Glutathion (GSH) spiller en vigtig rolle i at beskytte celler mod oxidativ skade. ABCC1 protein transporterer GSH. Selv om dette protein i høj grad er undersøgt i cancer, skyldes multilægemiddelresistens-fænotype, dens rolle i de rørformede celler i nyrerne er ukendt. Målet med denne undersøgelse var at finde ud af, om ABCC1 har en rolle i at beskytte celler fra den distale nefron mod stress forårsaget af høj medullær osmolalitet.

vigtigste metoder

MA104 celler blev behandlet med høj koncentrationer af natriumchlorid, urinstof eller begge for at hæve osmolaliteten af ​​dyrkningsmediet. Cellernes levedygtighed blev åbnet af MTT og trypanblåt analyser. ABCC1 ekspression og ekstrudering af carboxi-fluorescein (CF), et fluorescerende ABCC1 substrat, blev målt ved flowcytometri.

Hovedkonklusioner Salg

Inkubation af MA104-celler i en høj natriumkoncentration medium medført ændringer i celle granularitet og ændret udtryk og aktivitet ABCC1. Urea ændrede ikke ABCC1 ekspression eller aktivitet, men modsat de observerede NaCl effekter. Høje koncentrationer natrium havde også en negativ effekt på cellernes levedygtighed og urinstof også beskyttede celler mod denne effekt.

Betydningen

Vores resultater viser, at ABCC1 spiller en væsentlig rolle i beskyttelsen af ​​nyrerne epitelceller imod stress forårsaget af høj natrium miljø til stede i renal medulla

Henvisning:. Fonseca LM, Alvarez AB, Rodrigues RC, Santos DHF, Lopes AG, Capella MAM (2013) ABCC1 er relateret til beskyttelse af Distal Nephron mod hyperosmolalitet og High Sodium Miljø: mulige implikationer for Cancer kemoterapi. PLoS ONE 8 (6): e68049. doi: 10,1371 /journal.pone.0068049

Redaktør: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, Frankrig

Modtaget: Januar 7, 2013; Accepteret: 23. maj 2013; Udgivet: 28 juni 2013

Copyright: © 2013 Fonseca et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Programa de Oncobiologia (FECD /FAF /ONCO II), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES) og Programa de Apoio aos Núcleos de Excelencia (PRONEX). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

multiresistens (MDR) er stadig den vigtigste årsag til svigt i cancer kemoterapi. Selvom MDR er multifaktoriel, er det primært karakteriseret ved en ATP-afhængig reduktion i intracellulær lægemiddelakkumulering, på grund af overekspression af tre proteiner tilhørende ABC transportører superfamilien: P-glycoprotein (ABCB1), brystcancer protein (BCRP eller ABCG2) eller multilægemiddelresistens-associerede protein 1 (MRP1 eller ABCC1). Selv om det oprindeligt observeret i tumorceller, disse proteiner er også til stede i normale celler. I nyrer, begge ABCB1 og ABCG2 udtryk i den apikale membran af proksimale tubuli, hvilket tyder på en rolle i drug sekretion [1], [2].

ABCC1, tidligere kendt som MRP1, er et transmembrant protein oprindelig anerkendt som en transportør relateret til multilægemiddelresistens-fænotype i nogle cancerceller [3] – [6], men efterfølgende undersøgelser viste, at dette protein ubikvitært udtrykkes i stort set alle organer hos pattedyr, herunder mennesker [7], [8]. Denne transportør har en stor betydning i inflammatoriske processer og oxidativ skade, da det både transporter reduceret og oxideret glutathion, leukotrien C4 og prostaglandiner [7], [9]. Dens fysiologiske rolle er blevet undersøgt i flere organer og systemer og en af ​​de vigtigste opdagelser er, at dets tilstedeværelse er nødvendig for den hypertensive reaktion på angiotensin II [10].

Men om den fysiologiske rolle af ABCC1 i nyre, er det ikke sandsynligt, at dette protein viser nogen form for sekretorisk rolle, på grund af det faktum, at det er begrænset til glomerulus og til den basolaterale membran af både den tykke opadgående ben i Henle loop og medullær opsamlingskanal [11 ]. Denne konstatering sidst udskudt yderligere undersøgelser vedrørende betydningen af ​​denne transportør i nyrerne, selv om nogle beviser peger på en rolle ABCC1 i urin koncentration mekanismer. For eksempel tykke opadgående ben og distale tubuli er særligt følsomme over for GSH depletion fremmes af diethylmaleat (DEM), som danner komplekser med GSH, hvilket reducerer de intracellulære niveauer af dette tripeptid. Dyr, der udsættes for behandlingen med DEM viste alvorlige urin koncentration mangler [12], [13]. Desuden blev det vist, at etoposid induceret polyuri i abcc1 (- /-) mus, hvilket antyder, at dette protein eller anden måde er forbundet til vand reabsorption [14]

Adskillige anticancerlægemidler vides at inducere nefrotoksicitet.. For eksempel nefrotoksicitet induceret af cisplatin, et almindeligt anvendt lægemiddel i anticancerterapi, begrænser dets anvendelse i cancerbehandling, og udføres flere forskning for at mindske denne bivirkning [15] – [17]. Desuden blev det for nylig vist, at nefrotoksicitet associeret med doxorubicin, et lægemiddel meget brugt i kemoterapi af brystkræft og andre former for kræft, skyldes mitokondrielle forstyrrelser og celledød regulerer gener [18].

Da nefrotoksicitet er forbundet med flere lægemidler mod cancer [19], [20], og siden rolle ABCC1 i nyre forbliver uløst, nærværende undersøgelse havde til formål at anerkende en mulig rolle af dette protein i nyrerne celler. Vi observerede beviser, ABCC1 er relateret til beskyttelse af den distale nephron mod hyperosmolalitet grund af en høj natrium miljøet, og at GSH er vigtigt at opretholde levedygtigheden af ​​distale nephron celler.

Materialer og metoder

Alle dyreforsøg blev tidligere gennemgået og godkendt af Animal Emne udvalg af Centro de Ciencias da Saúde – UFRJ med protokol nummer IBCCF 082/2009

Cell Culture

Monkey embryo cellelinje MA104. , gris nyre epitelceller LLC-PK1 og hund nyre epitelial cellelinje MDCK blev alle opnået fra Rio de Janeiro Cell Bank. Cellerne blev dyrket ved 37 ° C i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (Gibco, USA) med penicillin og streptomycin (Gibco, USA) og suppleret med 10% kalvefosterserum (Gibco, USA) og L-glutamin (Gibco, USA).

Behandling med osmolytter

for at hæve osmolaliteten af ​​dyrkningsmediet, 100 mM NaCl, 200 mM urinstof, 200 mM mannitol, eller 50 mM NaCI 100 mM urinstof (slutkoncentrationer) blev tilsat til mediet, at hæve sin osmolalitet til ca. 450 mOsm /kg H

2O. Opløsningerne blev tilsat enten gradvist over en periode på 72 timer, eller i en enkelt tilsætning, som beskrevet i figurernes billedtekster.

MTT assay

MTT kolorimetrisk assay [21] blev anvendt at vurdere levedygtigheden af ​​MA104 cellelinie inkuberet i hyperosmotisk medium. Ca. 2 × 10

4 celler per brønd podedes på plader med 96 brønde. Den næste dag NaCl, urinstof, mannitol eller NaCl + urinstof blev tilsat til mediet, som beskrevet ovenfor. I nogle eksperimenter buthionine-sulfoximin, en inhibitor af GSH-syntese (BSO-Fluka, USA), og MK571, en ABCC1 inhibitor, også blev tilsat. Efter inkubationsperioder på 24, 48 eller 72 timer, 20 pi 10 mg /ml thiazoyl Blå tetrazoliumbromid (Sigma, USA) blev sat til kulturen, og cellerne blev yderligere inkuberet i 3 timer ved 37 ° C. Ved slutningen af ​​inkubationstiden supernatanten blev kasseret, og 100 pi dimethylsulfoxid blev tilsat per brønd for at opløse den nydannede formazansalt. Absorbansen blev målt ved 490 nm med en ELISA-pladelæser (Benchmark, BioRad). Middelværdier blev beregnet ud fra 3 uafhængige eksperimenter.

Trypan Blue-farvning

En anden metode, der anvendes til at få adgang cellelevedygtighed var celletælling med trypanblå-farvning. I dette tilfælde er 1 × 10

5 celler /brønd blev podet plader med 24 brønde, og efter inkubation med de osmolytter som beskrevet ovenfor, blev cellerne talt på et hæmocytometer.

Glutathion

En kommercielt kit under anvendelse monochlorobimane som substrat (Millipore, USA) blev anvendt til måling glutathion (GSH) niveauer. Til dette assay blev 1 × 10

6 celler podedes på kultur flasker, behandlet som ovenfor, og høstet med trypsin. GSH-assay blev udført ifølge producentens anvisninger. Fluorescensniveauer blev aflæst under anvendelse af en pladelæser med en 380/460 nm filtersæt.

ABCC1 Aktivitet

Celler podedes på plader med 24 brønde og behandlet med osmolytter som beskrevet ovenfor. Carboxy-fluorescein-diacetat (CFDA – Molecular Probes, USA) er en ikke fluorescerende molekyle, der omdannes til en fluorescerende én, carboxy-fluorescein (CF) af intracellulære esteraser. Dette molekyle er et substrat for ABCC1. Derfor, for at bestemme ABCC1 aktivitet blev cellerne inkuberet i 30 minutter med 2 pM CFDA (for at tillade farvestofoptagelse, esterase handling, og akkumulering af CF), skyllet med phosphatbufret saltvand (PBS), at udvaske farvestoffet og inkuberet i yderligere 30 minutter i CFDA DMEM for CF ekstrudering. Cellerne blev derefter høstet med trypsin, vasket og ressuspended i saltvand. Intracellulær fluorescens blev målt i en Beckton-Dickinson flowcytometer (FACSCalibur). Dataanalyse blev udført ved softwaren Summit (Dako Inc., USA).

Mærkning med Anti-ABCC1 Antistof

Celler podedes på plader med 24 brønde og mærkning assay blev udført som beskrevet i en tidligere arbejde fra vores gruppe [22]. Det polyklonale kaninantistof A23 (Alexis Biochemicals, USA) og Alexa Fluor 488 (Invitrogen, USA) blev anvendt som henholdsvis primære og fluorescerende sekundære antistoffer.

Western blotting-analyse for Tamms-Horsfall Protein (THP eller Uromodulin) og Aquaporin 2 (AQP2)

Angivelse af THP og AQP2 blev vurderet ved immunoblotting under anvendelse af specifikke antistoffer. Celler blev udpladet på 6-brønds plader ved en 5 × 10

5 celler /brønd og inkuberet ved 37 ° C. Efter 48 timers inkubering blev dyrkningsmediet aspireret; cellerne blev vasket tre gange med PBS (pH 7,4) ved stuetemperatur, skrabet, og centrifugeret ved 14000

g

i 60 sekunder. Cellerne blev derefter suspenderet i prøvepuffer (Trisma basen 0,76% m /v; glycerol 12,56% m /v og natriumdodecylsulfat 2,3% m /v; pH 6,8). Efter homogenisering blev en lille prøve anvendt til protein måling. Bufferen blev derefter suppleret med 0,6% dithio-L-threitol (DTT), 0,5% β-mercaptoethanol og bromphenolblåt (1 mg /ml). Proteinerne blev derefter underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) og overført til en PVDF-membran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranerne blev blokeret med Western Breeze blokerende opløsning (Invitrogen, USA) og inkuberet med specifikke antistoffer mod THP eller AQP2. Den phosphatase alkalisk Western Breeze Kit (Invitrogen, USA), blev anvendt til at visualisere bånd i membranerne. Subklon C7 fra MDCK-cellelinjen blev anvendt som en positiv kontrol for AQP2, eftersom det er sammensat af primære celler fra samlekanal [23]. Andre kontroller var uddrag fra rotte nyre medulla og cortex. Til dette Whistar rotter havde deres nyrer fjernet, dissekeret og opbevaret ved -80 ° C til forarbejdning. Organerne blev derefter homogeniseret i en opløsning bestående af PMSF (1 mM), sucrose (250 mM), EDTA (1 mM) og imidazol (20 mM), indtil et homogenat blev opnået.

Statistisk analyse

Hvert forsøg blev gentaget tre til fem gange. Data blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien og blev analyseret ved anvendelse Students t-test eller envejs ANOVA med Dunnet eller Bonferroni post-test til sammenligning af forskellene. Værdier af P mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Karakterisering af MA104 Celler

Da der ikke er human cellelinie fra distale nephron kommercielt tilgængelig, vi forsøgte at teste, om den renale abe cellelinje MA104 kommer fra en distal nephron. Først sammenlignede vi følsomheden af ​​tre pattedyr renale cellelinjer til urinstof: MDCK, en hunde nyre cellelinje med karakteristika distale nephron [24] – [26]; LLCPK1, et svin nyrecellelinie med karakteristika af proksimale tubuli [27] og MA104, endnu ikke karakteriseret. Celler blev inkuberet i 48 timer med forskellige ureakoncentrationer og celleantallet og cellulær levedygtighed blev målt ved trypanblåt-farvning. Som det kan ses i fig. 1, MA104-celler er så resistent overfor urinstof som MDCK-celler, mens LLC-PK1-celler er mere følsomme.

Cellerne blev podet på 24-brøndsplader og urinstof blev tilsat 24 timer senere i flere koncentrationer. Efter 48 timers inkubation blev celletallet og levedygtighed måles ved trypanblåt-farvning (n = 4). a – forskellig fra 37,5 mM (p 0,01); b – forskellig fra 75 mM (p 0,001).

MDCK er en hund nyre cellelinie, og der er store forskelle mellem hund og mennesker. Hertil kommer, at flere antistoffer til mennesker ikke mærke hund proteiner. På den anden side, MA104 er en abenyre cellelinje, og det er godt accepteret, at ikke-humane primater deler mange karakteristika med mennesker. Vi har tidligere vist, at antistoffer mod human ABCB1 og ABCC1 også mærket denne cellelinie [28], [29]. Eftersom ABCC1 kun udtrykkes på den basolaterale membraner af distal lige tubulus og opsamlingskanal epitel [11], og under hensyntagen til modstanden i MA104-celler til urinstof, forekommer det sandsynligt, at disse celler kom fra den distale nephron. Derfor vurderede vi nogle karakteristika af distale nephron segmenter i denne cellelinie. Vores resultater viste, at MA104-celler ikke viste signifikant mærkning med PNA, en markør for interkalerede celler og udtrykte ikke uromodulin, et protein, der kun udtrykkes i den distale lige tubulus, men udtrykker AQP2, et protein karakteristisk for primære celler af indsamlingsenheden kanal (fig. 2). Tilsammen disse resultater tyder på, at MA104 celler stammer fra indsamling kanal, hvilket gør dem en god model til at studere mulige rolle ABCC1 i modstand nyre celler til hyperosmolalitet.

A. Ekspression af THP-protein i rottenyre corticale (bane 1) og meldullary (bane 2) ekstrakter og MA104 (bane 3) i den øvre membran og β-actin i den nedre membran; B. Ekspression af Aquaporin 2 i MDCK-C7 (bane 1) og MA104 (bane 2); C og D. PNA mærkning (100 uM) af MDCK-C11 (C) og MA104 (D).

følsomhed MA104 celler til flere osmolytter

Det næste skridt var at bestemme virkningen af ​​forskellige osmolytter i overlevelsen af ​​MA104-celler. Medium osmolalitet var rejst over natriumchlorid, urinstof eller mannitol i en enkelt tilsætning (et osmotisk chok) og levedygtigheden blev målt ved MTT-assayet. Koncentrationen af ​​NaCl anvendte tidligere bestemt som den minimale NaCl-koncentration for at opnå maksimal virkning på celleoverlevelse (data ikke vist). Fig. 3 viser, at tilsætning af natriumchlorid stærkt reduceret celleoverlevelse, mens urinstof og mannitol havde kun en lille virkning. Dette resultat antyder, at den reducerede levedygtigheden af ​​celler behandlet med NaCl skyldes ikke selv hyperosmolalitet, da mannitol ikke har foretaget den samme virkning.

Efter en indledende inkubation på 24 timer ved 37 ° C, osmolytter blev tilsat til dyrkningsmediet, og cellerne blev inkuberet i yderligere 48 timer. Resultater udtrykkes som gennemsnit ± SE (n = 3). a – forskellig fra kontrol (p 0,05); b – forskellig fra NaCl (p 0,01)

Da NaCl kan påvirke flere funktioner, såsom natrium-kanaler, klorid kanaler, natrium-kalium-ATPase etc, og da der ikke er nogen data i den videnskabelige. litteratur tyder hvorvidt Na

+ eller Cl

– er den vigtigste årsag til faldet i celle levedygtighed, besluttede vi at undersøge dette punkt. Til sammenligning benyttede vi cholinchlorid, som opretholder den samme ionstyrke af mediet whithout nærvær af Na

+. I fig. 4 er vist, at NaCl og cholinchlorid ligeligt reduceret cellulær levedygtighed, hvilket antyder, at chloridionen bærer ansvaret for denne effekt.

Efter en indledende inkubation på 24 timer ved 37 ° C, osmolytter blev tilsat til dyrkningsmediet og cellerne blev inkuberet i yderligere 48 timer; A. Celler behandlet med NaCl eller NaCl + urinstof. Resultater udtrykkes som gennemsnit ± SE (n = 3). a – forskellig fra kontrol (p 0,05); b – forskellig fra NaCl 175 mM (p 0,001) og B. Celler behandlet cholinchlorid (vist som cholin) eller cholinchlorid + urea (n = 3). a – forskellig fra kontrol (p 0,001); b – forskellig fra cholin 175 mM (p 0,001)

Effekt af Urea i følsomhed MA104 celler til NaCl og Kolinklorid

Nogle forfattere observerede, at urinstof beskyttede celler mod. skade induceret af natriumchlorid [30]. Som medullære hyperosmolalitet i nyren skyldes primært urinstof og NaCl, vores næste trin var at undersøge et muligt beskyttende virkning af urinstof på cellelevedygtighed under højt NaCI-koncentration. Celler blev derefter underkastet en osmotisk shock med NaCI i nærvær eller fravær af urinstof. For at opretholde den samme osmolalitet af mediet blev forskellige mængder af NaCl og urinstof anvendes (den endelige osmolalitet af mediet med 50 mM urinstof +150 mM NaCI blev ligner medium tilsat 175 mM NaCl alene, omtrent 561 mOsm /kg H

2O som målt ved en osmometer). Til sammenligning vi også anvendt cholinchlorid. Det kan ses i fig. 4 at urinstof beskyttede celler indgives til høj NaCl, men virkningen af ​​urinstof i celler behandlet med cholinchlorid var meget mindre end den observeret for NaCl. Dette antyder, at begge ioner (Na

+ og Cl

-) deltage i celledød, men virkningen af ​​urinstof er mere udtalt under en NaCl miljø, hvilket er i overensstemmelse med den renale medullær miljø. Da cholinchlorid er ikke en osmolyt i renal medulla, vi ikke bruge dette stof i de følgende forsøg.

Intracellulær GSH Niveauer i MA104 celler behandlet med osmolytter

Der er flere beviser, at NaCl bly for oxidativ beskadigelse [31], [32]. Da GSH er et af de vigtigste intracellulære molekyler i forbindelse med beskyttelse mod oxidativ stress [33], blev niveauerne af intracellulær GSH evalueret i MA104-celler efter behandling med osmolytter. Til dette assay blev osmolytter tilsat i en gradvis måde, i løbet af 72 timer, og indholdet af GSH blev målt. I fig. 5 er vist, at behandling af celler med NaCl forårsagede en signifikant stigning (ca. 50%) i de intracellulære niveauer af reduceret GSH i MA104-celler. Urinstof alene ændrede ikke den intracellulære indhold af GSH, men vendt GSH stigning observeret i celler behandlet med NaCl. For at teste, om denne forhøjelse i GSH-indholdet kan være relateret til celleoverlevelse, vi anvendte BSO, en inhibitor af glutathion-syntase, hvilket ville forringe dette elevation i GSH-niveauer. Cellerne blev præinkuberet med BSO før behandlinger med NaCl eller urinstof. Som forventet, inhibering af GSH-syntese ved BSO reduceret med 50% overlevelse af celler behandlet med NaCl, men ændrede ikke den for celler behandlet med urinstof eller urinstof + NaCl (fig. 6), hvilket antyder, at celledød i nærvær af urinstof + NaCl sker ved en anden måde end den, med NaCl alene og er ikke afhængig af GSH.

Celler blev inkuberet som indikeret i figur 4, og de intracellulære niveauer af GSH blev målt som beskrevet i materiale og metoder. Resultater udtrykkes som gennemsnit ± SE (n = 8); p 0,05 (a – forskellig fra både kontrol- og urinstof)

Efter en indledende inkubation på 24 timer ved 37 ° C, BSO (1 mM) blev tilsat til dyrkningsmedium og efter den 24. time. inkubation osmolytter blev sat til kulturen, og cellerne blev inkuberet i yderligere 48 timer. Resultater udtrykkes som gennemsnit ± SE (n = 3); p 0,05. (A – forskellig fra NaCl).

Angivelse af ABCC1 i MA104 celler behandlet med osmolytter

Da en bibeholdelse af intracellulære GSH-niveauer er tæt forbundet med ABCC1 transport [34], [ ,,,0],35], og i betragtning af at MA104 og samlerørene celler udtrykker ABCC1 [14], [22], i de næste eksperimenter vi forsøgte at studere en mulig rolle ABCC1 i svaret fra MA104 celler til NaCl og urea. Men ved udførelse flowcytometri, observerede vi, at NaCl sker forandringer i celle granularitet (set ved ændringer i side scattering-SSC), med ingen ændringer i cellevolumen (set ved ændringer i fremadrettet spredning-FSC) som kan ses i fig . 7A. Derfor vi først studeret sådanne ændringer. For at gøre dette, blev cellerne adskilt i to regioner: region R1, der indeholder celler med normal SSC og region R2 indeholder celler med høj SSC (figur 8A.)

Cellerne blev inkuberet i 96 timer ved 37. ° C med osmolytter. A – dot plots viser forskellen mellem fremad spredning (FSC) og side spredning (SSC), som repræsenterer henholdsvis celle volumen og granularitet. B – Procentdel af celler, der udviser normal granularitet for hver behandlingsgruppe. Resultater udtrykkes som gennemsnit ± SE (n = 4); (A – forskellig fra kontrol; p 0,001 og b- forskellig fra NaCl; p 0,01).

Celler blev inkuberet med de osmolytter i 96 timer ved 37 ° C. Cellerne blev derefter mærket med anti-ABCC1 antistof og ekspressionen af ​​dette protein blev analyseret ved flowcytometri. Hver behandlingsgruppe var opdelt i to undergrupper ifølge SSC værdier. A – Histogrammer der viser de to subpopulationer (normal og høj SSC) for hver tilstand og B – procentdel af ABCC1-positive celler fra både normale og høje SSC subpopulationer. Resultater udtrykkes som gennemsnit ± SE (n = 5). a – forskellig fra kontrol (p 0,01) og B-forskellig fra NaCl; p. 0,01)

I fig. 7B er vist, at 90% af kontrolcellerne have normal SSC og at behandling i 72 timer med urinstof alene ikke ændrede celle granularitet. Men NaCl stærkt forøget denne parameter, med næsten halvdelen af ​​befolkningen har større SSC. Desuden urinstof vendt denne ændring, da 76% af cellerne forelagt NaCl + urinstof var i området med normal SSC og dette var ikke statistisk forskellig fra kontrol celler. Selv om denne stigning i celle granularitet kan skyldes en reduceret volumen celle, på grund af slip af celle vandindhold, kunne vi ikke iagttage dette. FSC af celler indgivet til alle behandlinger var svarende til den i kontrolceller, hvilket antyder ingen ændring i celle volumen efter langvarig behandling med NaCl, urinstof eller NaCl + Urea (fig. 7A).

I lyset af den observerede virkninger af NaCl behandling i SSC, til undersøgelse af ABCC1 ekspression og aktivitet vi adskilt cellerne i to regioner, hvoraf den ene relateret til celler med normal SSC og andre relaterede til celler med høj SSC. Resultaterne er afbildet i fig. 8 viste, at for celler med normal SSC, ca. 85% af kontrolcellerne udtrykker ABCC1. Denne procentsats er reduceret til ca. 50% i celler behandlet med NaCl, og urinstof ikke vende denne. For celler med høj SSC, procentdelen af ​​celler, der udtrykker ABCC1 er omkring 50% i kontrolceller. NaCl steg dette til ca. 92%, og urinstof ændret denne, returnere værdier tæt på kontrolcellerne (54%).

Det næste trin var at undersøge ABCC1 aktivitet ved flowcytometri. Når du gør dette, observerede vi, at kontrol celler ophobes meget mere CF (et fælles brugt substrat for ABCC1) end celler behandlet med osmolytter, sandsynligvis fordi hyperosmolalitet af medier med NaCl, urea og NaCl + urinstof hindrede den cellulære optagelse af farvestoffer ( fig. 9). Selvom dette Hæmmede sammenligningen af ​​osmolyt-behandlede celler med kontrolceller, kunne vi stadig sammenligne celler med normal eller høj SSC inde i samme behandling. Derfor, i fig. 10 er vist akkumuleringen og udstrømningen af ​​NaCl behandlede celler med normal (Fig. 10A og 10B) og høj (fig. 10C og 10D) SSC. Det kan ses, at den cellulære optagelse af CFDA var ens uanset normal eller høj SSC (fig. 10A og 10C). Men udstrømningen af ​​det fluorescerende farvestof ved celler med høj SSC var næsten fuldstændig (fig. 10D), mens der i celler med normal SSC ca. 50% af cellerne ikke udstrømning farvestoffet (fig. 10B). På den anden side, celler behandlet med NaCl + urinstof var lige kunne udstrømning farvestoffet, uanset normal eller høj SSC (fig. 11b og 11d).

Samlet population af celler blev inkuberet i 96 timer ved 37 ° C med osmolytter og den cellulære fluorescens, hvilket viser akkumuleringen af ​​CF efter 30 minutters inkubation blev målt som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. Panel A viser akkumuleringen af ​​CF i kontrolceller, som det fremgår af den høje fluorescens. Paneler B, C og D viser akkumuleringen af ​​CF i celler behandlet med henholdsvis NaCl, urinstof eller NaCl + urinstof. Histogrammer repræsenterer 3 forskellige eksperimenter.

Celler blev inkuberet med NaCl i 96 timer ved 37 ° C, og aktiviteten af ​​ABCC1 blev målt som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. Ved analyse blev cellerne delt i to undergrupper, afhængigt side scatter værdier. Venstre paneler: CF akkumulering af celler med normal (A) og høj (C) SSC; Højre paneler: CF efflux af celler med normal (B) og høj (D) SSC. Histogrammer repræsenterer 3 forskellige eksperimenter. Værdierne i hvert panel refererer til procentdelen af ​​celler med fluorescens, hvilket betyder celler, der ophobes CF (i panel A og C) og celler, der ikke var i stand til udstrømning farvestoffet efter 30 min i farvestof-frit medium (i paneler B og D).

Celler blev inkuberet med NaCl + urinstof i 96 timer ved 37 ° C, og aktiviteten af ​​ABCC1 blev målt som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. Ved analyse blev cellerne delt i to undergrupper, afhængigt side scatter værdier. Venstre paneler: CF akkumulering af celler med normal (A) og høj (C) SSC; Højre paneler: CF efflux af celler med normal (B) og høj (D) SSC. Histogrammer repræsentant for 3 forskellige eksperimenter.

Diskussion

MA104 er en cellelinie afledt fra nyre afrikanske abe embryoner [36]. Det udtrykker flere karakteristika af polariserede epitelceller, såsom dannelsen af ​​”kupler”, etablering af en transmonolayer elektrisk modstand og polariseret modning af kappevirus [37]. Vi har tidligere vist, at denne cellelinie udtrykker mindst to proteiner relateret til multilægemiddelresistens, ABCB1 og ABCC1 [28], [29], [38]. I den foreliggende undersøgelse har vi yderligere karakteriseret disse celler, og det forekommer meget sandsynligt, at MA104 stammer fra opsamlingskanal, sandsynligvis vigtigste celler. En sådan karakteristik er vigtigt at etablere denne cellelinie som en model for undersøgelse af ABCC1 i nyrerne.

Når karakteriseret viste vi stigningen i osmolalitet på grund af NaCl eller cholinchlorid (men ikke urinstof) forårsagede et fald i cellevækst. Endvidere urea beskyttede celler fra vækstinhibition eller celledød induceret af NaCl men ikke cholinchlorid (fig. 3-4). Disse resultater er i overensstemmelse med andre forfattere, som viste, at urinstof kunne vende den skadelige virkning tilskrives NaCl [30]. Det har også vist sig, at selv om urinstof kan inducere oxidativ skade, er det også i stand til at aktivere beskyttelsesmekanismer mod sådanne oxidative skader, og at NaCl også aktiverede beskyttelsesmekanismer, men kun når det blev gradvist tilsat til mediet [39], [ ,,,0],40]. Men de mekanismer, hvormed disse virkninger opstår stadig ikke forstået. Den nøjagtige proces, hvorigennem NaCl forårsager reduktion i cellelevedygtighed er endnu ukendt. Nogle forfattere synes at være enige, at høje NaCl-koncentrationer forårsage cellecyklusstop. Både Michea og Kultz hævder, at mIMCD lide cellecyklusstop i G2 efter inkubation med høj natrium klorid koncentrationer, hvilket fører til nedsat proliferation [41], [42]. Dimitrieva tilføjer til dette krav, hvilket viser, at p53-niveauer stiger hurtigt i mIMCD3 celler efter inkubering med natriumchlorid, reducere celleproliferation i første øjeblik [43]. En senere undersøgelse tyder igen at NaCl inducerer en reduktion i spredning, nu på grund af en stigning i EGR-1-ekspression, der ville tjene som et incitament til differentiering [44]. Kultz [45] hævder endvidere, at NaCl i høje koncentrationer fører til dobbelt streng pauser i DNA, som kunne være forårsaget af frie radikaler. Endvidere Zhou og Zhang enige om, at høj NaCl forårsager en stigning i ROS og følgelig oxidative skader [46], [47]. Som det er nu, beviser synes at pege, at reduktionen af ​​levedygtighed tendens til at pege i retning af oxidativt stress som udgangspunkt.

Den beskyttelse, der tilbydes af urea er så kontroversielt, som det er NaCl induceret skade. En undersøgelse tyder på, at urinstof selv fører til at stige i ROS, men også er i stand til at inducere ekspressionen af ​​hæm oxygenase-1 (HO-1) i nyreceller, som kan omfatte en del af det adaptive eller sikringssystem til hyperosmolaritet [40]. Zhang et al, viser, at tilsætning af urinstof til NaCl behandlede celler fører til inhibering af caspase-3-aktivitet [30]. Viste også Santos, at indre medulla nyre celler behandlet med både NaCl og urinstof viste en stigning i HSP70 der korrelerer til stigningen i osmolaritet. Forfatterne peger på, at en sådan konklusion, der er forbundet med spredning reduktion set i de behandlede celler kunne være en del af den beskyttelse mekanisme, der gør det muligt for celler til at overleve i nyrerne medulla [48]. Tilsammen data antyder, at mens NaCl (og i nogle modeller, urea) fører til stigning i ROS og deraf følgende DNA-skader, en samtidig behandling med urea fører til aktivering af reaktionsmekanismer som chaperone udtryk, der fører til DNA-beskyttelse. vores resultater viste imidlertid, at beskyttelsen af ​​urinstof er mod skader induceret hovedsageligt af Na

+ ion og ikke nødvendigvis NaCl. Dette antyder, at der er behov for nye undersøgelser for at forstå både den dødelige effekt af NaCl og urea og samspillet mellem disse to komponenter i renal medulla.

Da GSH er den vigtigste ikke-enzymatisk antioxidant molekyle, vi studerede de intracellulære GSH-indholdet af celler behandlet med NaCl og /eller urinstof. Det blev observeret, NaCl, men ikke urinstof, øgede intracellulære GSH-indholdet og at urinstof vendt stigningen i GSH-indholdet i NaCl-behandlede celler (fig. 5). Stigningen i GSH-indholdet i NaCl-behandlede celler kan skyldes inhibering af ABCC1 aktivitet eller ekspression, men kunne også skyldes en stigning i oxidativ stress. Desuden BSO reduceret med 50% overlevelse af celler behandlet med NaCl, men ændrede ikke overlevelsen af ​​celler behandlet med urinstof eller urinstof + NaCl (fig. 6).