PLoS ONE: Exosomal miRNA fra bughinde skyllevæske som potentielle Prognostiske biomarkører for peritoneal Metastase i Gastric Cancer

Abstrakt

Peritoneal metastaser er den hyppigste form for tilbagefald hos patienter med gastrisk cancer (GC) og er forbundet med dårlig prognose. Peritoneal udskylning cytologi, der anvendes til at vurdere risikoen for peritoneal metastase, har lav følsomhed. Her vurderede vi den diagnostiske potentiale exosomal miRNA-profiler i peritonealvæske til forudsigelse af peritoneal udbredelse i GC. Totalt RNA blev ekstraheret fra exosomer isoleret fra seks gastriske malign ascites (MA) prøver, 24 peritoneal lavage fluid (PLF) prøver, og kultursupernatanter (CM) af to humane gastriske carcinoma cellelinier, der afviger i deres potentiale til peritoneal metastase. Ekspression af exosomal miRNA blev evalueret med Agilent Humant miRNA microarrays og kvantitativ revers transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR). Mikroarrayet analyse indikerede en lav variabilitet i antallet og signalintensitet af miRNA påvist blandt prøverne. I de seks MA væsker, MIR-21 viste den højeste signalintensitet. Vi identificerede fem miRNA (miR-1225-5p, miR-320C, miR-1202, miR-1207-5p, og miR-4270) med høj ekspression i MA prøver, at PLF af serosa-invasiv GC, og CM af en meget metastatisk GC-cellelinie; disse kandidat miRNA arter synes at være relateret til peritoneal formidling. Differentiel udtryk for miR-21, miR-320C, og miR-1225-5p blev valideret i PLF af serosa-invasiv og ikke-invasiv GC ved QRT-PCR og miR-21 og miR-1225-5p blev bekræftet at være forbundet med serøse invasion i GC. PLF kan anvendes til at profilere ekspressionen af ​​exosomal miRNA. Vores resultater tyder på, at miR-21 og miR-1225-5p kan tjene som biomarkører for peritoneal tilbagefald efter helbredende GC resektion, hvilket giver en ny tilgang til tidlig diagnosticering af peritoneal formidling af GC

Henvisning:. Tokuhisa M, Ichikawa Y, Kosaka N, Ochiya T, Yashiro M, Hirakawa K, et al. (2015) Exosomal miRNA fra bughinde skyllevæske som potentielle Prognostiske biomarkører for peritoneal Metastase i Gastric Cancer. PLoS ONE 10 (7): e0130472. doi: 10,1371 /journal.pone.0130472

Redaktør: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, UNITED STATES

Modtaget: 1. februar, 2015; Accepteret: 20 maj 2015; Udgivet: Juli 24, 2015

Copyright: © 2015 Tokuhisa et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er små (19-23 nukleotider) ikke-kodende RNA, der fungerer som post-transkriptionelle regulatorer af genekspression og spiller vigtige roller i reguleringen af ​​mange biologiske processer, herunder celledifferentiering, proliferation og apoptose [1]. MiRNA er blevet vist at have onkogen eller tumor-undertrykkende aktivitet, og dereguleret ekspression af mange miRNA arter er blevet påvist i flere kræftformer, hvilket tyder potentielle anvendelse af miRNA som biomarkører for cancer progression og metastase [2-5].

miRNA er pakket ind i sekretoriske mikrovesikler (f.eks exosomer, apoptotiske legemer og kaste mikrovesikler), som skjold miRNA fra nedbrydning af RNAse og tjene som køretøjer til miRNA-sekretion i ekstracellulære rum og kropsvæsker. Exosomer er små membranøse vesikler, der er blevet impliceret i cellulære immunreaktioner; Men for nylig er det blevet klart, at exosomer indeholder betydelige mængder af RNA og kan være involveret i immun-uafhængig reguleringsmekanismer. Det er nu blevet konstateret, at exosomer kan udføre intercellulære overførsel af miRNA, deltager således i miRNA-baserede signaleringsmekanismer [6]. er også blevet opdaget Højere niveauer af miRNA-holdige exosomer i plasmaet af kræftpatienter end for raske personer [7], tyder på, at exosomet-baserede miRNA sekretion er involveret i udviklingen af ​​kræft. Analyse af afvigende miRNA udtryk i serum, spyt, fæces og urin har været ansat for tidlig påvisning af B-celle lymfom, og mundtlige, tarm og blære kræftformer [8-11].

mavekræft (GC) er den næsthyppigste årsag til kræft dødsfald på verdensplan [12]. Bughinden er den hyppigste sted for metastase og tilbagefald af GC, og malign ascites (MA), forårsaget af peritoneal udbredelse af cancerceller, har været forbundet med dårlig prognose. I øjeblikket er der ingen pålidelige prædiktorer for udvikling af maligne peritoneale ascites i GC patienter. MiRNA-holdige exosomer repræsenterer en hidtil ukendt mekanisme af intercellulær signalering og kan give indsigt i miljøet, der tillader udbredelse cancer i peritoneum [13].

I denne undersøgelse blev exosomer isoleret fra MA og intraoperativ peritoneal lavage fluid (PLF) prøver opnået fra GC patienter og dyrkningsmediet (CM) af stærkt invasive peritoneale cellelinjer og miRNA blev derefter ekstraheret fra disse prøver. Kvaliteten af ​​de udtrukne exosomal miRNA og konsistensen af ​​miRNA udtryk mønstre blev kontrolleret. MiRNA udtryk profiler i MA, PLF, og CM prøver blev sammenlignet og kandidatlandene miRNA relateret til peritoneal formidling af GC blev identificeret.

Materialer og metoder

Patienter

Alle patienter eller deres værger forudsat skriftlig informeret samtykke. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Yokohama City University Hospital (Godkendelse nr A110127001).

MA og intraoperative PLF prøver blev indsamlet fra GC patienter med de klinisk-patologiske karakteristika præsenteret i tabel 1. Alle patienter havde tidligere været diagnosticeret med GC ved histopatologisk analyse af biopsiprøver taget fra de primære læsioner og seks MA patienter var blevet diagnosticeret for tilstedeværelse af ascites ved abdominal computertomografi (CT) scanning. Ascites blev også analyseret ved cytologi og alle blev bekræftet som positive for malignitet af patologer; de resterende MA prøver blev anvendt til miRNA isolation. PLF blev intraoperativt indsamlet fra 24 GC patienter (tabel 1). Efter laparotomi, blev 100 ml normalt saltvand hældt i posen ifølge Douglas og peritoneal lavage vand blev opsamlet før kirurgisk resektion af tumoren. PLF blev analyseret ved cytologi og anvendt til miRNA isolation. Blandt de 24 PLF prøver, seks blev analyseret ved hjælp af miRNA microarray og 18 blev analyseret ved qPCR

godt differentieret adenocarcinom (godt).; moderat differentieret adenocarcinom (mod); dårligt differentieret adenocarcinom (dårlig). Malign ascites (MA); Peritoneal lavage fluid (PLF); TMN etape (UICC 7. udgave); Stede (P) Fraværende (A); Peritoneal lavage cytologi (CY);

Cell kultur

OCUM-2M cellelinje blev etableret fra en primær tumor af scirrhous gastrisk karcinom og OCUM-2MD3 cellelinje blev afledt fra OCUM-2M celler med et stort potentiale for peritoneal udbredelse i nøgne mus [14]. Cellerne blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Life Technologies, Grand Island, NY) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika-antimykotika ved 37 ° C i en CO 5%

2 inkubator. Til opnåelse celle CM blev OCUM-2M og OCUM-2MD3 cellerne vasket tre gange med serumfrit DMEM suppleret med antibiotika-antimycotisk og inkuberet i det samme medium i 48 timer.

Isolering af exosomer

prøver til exosom isolation blev fremstillet som tidligere [15] beskrevne. At fjerne store celle partikler og cellerester, MA, PLF, og CM blev centrifugeret ved 2.000 x

g

i 15 minutter ved 4 ° C og filtreret gennem et 0,22 um filter (Millipore, Billerica, MA). Supernatanten blev opbevaret ved -80 ° C, indtil de skal miRNA udvinding.

For at fælde exosomer blev prøver centrifugeres ved 110.000 ×

g

i 70 minutter ved 4 ° C. Exosomet pellet blev vasket med 11 ml phosphatpufret saltvand (PBS) og centrifugeret igen som beskrevet. Pelleten blev anvendt til RNA-ekstraktion.

Total RNA-ekstraktion og analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra exosomer under anvendelse af et miRNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner og blev derefter opbevaret ved -80 ° C, indtil der yderligere analyse.

kvalitet, koncentration og størrelse af samlet exosomal RNA blev vurderet ved anvendelse af en Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Foster City, CA). Forud for analyse blev totalt RNA fremstillet under anvendelse af en Agilent RNA 6000 Pico kit (Agilent Technologies) ifølge fabrikantens protokol.

miRNA microarray

miRNA ekstraheret fra seks MA, seks PLF, og to CM prøver blev analyseret under anvendelse Agilent Humant miRNA Microarrays (Agilent Technologies), der indeholder 1.226 humane miRNA og 146 humane virale miRNA. For miRNA detektion blev 100 ng RNA mærket og hybridiseret under anvendelse af human miRNA Microarray kit (rel 16,0; Agilent Technologies) ifølge fabrikantens protokol (miRNA fuldstændig mærkning og Hyb kit til miRNA Microarray System). Hybridiseringssignaler blev påvist med en mikromatrice Scanner G2505C (Agilent Technologies), og de scannede billeder blev analyseret ved hjælp af Agilent Feature Extraction Software (v. 10.7.3.1). Dataanalyse blev udført ved hjælp af Agilent GeneSpring GX-software v. 11.0.2. (Log

2 transformation). Baseline transformation blev ikke udført.

Kvaliteten af ​​miRNA ekstraktion blev analyseret i henhold til den variation i antallet af microarray-opdaget miRNA arter, signalerer intensitet, og korrelationen af ​​miRNA udtryk blandt prøver efter gennemsnit ± SD, variationskoefficient (CV), og korrelationskoefficienten (CC).

Valg af peritoneale metastase-specifikke miRNA

udtrykket profiler af exosomal miRNA blev analyseret for at vælge miRNA, der er specifikke for GC peritoneal formidling ved hjælp af følgende trinvis fremgangsmåde. Trin 1: miRNA profiler i CM af de meget metastatiske peritoneal OCUM-2MD3 celler blev sammenlignet med de af de parentale ikke-metastatisk OCUM-2M celler, og differentielt udtrykte miRNA (gennemsnitlig fold-ændring, 2) blev udvalgt

Trin 2: seks PLF prøver blev klassificeret i to grupper: T4 (n = 4) og T1-T3 (n = 2), i henhold til kræft fase af tumor størrelse og udvidelse (UICC-AJCC, 7

th udgave). Stage T4 GC er kendetegnet ved den højeste frekvens af peritoneale metastaser i sammenligning med andre faser [16]. De miRNA udtryk profiler T4 gruppe blev sammenlignet med de af T1-T3 gruppe og differentielt udtrykte miRNA (gennemsnitlig fold-ændring, 2) blev udvalgt

Trin 3:. De udvalgte miRNA, der var fælles for begge trin og der blev udtrykt i MA blev yderligere filtreres efter signalintensitet. Dem med intensitetsværdier for mere end log

2 10 i MA og PLF blev udvalgt som mulige miRNA relateret til peritoneale metastaser; MIR-21 viste den højeste gennemsnitlige signalintensitet blandt MA prøver. Den differentielle udtryk for miRNA arter valgt i trin 3 blev valideret i de resterende 18 PLF prøver ved QRT-PCR.

Kvantitativ analyse af peritoneal metastase-specifikke miRNA-ekspression ved QRT-PCR

TaqMan microRNA analyser (Life Technologies) blev anvendt til at kvantificere de relative ekspressionsniveauer af miR-21 (assay-ID. 000.397), miR-320C (assay-ID. 241053_mat), miR-1225-5p (assay-ID. 002.764), og miR-16 (assay-id. 000.391). Revers transkription blev udført under anvendelse af TaqMan miRNA RT Kit (Life Technologies) under følgende betingelser: 30 minutter ved 16 ° C, 30 min ved 42 ° C, og 5 minutter ved 85 ° C. PCR blev udført i plader med 96 brønde under anvendelse af 7500 Real Time PCR systemet (Life Technologies); Alle reaktioner blev udført tre gange. Ekspressionsniveauerne af target miRNA blev normaliseret med den for MIR-16, der blev anvendt som et stabilt udtrykt kontrol [17]. Når du analyserer vores microarray data exosomal miRNA i maligne ascites prøver, miR-16 præsenterede laveste variationskoefficient (CV = 4%) blandt kandidatlandene interne standarder, herunder miR-638 (CV = 8%), lad-7a (CV = 8%), og 142-3p (CV = 23%).

Statistisk analyse

kontinuerlige variabler blev sammenlignet ved anvendelse Students

t

-test. Når det er nødvendigt,

t

-test blev modificeret til at sammenligne ulige varianser. Forskellen mellem kategoriske variable blev evalueret under anvendelse af Fishers eksakte test. Sammenhæng mellem to variable blev evalueret under anvendelse Pearson korrelationskoefficienten. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikante ved P 0,05. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 21,0 software til Windows (IBM, Armonk, NY).

Resultater

Kvantitativ analyse af ekstraheret exosomal RNA

Total RNA blev ekstraheret fra exosomer isolerede fra MA, intraoperativ PLF, og celle CM. Den mediane koncentration af det ekstraherede exosomal RNA var 4,4 ng /uL (lige 1,2-6,1 ng /uL) for MA og 6,4 ng /uL (1,7-16,4 ng /pi) for PLF. Elektroferogrammer afslørede en stor andel af små RNA-arter, der findes i alle CM og kliniske prøver, mens ingen eller meget lidt kontaminering med 18S og 28S ribosomalt RNA (ingen distinkte toppe ved den tilsvarende molekylvægt) blev observeret (Fig 1).

variation og fællestrækkene mellem prøverne blev undersøgt. Evaluering af samlet exosomal anvendte RNA en Bioanalyzer 2100. Elektroferogrammerne viser fordelingen størrelse (nucleotider, nt) og fluorescensintensitet (FU) af de samlede exosomal RNA isoleret fra CM, MA, og PLF. Den laveste spike (ca. 25 nt) i hver prøve er markør af Agilent RNA 6000 Pico kit.

Ydelse af miRNA microarrays

For at teste udtryk for exosomal miRNA microarrays i hver gruppe af prøver, vi undersøgte antallet af registrerede miRNA, percentil af signal intensitet, antallet af almindeligt tilfangetagne miRNA, og korrelationen af ​​miRNA udtryk blandt grupperne. Antallet af miRNA arter i hver gruppe ved mikroarray er vist i fig 2. I de seks MA og seks PLF prøver, disse betyder tal var 490,1 (SD = 42,3; CV = 8,6%) og 367,5 (SD = 13,4; CV = 3,6%), henholdsvis. I hver gruppe, variabiliteten i antallet af fundne miRNA blandt prøver var lav

Signal intensitet fordeling for hver gruppe er præsenteret i figur 3.; dette viser de behandlede signaler normaliseret til 25, 50, 75, og 90

percentil i hver gruppe. I 50

percentil, log

2 relative signalintensiteter for MA (Fig 3-1) og PLF (fig 3 og 2) prøver og blandt tre grupper (MA, PLF, og CM, fig 3 og 4) var 5,53 ± 0,19 (CV = 3,49%), 6,14 ± 0,24 (CV = 3,87%), og 4,97 ± SD (CV = 5,24%), henholdsvis. Variabiliteten af ​​signal intensitet blandt prøverne i hver gruppe samt blandt grupperne var lav.

Antallet af miRNA fælles blandt prøverne i MA, PLF og CM grupper blev 327, 263, og 354, henholdsvis, mens dette var 194 for de tre grupper (figur 4).

tabel 2 viser korrelationen af ​​miRNA udtryk mellem hver to prøver. De højeste og den laveste CC værdier var 0,94 og 0,68, henholdsvis; den gennemsnitlige CC af samtlige prøver var 0,79 (CV = 8,86%). I MA, PLF, og CM-grupper, de gennemsnitlige CC værdier var 0,85, 0,88, og 0,90, henholdsvis og variation i udtrykket profiler for hver gruppe blev lav.

Valg af kandidat miRNA relaterede til peritoneal formidling

til dato har ingen data været tilgængelig på udtrykket profiler af exosomal miRNA forbundet med peritoneal udbredelse, på grund af manglende adgang til normale ascitesvæsker mod at sammenligne MA udtryk profiler. Vi valgte miRNA relateret til peritoneal udbredelse ved hjælp af en trinvis tilgang. Antallet af miRNA almindeligt fanget i de seks MA prøverne var 327. I trin 1 og 2, 140 og 118 metastase-specifikke miRNA blev udvalgt i CM og PLF grupper, hhv. Ud fra disse 327, 140 og 118 miRNA blev fem miRNA udvalgt som kandidater relateret til peritoneal formidling (fig 5). To af dem (MIR-1225-5p og MIR-320C) og MIR-21 med den højeste signalintensitet blandt MA-specifikke miRNA blev valideret som værende differentielt udtrykt i 18 PLF prøver under anvendelse qPCR (tabel 3).

Skematisk fremstilling af den trinvise tilgang til screening miRNA relateret til peritoneal formidling. Trin 1: udvælgelse af miRNA differentielt udtrykte (fold-ændring, 2) i dyrkningsmedium (CM) af det stærkt metastatisk peritoneal cellelinie OCUM-2MD3 (OCUM-2M parentale cellelinje blev anvendt som kontrol). Trin 2: seks peritoneal lavage fluid (PLF) prøver blev opdelt i T4 (n = 4) og T1-T3 grupper efter gastrointestinal cancer stadiet; miRNA differentielt udtrykt (fold-ændring, 2) i T4-gruppen blev udvalgt. Trin 3: de udvalgte miRNA arter fælles for trin 1 og 2, og udtrykt i maligne ascites (MA) med signal intensitet log blev anset

2 10 i MA og PLF som kandidat miRNA relateret til peritoneale metastaser

malign ascites (MA).; Peritoneal lavage fluid (PLF); Betingelse medium (CM), T etape UICC 7

th udgave (T4, T1-3); OCUM-2M (2M); OCUM-2MD3 (D3).

Validering af kandidat miRNA udtryk ved qPCR

Atten PLF prøver blev inddelt i to grupper efter den metastatisk stadie, T4 (perforeret serosa, n = 9) og T1-T3 (subserosa eller mindre, n = 9), og ekspressionen af ​​mIR-21, mIR-320C, og mIR-1225-5p blev analyseret ved QRT-PCR. Figur 5 viser, at niveauerne af miR-21 og miR-1225-5p i T4-trins GC patienter markant blev øget i forhold til dem, der i T1-T3 patienter (MIR-21, P = 0,027, og miR-1225-5p, P = 0,008, fig 5). . Forskellen i miR-320C udtryk mellem to patientgrupper var ikke-signifikant (P = 0,928, Fig 6)

En stjerne angiver P 0.05.

Næste, vises sammenhængen mellem miRNA niveauer og klinisk baggrund af GC patienter blev undersøgt (tabel 4). MIR-21 og MIR-1225-5p ekspression var signifikant højere hos patienter med T4-stage cancer end hos patienter T1-T3-trins (P = 0,015). Ingen signifikant korrelation blev fundet mellem miRNA udtryk og andre kliniske parametre.

Diskussion

I denne undersøgelse undersøgte vi, for første gang, at miRNA indholdet af exosomer isoleret fra MA og PLF af GC patienter. Vores undersøgelse viser, at exosomal miRNA konsekvent kan udvindes fra MA og PLF og at miRNA udtryk profiler kan angive status for bughinden i GC patienter.

Prognosen for GC med serøse invasion forbliver fattige, selv efter R0 resektion, fordi af den høje sats for fornyet, især peritoneale metastaser (PM) [18]. PM i GC er den mest komplicerede form for tilbagefald, fordi det er vanskeligt at forudsige, samt at diagnosticere. Selvom ascites er den mest almindelige PM symptom, at mange GC patienter med PM ikke udvikle ascites. Blandt de billeddannende-baserede diagnostiske metoder, er high-speed spiral CT vid udstrækning anvendes til vurdering af præoperativ stadieinddeling af GC og post-terapeutisk opfølgning; Men i tilfælde af PM dets diagnostiske nøjagtighed er utilstrækkelig, mest på grund af lav følsomhed [19]. Brug af PET-CT for PM diagnose i GC er også kontroversielt, da det er blevet rapporteret, at FDG-PET har ringe følsomhed til påvisning af PM i GC [20]. PLF er blevet den næste mål til diagnosticering og prognosticering af PM i GC. Cytologisk undersøgelse af intraoperativt indsamlet PLF anvendes til forudsigelse af peritoneal tilbagefald [21] og anvendes til GC mellemstation i Japan [22]. Imidlertid har nogle forskere rapporteret, at PLF cytologi ikke udviser den følsomhed, der kræves til forudsigelse og detektion af PM [21], og har foreslået anvendelsen af ​​molekylære diagnostiske fremgangsmåder, såsom RT-PCR til påvisning af mikro-metastaser i PLF. I et multicenter prospektiv undersøgelse, mRNA-ekspression af generne kodende carcinoembryonisk antigen (CEA) og cytokeratin 20 (CK-20), vurderet ved RT-PCR, har vist sig at være nyttig til forudsigelse af den samlede overlevelse og PM i GC [23] . Men ulempen ved diagnostiske metoder mRNA-baserede er den høje nedbrydelighed af mRNA under kirurgiske procedurer.

I modsætning hertil miRNA omsluttet af exosomer forblive stabil og kan cirkulere i legemsvæsker, såsom serum, plasma , spyt, urin, modermælk, og tårer, i lange tidsperioder [24, 25]; exosomer er også blevet isoleret fra MA i ovariecancer [26].

Så vidt vi ved, har der ikke været nogen rapport om exosomal miRNA isoleret fra det PLF af GC patienter. Levänen et al. indsamlet exosomer fra bronkoalveolærvaskevæsken og analyseret exosomal miRNA udtryk for at detektere allergi-relaterede miRNA arter [27]. Liu et al. rapporterede, at exosomer isoleret fra cervicovaginal lavage fluid indeholdt høje niveauer af MIR-21, som kunne anvendes som biomarkør for livmoderhalskræft [28]. Her har vi analyseret udtrykket profiler af exosomal miRNA i PLF af GC patienter med miRNA microarray teknologi for at identificere kandidat diagnostiske miRNA-biomarkører til forudsigelse af metastaser i GC.

I vores undersøgelse, den første udfordring lå i den kvantitative isolering af exosomal miRNA fra PLF. Weber et al. evalueret miRNA-ekspression i 12 legemsvæsker og rapporterede, at den samlede koncentration RNA i peritonealvæske var 775 ug /L [25], som var mindre end den, vi opnået fra MA og PLF-4.400 og 6.400 ug /L Årsagen til forskellen kan være den metode, der anvendes til isolering af total RNA, fordi Weber et al. direkte ekstraheret RNA fra peritonealvæske, hvorimod vi først isoleret exosomer og derefter anvendes disse til RNA-ekstraktion. Analyse af kvaliteten af ​​RNA isoleret fra PLF demonstrerede en overflod af små ( 200 nt) RNA-arter i CM og MA. Der var ingen tydelige 18S og 28S ribosomale RNA toppe i forberedelsen, hvilket indikerer fraværet af forurening med intracellulær RNA.

Det andet problem er stødt på i den nuværende undersøgelse omfattede konsistens i kvaliteten af ​​de exosomal miRNA isoleret. I vores undersøgelse observerede vi lave variation i antallet af registrerede miRNA arter og miRNA signal intensitet, og en høj korrelation af miRNA udtryk blandt prøverne i hver gruppe. De gennemsnitlige antal påviselige miRNA i MA og PLF var 490 og 367, hvilket var i overensstemmelse med antallet af miRNA (397) tidligere påvist i peritoneal væske [25].

PLF og MA prøver viste lav variabilitet i signalintensitet (CV = 3,87% for 50

percentilen). Desuden blev miRNA ekspressionsmønstre højt korreleret mellem prøver inden for hver gruppe (CC 0.850), samt mellem grupper (0,8 CC 0,7). Disse resultater viste, at PLF kunne være en højt udbytte kilde til god kvalitet miRNA, som viser konsistente udtryk mønstre i microarray analyse.

miRNA udtryk profiler blev analyseret for at vælge miRNA specifikke for peritoneal metastaser. MIR-21 udviste højere ekspression i patienter med T4-trins carcinom end i de af T1-T3 gruppe. Fabbri et al. rapporterede, at MIR-21 og MIR-29a i cancer-frigivet exosomer påvirket tumorvækst og spredes ved binding til og aktivering TLR’er i de omkringliggende immunceller og inducere en prometastatic inflammatorisk respons [29]; dette understøttet den opfattelse, at tumorafledte exosomer bidrager til premetastatic mikromiljø [30, 31]. Dette kan indikere, at T4 karcinom-afledte exosomer skaber premetastatic niche i bughinden, som så understøtter peritoneal invasion efter kurativ resektion af GC.

Ved hjælp af en trinvis tilgang, valgte vi fem exosomal miRNA (miR-320C , miR-1202, miR-1225-5p, miR-1207-5p, og miR-7270) og valideret miR-320 og miR1225-5p udtryk i PLF af 18 CG patienter ved QRT-PCR. Mir-1225-5p viste højere udtryk i T4 end i T1-T3 fase CG patienter, hvilket bekræfter de resultater, der opnås ved microarray, mens der ikke var forskel i miR-320 niveauer mellem patientgrupper. Mir-1225 mål den polycystisk nyresygdom gen,

pKD1

, som ofte muteret i autosomal dominant polycystisk nyresygdom; således kan miR1225 påvirke progression af denne sygdom [31]. Forholdet mellem MIR-1225 til cancer stadig uklar. MIR-21 og miR-1225-5p kan udarbejde en premetastatic niche i bughinden til formidling og afregning af metastasering kræftceller og dermed kan indikere disposition for den peritoneale tilbagefald efter kurativ GC resektion.

PLF giver information om status i bughinden, såsom ændringer i populationen af ​​immunceller og sekretion af vækstfaktorer og cytokiner [32, 33]. Cytologi og molekylære diagnostiske analyser er baseret på påvisning af kræftceller, mens kan anvendes profilering af miRNA i PLF til forudsigelse af en peritoneal premetastatic fænotype i GC, sikre mere effektive forebyggende og helbredende foranstaltninger.