PLoS ONE: Variant Splejsning og udsættes for ioniserende stråling på menneskelige Endogen retrovirus K (HERV-K) Udskrifter i kræftceller

Abstrakte

Menneskelig endogene retrovirus K (HERV-K) er den mest intakte retrovirus i det humane genom. Der er flere i fuld længde eller i nærheden af ​​fuld længde HERV-K provira i det. At analysere, hvilke HERV-K provirus medfører virale transkripter i cancercellelinier og at teste om ioniserende stråling kan ændre niveauerne af HERV-K transkripter, RT-PCR undersøgelser blev foretaget under anvendelse af multiple humane cancercellelinier. Primere fra flere positioner i det virale genom, blev anvendt og omfattede par designet til at krydse splejsesamlinger i virale RNA’er. I mangel af ioniserende stråling, blev transskripter detekteret fra flere HERV-K provirus i cellelinier fra humane prostata, cervix, hoved og hals, eller brystkræft, og de provira hvorfra transkripter stammer varierede mellem de forskellige linier. Kun én ud af 13 testede (livmoderhalskræft linje C33A) cellelinjer ikke påvist HERV-K udskrifter. Splejset RNA detekteret inkluderet virale RNA splejset som forventet på de konventionelle virale splejsningssteder, plus flere alternativt splejsede RNA. Alternativt splejsede transkripter opstået specifikke provirus, og blev påvist i de fleste af de anvendte cellelinier. Kvantitativ RT-PCR blev udført for at vurdere virkningerne af ioniserende stråling. Disse analyser viste, at HERV-K udskrifter var forhøjet i fire af tolv linjer testet, specifikt anvendes alle tre prostatakræft linjer og en brystkræft linje. Stigningerne var forbigående og toppede på 24 timer efter en enkelt dosis gamma-bestråling, der varierede fra 2,5 til 20 Gy, og vender tilbage til baseline niveau 72 timer. Sammenfattende viste disse undersøgelser, at ioniserende stråling kan påvirke niveauerne af HERV-K udskrifter i celler, og disse effekter varierer mellem forskellige celler. Ændringerne i HERV-K transkriptniveauer kan påvirke flere biologiske processer i celler og fremtidige undersøgelser af virkningerne af ioniserende stråling på HERV-K er værd at forfølge

Henvisning:. Agoni L, Lenz J, Guha C ( 2013) Variant splejsning og udsættes for ioniserende stråling på menneskelige Endogen retrovirus K (HERV-K) Udskrifter i kræftceller. PLoS ONE 8 (10): e76472. doi: 10,1371 /journal.pone.0076472

Redaktør: Robert Belshaw, Plymouth University, England

Modtaget: Juli 3, 2013; Accepteret: August 27, 2013; Udgivet: 18 okt 2013

Copyright: © 2013 Agoni et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af NIBIB en R01 EB009040 (til CG). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

virkningerne af ioniserende stråling (IR) på endogene retrovirus (ERVs) er stort set ukendt. DNA genomer af ERVs integreres i genomet af deres værtsart som følge af infektioner i kimcellelinje-celler frem evolutionær tid. Til dato har virkningerne af ioniserende stråling på ERVs blevet udforsket kun i mus [1], hvor det har været kendt i årtier, at ioniserende stråling kan genaktivere mus endogene retrovirus (MERVs) [2] – [4]. Ioniserende stråling påvirker også immunreaktioner på cancerceller, og en undersøgelse påvist CD8 + T-celler, der er reaktive mod et Merv antigen i en murin, bestrålet coloncarcinom model [5]. Det er således sandsynligt, at virkningerne af ioniserende stråling på endogen retrovirus-ekspression kunne have konsekvenser for immunreaktioner mod tumorceller.

Ioniserende stråling er blevet rapporteret at øge den transkriptionelle aktivitet af mange vira, herunder CMV [6], [7 ], HPV [8] og HIV [9], [10] i inficerede celler. De molekylære mekanismer er stadig stort set ukarakteriserede, selv for HIV, er IR blevet rapporteret at øge transkription gennem LTR-promotor aktivering [9], [10]. På det kliniske niveau, har undersøgelser vist en uventet høj reaktivering på latent HBV-infektion i hepatocellulært carcinom efter strålebehandling [11]. I HPV-inficerede celler, har forøget produktion af E6 /E7-transkripter og proteiner blevet vist efter y-bestråling [8]. På et klinisk niveau, er der fundet forhøjede specifikke cytotoksiske lymfocytter (CTL) respons mod HPV E6 /E7-antigener i livmoderhalskræft kræftpatienter efter strålebehandling [12]. Ud over virkningerne på niveauerne af virus-ekspression, er ioniserende stråling vides at modulere immunresponser mod kræft [13] – [15]

Endogene retrovirus er til stede i genomet af hver celle i et individ og kan være. mål for immunresponser såsom dem mod MERVs [16]. Både T- og B-lymfocytresponser er også blevet observeret mod humane endogene retrovira (HERVs) [17] – [21]. Mest bemærkelsesværdigt er immunreaktioner blevet observeret mod den senest erhvervede sæt retrovirus i det menneskelige genom, HERV-K [18], [19], [22], [23]. HERVs findes i det humane genom i form af integrerede retrovirale DNA-genomer kaldet provirus. Kollektivt de er blevet anslået til at omfatte ca. 8% af det humane genom [24]. I fravær af selektionstryk på værten til at opretholde disse provirus i en intakt form, mutationer uundgåeligt akkumuleres i dem over evolutionær tid derved forstyrre virale genomiske komponenter og inaktivere viral infektivitet. Den HML2 undertype af HERV-K er den eneste retrovirus at har indtastet genom af den menneskelige slægt, da divergensen af ​​de menneskelige og chimpanse slægter opstod omkring 6 millioner år siden [25] – [31]. Fordi det er den senest indsatte, HERV-K HML2 udgør den mest intakte sæt af retrovira i det humane genom [25], [32] – [39]. Trods det, er ingen individuel HERV-K provirale locus kendt, at er fuldt funktionel og i stand til at producere infektiøse viruspartikler, selvom rekombination blandt loci eksisterende i dag i det humane genom kunne genoprette viral infektivitet [37]. Mange af de HERV-K provira er tilstrækkeligt intakt til koder for proteiner, der kan opretholde nogle funktioner [25], [35], [36], [38], [39], og ekspressionen af ​​disse proteiner er blevet foreslået at korrelere med sygdomme herunder kræft [40] -. [44]

HERV-K er transskriberet i forskelligt omfang i flere humane sygdomme, herunder kræft [20], [45] – [48], HIV-infektion [18], [49 ] – [51] og autoimmune sygdomme [52], [53]. Individuel HERV-K loci i det humane genom er forskellige med integriteten af ​​specifikke åbne læserammer, funktionalitet af de kodede proteiner, integriteten af ​​cis-virkende elementer, og muligvis i egenskab af DNA-sekvenser, der flankerer det virale DNA til at påvirke transkription. De varierer fra ca. 97 til over 99% identisk i parvise sammenligninger med hinanden, og mange af forskellene mellem dem er enlige baseparændringer. Derfor at identificere det specifikke HERV-K loci udtrykt i en human prøve, og til at forstå grundigt biologiske rolle HERV-K i humane sygdomme, hvis nogen, er det nødvendigt at medtage analyse af virale transkripter i den enkelt-nukleotid niveau i ethvert undersøgelse af dem [54]. Vi har tidligere påvist HERV-K-transkripter i prostatacancercellelinjer og observeret, at nogle af transkripter blev splejset på usædvanlige positioner i det virale genom [55]. Påvisningen af ​​variant splejsning af HERV-K-transkripter i prostatakræft linjer var uventet. I denne rapport blev det nukleotid analyse af specifikke HERV-K loci, der er transskriberet og muligheden for usædvanlige splejsningsvarianter udvides til andre typer af kræft cellelinjer. Vi testede også hypotesen om, at ioniserende stråling kan ændre niveauerne af menneskelige endogene retrovirus K udskrifter. HERV-K-proteiner er kendt for at være mål for både T- og B-lymfocytresponser [17] – [21], [46]. Som et første skridt i retning af afgøre, om HERV-K-antigener kan være genstand for bestråling-induceret modulation og måske udgøre kandidat mål for anti-tumor, T-celle baseret immunterapi til kræft efter administration af ioniserende stråling, vi undersøgte, om ioniserende stråling påvirker niveauerne af HERV-K udskrifter i forskellige cancer cellelinjer.

Resultater

HERV-K transskription i kræftceller

HERV-K transskription er blevet rapporteret at forekomme i human cancer . Imidlertid har reaktionen af ​​HERV-K for ioniserende stråling aldrig blevet testet i cancer eller normale celler. For at verificere HERV-K transskription og etablere en reference baseline for eksperimenter med IR, vi uropført revers transkriptase-PCR (RT-PCR) på RNA isoleret fra 13 cancer cellelinjer fra kræft sites almindeligvis behandlet med strålebehandling: prostata, livmoderhalsen, hoved hals, og bryst. RT-PCR’er blev udført under anvendelse af primerpar fra flere dele af det virale genom vist i figur 1. Primere fra den virale protease (

pro

), polymerase (

pol

) var i stand til at detektere ikke-splejset virus-RNA, og kuvert (

env

) gen primere var i stand til at opdage både splejsede og enkeltvis splejset env mRNA. Den forventede størrelse produkter blev observeret i 12 cellelinjer ud af testet for

pro

13 og

pol

amplikoner og i 11 cellelinier til

env

amplikon (Fig . 2A). Parallelle RT-PCR’er blev udført med primere for

GAPDH

gen at verificere nøjagtig sammenlignelige RNA-ladning i alle prøver og lastning af geler. Kontrol uden revers transkriptase kontrolleret, at produkterne blev genereret fra RNA skabeloner og ikke fra potentielt forurenende genomisk DNA (fig. 2).

En genetisk kort over en HERV-K provirus (grå) indsat i flankerende vært genom-sekvenser er vist med en 5- eller 6 bp target duplikeret sekvens (TDS) angivet som sorte bokse. Den ikke-splejset primære virale udskrift, enkeltvis-splejset

env

mRNA og dobbelt-splejset

rec

np9

mRNA er vist nedenfor det virale genom, sammen med enkeltvis splejsede RNA [56], som ikke er kendt for at kode helst protein. 3 ‘poly (A) haler er angivet (AAAA). Den 292 nukleotider sletning af type 1 HERV-K provira spænder pol-env krydset er angivet (Δ292). Type 2 HERV-K provira og transskriptioner indeholder disse nukleotider. Positioner af PCR primerpar er vist nederst som sorte pile med de navne, som de er identificeret i hele papiret. De grå pile identificere primere anvendt til nested PCR. Den stiplede, vinklet linje viser det udskårne intronsekvenser at 1X-env og 2X-rec primerpar var designet til at krydse. Primerparret anvendt til kvantitativ RT-PCR er også vist (q-env).

RT-PCR blev udført til påvisning af virale transkripter på fem forskellige positioner i HERV-K-genomet, hvoraf to i banen splejsningsforbindelsessteder at detektere RNA’er splejsede ved den konventionelle env mRNA splice junction (1x-env) og de rec mRNA splejsesamlinger. GAPDH RT-PCR blev udført samtidigt og tjente som en positiv kontrol for RNA integritet og som loading sammenligning. Produkterne blev adskilt ved agarosegelelektroforese. Genomiske positioner af anvendte primere er vist i fig. 1. Parallelle kontroller blev udført uden revers transkriptase (Rt) som kontroller for at udelukke DNA forurening. DNA størrelsesmarkører er vist til venstre.

Disse data bekræftede, at HERV-K afskrifter var til stede i de fleste af de menneskelige kræftceller testede linier. Der var et par tilfælde, hvor HERV-K RT-PCR-produkter ikke blev registreret (fig. 2). En cervix cancer cellelinie, C33A, ikke gav RT-PCR-produkter med nogen af ​​de tre primerpar, selvom det giver det forventede produkt i

GAPDH

kontrol-amplifikation (fig. 2A). En brystcancer cellelinje, MDA-MB-468, konsekvent undladt at opnåelse af

env

amplicon, selv om

pro

pol

produkter var til stede (fig. 2A ). For at øge følsomheden, blev en indlejret RT-PCR udført for

env

amplicon anvendelse af primere, placeret som vist i figur 1.

env

produkt blev påvist i MDA-MB-468 bryst cancer linje, som det var i 11 andre linjer (fig. 3A). Men det var stadig påvises i C33A cervicale cancerceller, hvilket indikerer, at de ikke-splejsede og enkeltvis splejsede HERV-K RNA’er ikke var til stede ved detekterbare niveauer i denne cellelinie. Parallelle amplifikationsreaktioner blev udført uden revers transkriptase og var ensartet negative, hvilket viser, at amplifikation var fra RNA-templater og ikke fra nogen potentielt forurenende genomisk DNA (fig. 3).

Nested PCR blev udført på RT-PCR-produkter vist i fig. 2 til påvisning af virale transkripter i tre forskellige positioner i HERV-K-genomet. To af RT-PCR cross splejsningsforbindelsessteder at detektere RNA splejset på den konventionelle env mRNA splejsning krydset (1x-ENV) og rec og np9 mRNA (2X-rec, 2X-np9) splejsning vejkryds. Produkterne blev resolveret ved elektroforese. Genomiske positioner af anvendte primere er vist i fig. 1. Parallelle kontroller blev udført uden revers transkriptase (Rt) som kontroller for at udelukke DNA forurening. DNA størrelsesmarkører er vist til venstre.

Tilstedeværelse af Herv-K splejset Udskrifter i kræftceller

For at vurdere, om de HERV-K udskrifter har tilstrækkelig integritet til RNA til være splejset, udførte vi RT-PCR på tværs af de to virale konventionelle splejsningsforbindelsessteder. Multiple splejsede HERV-K mRNA’er er blevet karakteriseret [40], [56] – [58], herunder enkeltvis splejset mRNA kodende for env-proteinet, og tre dobbelt splejsede RNA’er, hvoraf den ene koder Rec, og en anden af ​​der koder Np9 (Fig . 1). eksisterer HERV-K HML2 provirus som to forskellige former kaldet type 1 og type 2, alt efter om en 292 bp strækning af nukleotider er til stede (type 2) eller slettet (type 1). Ved type 1 provira, sletningen fjerner det aminoterminale-kodning del af

env

rec

, og forårsager en i ramme fusion af

pol

og

env

åbne læserammer (fig. 1). Omvendt i type 2 provira, carboxylterminalen-kodning del af

pol

og at for amino termini af

env

rec

er fuldt til stede. 3′-splejsningssted (3’SS) for

env

mRNA og den første intron af

rec

mRNA er beliggende opstrøms for 292 bp stretch, men 5’SS for den anden intron af

rec

mRNA er beliggende inden for 292 bp (fig. 1). Således skriver 1 provira ikke generere

rec

form for dobbelt splejset RNA (fig. 1), eller indkode Rec protein.

Brug primere designet til at detektere enkeltvis-splejset

env

mRNA (1X-env, fig. 1) og de to splejsesamlinger i dobbelt-splejset

rec

eller

np9

mRNA (kaldet 2X-rec, fig. 1), 11 ud af 13 cellelinier viste sig at være positive med 1X-

env

primere, og 10 ud af 13 gav produkter med den 2X-rec primere (fig. 2B). Påvisning af de splejsede produkter gav også yderligere bevis for, at RT-PCR-produkter blev afledt faktisk fra viralt kodede RNA’er og ikke fra nogen potentielt forurenende cellulær genomisk DNA. Påvisning af flere størrelse produkter med den 1X-env primere var uventet.

For at kontrollere, at de uventede størrelse bånd blev afledt fra Herv-K RNA og opnå en bedre opløsning af PCR produkter bånd på agarosegelelektroforese udførte vi nestede PCR’er (figur 1). Flere bånd blev igen observeret, og ingen produkter blev detekteret i fravær af revers transkriptase, hvilket således bekræfter, at de blev afledt af splejsede virale RNA’er (fig. 3). PCR-produkter blev identificeret for 1X-env amplicon i 12 ud af 13 cellelinjer og bånd af tre forskellige størrelser blev opdaget, med forholdet mellem intensiteten af ​​de tre bands varierer blandt de forskellige linjer. Multiple size produkter blev også observeret for den 2X-rec amplicon, herunder svage bånd på ca. 500 bp og et fremtrædende bånd på ca. 250 bp. Begge PCR-produkter var til stede i MDA-MB-468 brystcancerceller, hvilket viser, at splejsede virale RNA var til stede i denne cellelinie. For C33A cervicale cancerceller, blev ingen af ​​de indlejrede produkter fra splejset RNA detekteres, hvilket bekræfter fravær af detekterbare HERV-K-transkripter i denne cellelinie. Denne analyse også påvist tilstedeværelsen af ​​np9 udskrifter i fem af linjerne (fig. 3).

Identifikation af Individuel HERV-K Active Loci

Grunden til påvisning af flere størrelse bands i RT-PCR’er i fig 2B og 3, især for 1X-env RT-PCR’er, var usikker. En mulighed var, at de kunne afspejle unikke sletninger eller indsættelser, der havde optjent i specifikke HERV-K loci i evolutionær tid resulterer i ændrede størrelse udskrifter, og disse særlige loci var dem transskriberede i en bestemt cellelinje. En anden var at splejsningsstederne anvendte varieret blandt individuelle HERV-K loci i det humane genom, hvilket resulterer i forskellige størrelse produkter. For at skelne mellem disse hypoteser og at identificere det specifikke loci, hvorfra transkripter stammer, PCR-produkterne vist i figur 2 blev sekventeret. Dette krævede analyse af transkripterne på nukleotidniveau fordi provirus er så ligner hinanden. Mens individuelle provirus akkumulere unikke mutationer end evolutionær tid, nogle af HERV-K provirus i det humane genom er så nye, at de er over 99% identiske, og niveauet af identitet kan variere i forskellige dele af det virale genom. Provira der dannede tidligere i tid er efterhånden blevet mere divergerende. Sekventering af tilstrækkeligt lange PCR-produkter kan anvendes til at udlede den specifikke virale loci, der bedst matcher de transkripter, selv når forskellene er mindre end en nukleotid i 100 mellem to bestemte provirus og RNA-transkripter fra dem. Tabel 1 lister 23 af de mest intakte HERV-K HML2 provira i det menneskelige genom, som sekvenserne blev sammenlignet [39].

I første omgang,

pro

,

pol

og

env

PCR-produkterne blev direkte sekventeret. Et eksempel på

pro Salg sekvenser fra fire cellelinjer linie med mange af de relativt intakte HERV-K provirus i det humane genom, er vist i figur 4. Sammenligning af sekvenserne viste, at de HERV-K-transkripter detekteret matchede deles af human-specifikke provira, der viser, at de stammer i overvejende grad fra delmængde af HERV-K HML2 provira der dannes efter de menneskelige og chimpanse slægter afveg. Ved andre positioner, der var flere sekundære toppe i sekventering chromatografer, hvilket indikerer, at PCR-produkterne blev afledt fra blandinger af transkripter fra multiple loci. Tabel 1 opsummerer de mest fremherskende nukleotider ( “flerhed”, tabel 1) på hver af de positioner, hvor flere nukleotider blev entydigt observeret inden for de

pro

amplikoner. Selv denne mest nøje matches provirus HERV-K102 (tabel 1), var det ikke muligt at skelne ved denne analyse, om denne provirus blev faktisk transkriberet, fordi det var også plausibelt, at flerheden sekvensen af ​​en blanding af transskriberede provirus lige coincidently matches denne provirus. Sekvensen blandinger varierede i nogen grad mellem de forskellige cellelinier (tabel 1), og blev tilsvarende observeret i de andre dele af det virale genom (data ikke vist). Mens den indsigt, der kunne hente fra direkte sekventering af RT-PCR-produkter var således begrænset, blandingerne viste, at flere provirus blev transskriberet blandt de forskellige cancer cellelinjer.

I den nederste panel, den HERV -K fuld længde provira anvendes som referencer for at identificere loci oprindelseslandet for mRNA-transkripter vises. Til venstre er de store grene af bevarede hominoids vist, sammen med de omtrentlige tidspunkter af deres forgrening fra slægt fører til moderne mennesker i millioner af år siden (Ma). Provira, der er indsat på præcis ortologe positioner i mennesker og andre hominoids, og dermed er identiske med afstamning, er angivet.

For at undersøge mere præcist hvilke HERV-K loci blev transskriberet, blandinger af RT-PCR produkter blev adskilt i individuelle sekvenser ved kloning i plasmidvektorer. Dette også tilladt undersøgelse af, hvad udgjorde de multiple størrelse produkter (fig. 2 og 3). Den 1X-

env

RT-PCR-produkter (Fig. 2A) blev haglgevær klonet i plasmidvektorer. For 1X-env-produkter, blev fireogtyve individuelle kloner fra hver cellelinje analyseret ved PCR-screening for at bestemme størrelsen af ​​det klonede amplikon. For de forskellige prøver blev 4 til 13 kloner udvalgt til sekventering, og resultaterne blev opsummeret i tabel 2. Kloner blev valgt til at omfatte det sæt af forskellige størrelser produkter i hver linie, og dermed antallet af gange som helst sekvens opnåedes ikke afspejle dens relative forekomst blandt HERV-K-transkripter i hver cellelinie. Endvidere blev graden af ​​sekventering begrænset til at se på de mest almindelige produkter, og det er sandsynligt, at mindre rigeligt transkriberede provira ikke blev påvist ved denne analyse.

Disse analyser identificerede i alt seks forskellige individuel HERV-K loci blandt de 12 cellelinier (tabel 2). To af disse var HERV-K102 og HERV-K108 (herefter provira identificeres blot som K102, K108, etc.). Sammen med en tredje provirus, K (I), disse blev påvist i flere cellelinier (tabel 2). RT-PCR-produkter blev også påvist fra yderligere tre provira, K107, K111, og K117 i ét eller nogle få cellelinier hver. Transkripter fra flere provirus blev detekteret i de fleste af linjerne. Det er sandsynligt, at mere omfattende sekventering af kloner ville øge antallet af HERV-K loci detekteret. Fem af de loci, hvorfra virale transkripter blev påvist var human-specifikke HERV-K provirus, hvilket bekræfter, at de detekterede transkripter hovedsagelig afledt af delmængde af HERV-K HML2 provirus, der dannes efter de humane og chimpanse slægter afveg. Således oftest opdaget HERV-K splejset

env

udskrifter i menneskelige kræftceller blev afledt fra den senest erhvervede delmængde af retrovirus i det humane genom.

Alternativ splejsning af Individual HERV- K Active Loci

Sekventering af 1X-env RT-PCR-produkter viste splejsning ved de forventede positioner i HERV-K-genomet, men, uventet, viste også transkripter splejset ved yderligere steder (figur 5). De konventionelle steder blev opdaget for type 2 provira, K108, K109, og K (I), og type 1 provira, K102 og K117 (fig. 5). K108 er en af ​​de mest intakte provirus i det humane genom med fuld længde åbne læserammer for alle virale proteiner [25], [35], og konventionelt splejsede transkripter fra det blev påvist i syv forskellige linjer (fig. 5). Men fire loci, K102, K (I), K117, og K111, viste usædvanlige 1X-env splejsningsvarianter dannet ud fra anvendelsen af ​​alternative 5′- og 3′-splejsningssteder. De alternative splejsningssteder, der blev anvendt varierede mellem de forskellige provirus (fig. 5). De, der blev påvist (fig. 5) i nogle tilfælde matchede konsensus signaler for de større eller mindre spliceosomes, mens i andre tilfælde de ikke (fig. 5). De fleste af alternativt splejsede transkripter var fra type 1 provirus, men en af ​​dem, K (I), var fra en type 2 provirus. den alternative splejsningssite forbrug var således ikke alene en konsekvens af fraværet af den 292 bp. K111 er en ældre provirus der dannede før afvigelsen i gorilla afstamning fra det menneske-chimpanse afstamning omkring 8 millioner år siden [25], [59], men de andre provira hvorfra splejsede udskrifter blev påvist her, er menneske-specifikke.

de 5 portioner “og 3« af en Herv-K provirus er vist øverst adskilt af /og /. 5’SS og 3’SS angiver de konventionelle splejsningssteder af HERV-K, og deres positioner er markeret med sorte cirkler. Positionerne af de ydre PCR-primere anvendt til nestede PCR er vist som pile. Strukturer af env splejsede RT-PCR-produkter fra cellelinjer og provirus anførte er i diagram nedenfor det virale genom. Stiplede vinklede linier viser de udskårne introns. Røde cirkler viser positionerne af sekvenserne, hvor ukonventionelle splejsning forekommet. For hver splejset produkt, den øverste sekvens viser den udledte primære transkript sekvensen bestemt fra den for den beslægtede genomiske locus, og den nederste sekvens viser sekvensen af ​​RT-PCR-produkt. Røde nukleotider blev forenet i det splejsede produkt. Grå nukleotider viser enderne af de udskårne intronsekvenser. Positionen af ​​292 nukleotiddeletion endelig af type 1 provirus er vist.

Cellelinjerne, hvor der blev påvist de alternative 1X-env splejsningssites er opsummeret i tabel 2 og figur 5. For K102, de samme alternative splejsningssteder blev påvist i seks forskellige cellelinier, og for K117, blev påvist de samme steder i to (fig. 5). Dette antydede, at sekvenserne af de specifikke transkripter (og de provira, hvorfra de blev afledt) bestemt alternativ splejsningssted brug. Alternativt splejsede transkripter blev påvist i de fleste af cellelinierne, og i nogle tilfælde blev påvist både de konventionelle og alternative splejsningssites til særlig provirus (K102, K (I), og K117). Det fremgår ikke klart af denne analyse, om arten af ​​cellerne bidraget til splejsnings- observerede. Sammenfattende de alternative splejsningssites detekteret udgjorde de forskellige størrelser bands detekteret i RT-PCR-reaktionerne på tværs af 1X-env splejse krydset (fig. 2 og 3). Men den hyppige påvisning af dem, og variationen mellem de forskellige HERV-K provirus var uventet, og den mulige molekylære biologiske grundlag for dem var ukendt.

Sekventering af de forskellige størrelser produkter blev også foretaget for PCR’er udført med primerne til påvisning af dobbelt splejsede RNA’er (data ikke vist). Den mindre fremtrædende, ca. 800 bp produkt (Fig. 2B) svarede til konventionelt splejset

rec

mRNA. Indlejrede PCR’er bekræftede tilstedeværelsen af ​​rec mRNA i 9 ud af 13 cellelinier (fig. 3). Desuden viste sekventering, at den fremtrædende mindre bånd i figur 2B svarede til RNA splejses fra 5’SS opstrøms af

gag

til 3’SS nedstrøms for den anden intron i

rec

mRNA . Dette RNA er blevet beskrevet tidligere [57], men er ikke kendt for at indkode en protein.

ioniserende stråling (IR) Øger HERV-K Transskription i prostata kræftceller

Efter at have fastslået, at HERV -K blev transkriberet i en række humane cancercellelinier, spurgte vi, om ioniserende stråling kunne ændre niveauerne af virale transkripter. Kvantitative, RT-PCR (QRT-PCR) blev udført på RNA isoleret fra de 12 cellelinier, der viste HERV-K transkription. Celler ved 50% sammenløb blev bestrålet i en enkelt eksponering for en

137Cs kilde. Doser af γ-bestråling blev varieret ved 0, 2,5, 5, 10 eller 20 Gy, og celler ved hver dosis blev opsamlet 1, 3, 8, 24 og 72 timer efter bestråling. Den anvendte primerpar er designet i

env

, nedstrøms for 292 nukleotiddeletion, således at det påvises både ikke-splejset RNA og enkelt-splejset env mRNA (fig. 1). Hvert eksperiment blev udført tre separate gange, og tre RT-PCR replikater blev udført på hver af de biologiske replikater.

De fleste cellelinjer, herunder de tre livmoderhalskræft linjer testede de tre hoved- og halskræft, og tre af brystkræft linjer viste ingen bemærkelsesværdige forskelle i niveauet af HERV-K udskrifter på alle dosis af ioniserende stråling og på ethvert tidspunkt (fig. 6). Imidlertid viste alle tre prostata karcinom cellelinjer signifikant øgede niveauer af HERV-K udskrifter (fig. 6). Stigningerne i de tre prostatakræft-cellelinier var mest tydelig på 24 timer efter bestråling. Niveauerne af viral

env

RNA ved 24 timer blev forøget to til otte gange sammenlignet med bestrålede celler. Ikke-parametrisk, blev Wilcoxon-signed rank test udført for at sammenligne målingerne ved hver dosis af y-stråling med dem ved 0 Gy, og p-værdierne er præsenteret i tabel 3. Alle de stigninger i prostatacancercellelinjer på 24 timer var signifikant med P-værdier 0,01. Således er de var ensartet signifikant i disse linjer, og blev observeret ved alle strålingsdoser anvendte. Visse stigninger i disse linjer var tydelige i nogle af prøverne efter 8 timer efter bestråling, men ikke på 3 timer. Alle stigningerne var forbigående, da med 72 timer efter bestråling, var niveauerne af HERV-K tilbage til baseline med alle doser af γ-stråling. Generelt blev det højeste niveau af induktion observeret ved 20 Gy, den højeste dosis, der anvendes, selv om betydelige stigninger blev observeret ved alle doser, og der var ingen indlysende korrelation mellem specifik dosis og stigningen fold blandt prostatakræft-cellelinier.

Genomiske positioner af anvendte primere er vist i fig. 1. Fem forskellige ioniserende strålingsdoser blev anvendt (0, 2,5, 5, 10, og 20 Gy), hver anvendt i en enkelt dosis, er vist i forskellige farver på fem forskellige tidspunkter efter γ-bestråling (1, 3, 8 , 24 og 72 timer). Fold ændring i forhold til 0 Gy for hvert tidspunkt blev opnået ved normalisering til 3 husholdningsgener. Søjler repræsenterer midlerne til tre uafhængige RT-PCR replikater udført for hvert af tre eksperimenter. Fejl søjler viser standardafvigelser.

En af de fire bryst carcinom cellelinier (MCF-7) viste også en stigning i HERV-K RNA-niveauer efter γ-bestråling (fig. 6) . Kinetikken for stigningen svarede til, hvad der blev observeret i de tre prostatacancer linjer med en maksimal stigning på seks gange observeret 24 timer efter bestråling i de 10 Gy behandlede celler. Både 5 og 10 Gy doser fremkommet statistisk signifikante stigninger (tabel 3), og stigninger på mere end to gange blev observeret 8 og 24 timer efter flere forskellige doser af γ-bestråling, hvilket indikerer, at der var en beskeden effekt af γ-bestråling i denne linje.

sammenfattende blev niveauerne af HERV-K RNA’er væsentligt forøget ved ioniserende stråling i en brøkdel af de testede cancercellelinier. Stigningerne var forbigående og toppede på omkring 24 timer efter bestråling. Denne effekt blev observeret i alle testede tre prostata cancer cellelinjer, tyder på, at HERV-K i disse celler kan være særligt følsomme over for ioniserende stråling.

Diskussion

De vigtigste resultater af denne undersøgelse var, at ioniserende stråling forøgede niveauerne af HERV-K-transkripter i nogle cancerceller, og at virkningerne varierede blandt de testede linjer. Især udviste alle tre prostatakræft linjer, der blev testet signifikant forhøjede niveauer af HERV-K RNA’er, der toppede ved ca. 24 timer efter eksponering for en enkelt dosis af γ-bestråling og derefter aftaget. En tilsvarende stigning og efterfølgende fald blev også observeret i en af ​​tre brystcancer-linjer.