PLoS ONE: Matrix Stivhed Regulerer Cancer Cell Growth og Cellular Phenotype

Abstrakt

Baggrund

De mekaniske egenskaber af den ekstracellulære matrix har en vigtig rolle i cellevækst og differentiering. Men det er uklart, i hvilket omfang kræftceller reagerer på ændringer i de mekaniske egenskaber (stivhed /stivhed) af mikromiljø, og hvordan dette svar varierer mellem kræft cellelinjer.

Metode /vigtigste resultater

i denne undersøgelse anvendte vi et nyudviklet 96-brønds plade, der arrays ekstracellulære matrix-konjugeret polyacrylamidgeler, der øges i stivhed med mindst 50-fold hen over pladen. Denne plade blev anvendt til at bestemme, hvordan ændringer i stivhed af den ekstracellulære matrix modulere de biologiske egenskaber af tumorceller. De cellelinjer testede falder i en af ​​to kategorier baseret på deres spredning på substrater af forskellig stivhed: “stivhed afhængig” (dem, der viser en stigning i cellevækst som ekstracellulære stivhed øges), og “stivhed uafhængige” (de, der vokser lige på både bløde og stive substrater). Celler, der voksede dårligt på bløde geler også viste nedsat sprede og migration under disse betingelser. Vigtigere, podning cellelinjerne i lungerne hos nøgne mus afslørede, at evnen hos cellerne til at vokse på bløde geler

in vitro

korreleret med deres evne til at vokse i et blødt væv miljø

in vivo

. Den lungecarcinom A549 svarede til kultur på bløde geler ved at udtrykke den differentierede epithelial markør E-cadherin og faldende ekspressionen af ​​mesenchymale transkriptionsfaktoren Slug.

Konklusioner /Signifikans

Disse observationer antyder, at de mekaniske egenskaber af matrixen miljø spiller en væsentlig rolle i reguleringen af ​​spredning og de morfologiske egenskaber af cancerceller. Endvidere flere brønde format soft-plade analysen er et nyttigt og effektivt supplement til etablerede tre-dimensionelle cellekultur modeller

Henvisning:. Tilghman RW, Cowan CR, Mih JD, Koryakina Y, Gioeli D, Slack -Davis JK, et al. (2010) Matrix Stivhed Regulerer cancercellevækst og cellefænotype. PLoS ONE 5 (9): e12905. doi: 10,1371 /journal.pone.0012905

Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget: 15 juli, 2010; Accepteret: August 24, 2010; Udgivet: 23 September, 2010

Copyright: © 2010 Tilghman et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud NIH-NCI CA40042 (National Institutes of Health-National Cancer Institute) (www.nih.gov) og finansiering fra Coulter Foundation Translationelle Partners Award (www.whcf.org) (JTP), NIH HL092961 (DJT) , og NIH CA124706 (GD). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kontrollen med epitelcelle (EF) differentiering og proliferation er kritisk for vævshomeostase [1], [2]. EF proliferation reguleres af komplekse interaktioner med det omgivende mikromiljø, herunder eksponering for vækstfaktorer, kontakt med tilstødende celler, og adhæsion til komponenter af den ekstracellulære matrix (ECM) [3] – [6]. Ændring af de signalveje, der regulerer svar på disse microenvironmental signaler er en kritisk hændelse i tumor initiering, progression og metastaser.

De mekaniske egenskaber af ECM er blevet identificeret som en vigtig faktor, der regulerer den differentiering og spredning af et væld af celletyper både

in vitro

og

in vivo

. Konkret stivhed ( “stivhed”) af ECM, defineret ved sin elasticitetsmodul (

E

) i enheder af kraft pr areal (Pa), påvirker væksten, differentiering, og funktionaliteten af ​​mange celletyper, herunder stamceller, fibroblaster, glialceller, og cardiomyocytter [7] – [11]. Desuden er sygdomstilstande ofte ledsaget af en lokal stigning i ECM stivhed [12], [13]. Cancer progression i blødt væv er typisk forbundet med en stigning i stivhed skyldes lokal akkumulering af en tæt, tværbundet collagen matrix muliggør påvisning af tumoren ved fysisk palpation [14], [15]. Derfor ikke-tumorigene mammae epitelceller, der normalt bor i blød (

E

= 150 pascal [Pa] eller N /m

2) mikromiljø i brystet, viser øget proliferation, når de dyrkes på stivere matricer (

E

= 4500 Pa), sammen med øget migration, augmented ERK signalering, og tab af cellulære polaritet [16]. Disse egenskaber betragtes kendetegnende for tumorceller og er kendetegnet ved at være en integreret del af en overgang fra en relativt hvilende til en “ondartet” fænotype, drevet af en lokal stigning i ECM stivhed [16].

Omfanget og variabilitet som humane cancercellelinier reagerer på variationer i microenvironmental stivhed er uklar. Fibroblaster transformeret med onkogent H-Ras viser ikke længere væksthæmning på bløde substrater [11]. Desuden vækstegenskaberne af klonale populationer af brystkræft cellelinien MDA-MB-231 varierer i afhængighed af stivhed, og de korrelerer med evnen til at vokse i blød lunge eller stiv knogle

in vivo

[ ,,,0],17]. Dette antyder, at vækstegenskaberne af en bestemt cancer cellelinje i respons til substrat stivhed kan bestemmes ved dets genetiske eller epigenetiske sammensætning.

Analyse af humane cancercellelinjer udføres generelt under anvendelse af celler dyrket på stift plast, eller i Matrigel eller blød agar, er de mekaniske egenskaber af hvilke dårligt defineret og /eller vanskelige at modulere. I denne undersøgelse har vi tilpasset en fremgangsmåde til dyrkning af celler på biologisk relevante “bløde” substrater med ECM-konjugeret polyacrylamid (PA) geler, som kan spænde over stivhed området fra 100 Pa-150.000 Pa. Vi anvendte en nyudviklet 96-brønds assay-system der arrays PA geler af varierende stivhed i brugerdefinerede intervaller på tværs af pladen. Dette system blev anvendt til at bestemme, hvordan ændringer i stivheden af ​​ECM modulere de biologiske egenskaber af tumorceller, herunder vækst, morfologi, og migrerende egenskaber. De testede cellelinier afveg i to kategorier baseret på deres spredning profiler: “stivhed afhængig” linjer generelt udstillet stigende cellevækst som ekstracellulær stivhed øges, mens “stivhed uafhængig” linjer voksede lige godt over hele testede spektret af matrix stivhed. Vigtigt er det, celler, der voksede dårligt på bløde geler viste også reduceret spredning og migration under disse betingelser. Vi vurderede væksten af ​​fire repræsentative cellelinier valgt blandt disse to kategorier

in vivo

ved indføring af cellerne i det bløde væv miljø af lungen. De to stivhed-uafhængig cellelinier (PC-3 og mPanc96) voksede godt i blød (lunge) væv, mens stivheden afhængige cellelinier (A549 og MDA-MB-231) ikke voksede godt i lungen. Den lungecarcinom A549 svarede til kultur på bløde geler ved at udtrykke den differentierede epithelial markør E-cadherin og faldende ekspressionen af ​​mesenchymale transskriptionsfaktoren Slug. Disse observationer antyder, at de mekaniske egenskaber af matrixen miljø spiller en væsentlig rolle i reguleringen af ​​spredning og de morfologiske egenskaber af cancerceller, og at “stivhed profil” er en iboende egenskab ved hver cancercellelinie.

Resultater

stivhed-afhængige vækst af cancer cellelinjer

for at måle væksten af ​​kræft cellelinjer som en funktion af matrix stivhed vi tilpasset en roman 96 brønde analysesystem ( “soft-plate96” ), der bruger kollagen kovalent koblet til polyacrylamidgeler som substrater i stedet for ECM-coatede stift plast. De bløde plader bestod af fem sektioner, der hver indeholder to kolonner af kollagen-coatede PA geler af en specifik elasticitetsmodul (fig. 1), 150 Pa og 1200 Pa (svarende til lunge og bryst), 2400 Pa og 4800 Pa ( sammenlignes med en brysttumor), og 9600 Pa (approksimerende tværstribede muskler). Disse elastiske moduli blev valgt baseret på offentliggjorte målinger af stivhed af bløde væv og tumorer [7], [10], [16], [18], og på foreløbige data, der viser, at de største ændringer i stivhed-afhængig celledeling fandt sted mellem 150 Pa og 4800 Pa (data ikke vist).

en typisk 5 dages vækst assay med en blød-plate96 giver et “vækst-profil”, som afspejler effekten af ​​stivhed på proliferationen af ​​cellelinjen.

Vi bestemmes vækstprofilen fjorten cancercellelinier ved udpladning af cellerne på det bløde-plate96 og måle gange ændring i celleantal efter fem dage under anvendelse af et fluorescerende DNA-bindende farvestof (fig. 2) . Desuden blev væksten profiler af ikke-tumorigene mammaepitelceller (MCF-10A) og to fibroblastlinier bestemt. Cellevækst på definerede matricer genereret en kvalitativ “vækst profil” for hver cellelinie (fig. 1, 2). Vækst- profiler af cellelinierne faldt i en af ​​to kategorier: “stivhed-afhængige” celler, mindst 2-fold ændring i celleantal over hele spektret af ekstracellulær stivhed afprøves (, MDA-MB-231 brystcancerceller og A549 lunge kræftceller), og “stivhed-uafhængige” celler, der voksede lige godt over hele spektret af analyserede matrix stivhed (f.eks PC-3 prostatacancerceller og mPanc96 bugspytkirtlen kræftceller) (fig. 2). Der var ingen korrelation mellem formen af ​​stivheden-afhængige vækst profil og vævet oprindelsesland, eller om cellerne var oprindeligt dyrket fra den primære tumor eller fra en metastatisk læsion.

Tabellen er en samling af 5 -dages vækst assays for 17 cellelinier. Inkluderet i tabellen er oprindelige kilde af cellerne (angivet med litteraturhenvisninger), evnen til at vokse på 150 Pa og 9600 Pa substrater (fra SoftPlate96 assays), og den bløde-plate96 vækst profil for hver cellelinie. Grå profiler indikerer stivhed-afhængige linjer og sorte profiler indikerer stivhed-uafhængige linjer. Væksten er målt som følger: – 1 fold; + 1-5 fold; ++ 5-10 fold; +++ 10-15 fold; ++++ 15-20 fold; +++++ . 20 fold stigning i celletal over 5 dage

Vi yderligere karakteriseret to cellelinjer, som viste stivhed-afhængig vækst (MDA-MB-231 og A549) og to celle linjer, der viste stivhed-uafhængig vækst (mPanc96 og PC-3). Hver cellelinje demonstrerede robust cellevækst på den stive collagen-coatede plast (fig. 3A). Stivheden-afhængige celler demonstrerede en 4-5 gange forøgelse i antallet på de mere stive geler (4800-9600 Pa) i forhold til de bløde (150-1200 Pa) geler (fig. 3B, førsteklasses paneler). I modsætning hertil to stivhed-uafhængige cellelinjer demonstrerede næsten tilsvarende numre på de bløde og stive geler (fig. 3B, bundpaneler). For at bestemme om forskellen vækst på bløde eller stive substrater repræsenteret udvælgelsen af ​​en population af celler, der udviser selektiv vækst på de forskellige substrater, A549 eller MDA-MB-231 celler blev dyrket på plast eller 150 Pa substrater for 15 dage. Disse celler blev derefter høstet og underkastet en 5-dages vækst assay på en blød-plate96. Ingen ændring i den bløde plade vækst profil blev observeret efter langvarig dyrkning på bløde substrater (fig. S1). Disse data fastsætter klart cellelinje specifikke forskelle i evnen til at vokse på blød versus stive substrater og antyder, at “stivhed profil” er en iboende egenskab ved hver cellelinie.

A.) 5 dages vækst-assay af fire cancer cellelinjer på plast. B.) 5 dages vækst analyser af de fire kræft cellelinjer på en soft-plate96. Data er udtrykt som fold ændring i forhold til antallet af celler oprindeligt udpladet. Resultater viser middel ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg. * P. 0,05 vs. vækst på 9600 Pa målt ved envejs ANOVA efterfulgt af Tukey test

Egenskaber af stivhed-afhængige og -uafhængige cellelinjer på forskellige substrater

vi vurderet, om nedsat vækst af stivhed-afhængige celler på bløde geler var på grund af defekter i adhæsion til substratet, en blokeret cellecyklus, eller induktion af apoptose. A549 og MDA-MB-231 celler blev udpladet på den bløde-plate96, fik lov til at klæbe i seks timer, og antallet af vedhæftede celler målt. Begge cellelinier knyttet effektivt til de kollagen-geler uanset elasticitetsmoduler (fig. 4A), hvilket indikerer, at lavere celleantal på gelerne efter fem dage ikke skyldes en mangel på celle vedhæftning.

a.) A549 og MDA-MB-231 celler blev udpladet på en blød-plate96 og totale celleantal pr brønd blev talt efter 6 timers fastgørelse. Data er udtrykt som procent af adhæsion til de 150 Pa geler. B.) A549 og PC-3-celler blev dyrket på 150 Pa eller 4800 Pa gel substrater for 5 dage efterfulgt af cellecyklusanalyse. Resultater viser gennemsnittet af mindst tre forsøg ± SEM. * P. 0,05

Manglende adhæsionssignalering i forankringsafhængige celler resulterer i en blok ved G1 /S checkpoint i cellecyklussen [19]. A549-celler dyrket på en 150 Pa gel til fem dage viste en beskeden men signifikant akkumulering i G1-fasen af ​​cellecyklussen med et tilsvarende fald i procentdelen af ​​celler i S-fasen (fig. 4B), i overensstemmelse med en blok på G1 /S checkpoint. I modsætning hertil MDA-MB-231-celler udviste ingen signifikant ændring i deres cellecyklus profil, der ligner stivheden-uafhængige cellelinier PC-3 og mPanc96 (fig. 4B). Imidlertid har begge stivheden-afhængige cellelinier (A549 og MDA-MB-231) udviste signifikant apoptose ved dyrkning på bløde geler i fem dage, mens stivheden-uafhængig PC-3 og mPanc96 cellelinier ikke gjorde (fig. 5A- B). Ingen af ​​de fire cellelinjer udviste signifikant apoptose, når de dyrkes på de mere stive (4800 Pa) geler. Disse data indikerer, at “stivhed profil” af celler ikke afspejler forskelle i adhæsion til matrixen, men mere sandsynligt afspejler stivhed-afhængige ændringer i cellecyklusprogression og celleapoptose.

A.) Repræsentative mikrografier af A549 og MDA-MB-231-celler udpladet i 5 dage på 150 Pa eller 4800 Pa gel substrater. Alle cellekerner er farvet med DAPI (blå) og TUNEL-positive celler mærket med fluorescein (grøn). Bar = 100 um. B.) Kvantificering af TUNEL-farvning. Gennemsnit af 2 eksperimenter ± SEM med en samlet mindst 400 celler tælles for hver tilstand.

evne kræft cellelinjer til at danne kolonier i blødt væv korrelerer med deres soft-plate96 profiler

Vi vurderet, om forskellen evnen til at vokse på bløde substrater udstillet af stivhed-afhængige og -uafhængige cellelinjer var prædiktiv for evnen af ​​disse celler til at vokse i et blødt væv miljø

in vivo

. To stivhed-afhængige linjer (MDA-MB-231 og A549) og to stivhed-uafhængige linjer (PC-3 og mPanc96) blev stabilt transduceret med en GFP-kodende lentivirus og injiceret i halevenen hos nøgne mus. Enten 2-24 timer eller 14 dage efter injektion GFP-positive cellepopulation i lungehomogenater blev bestemt ved flowcytometri og histokemi. Hver af cellelinjerne udviste signifikant antal celler i lungerne efter injektion (Fig 6A, højre panel;. Data ikke vist). Men efter to uger lungerne af mus injiceret med to stivhed-afhængige cellelinier (MDA-MB-231 og A549) indeholdt færre GFP-positive celler, sammenlignet med lungerne fra mus injiceret med stivhed-uafhængige cellelinjer (PC- 3 og mPanc96) (fig. 6A, venstre panel). Hematoxylin og eosin (H 0,05 vs. MDA-MB-231-celler som målt ved envejs ANOVA efterfulgt af Tukey test. (Højre) GFP-mærkede A549 og mPanc96 celler blev podet ind i lungerne og procentdelen af ​​GFP-positive celler blev scoret med intervaller over 24 timer. B.) Histologi af muse lunge efter 14 dage efter injektion af A549-celler (venstre panel) og mPanc96 celler (højre panel). Pile viser mikrometastaser. C.) Sammenligning af væksten af ​​cellelinjer på plastik (taget fra fig. 3A) og på 1200 Pa substrater (taget fra fig. 3B).

Øget proliferation og celle migration af stivhed-afhængige celler korrelerer med cellespredning

Vi næste vurderet, om spredning af stivhed-afhængige cellelinier korrelerede med cellers evne til at spredes på forskellige gel substrater. Både MDA-MB-231 og A549-celler udviste signifikante stigninger i celle spredning på 4800 Pa geler sammenlignet med 150 Pa geler (fig. 7A-B). Lignende resultater blev opnået, når BxPC-3-celler, en pancreatisk linje, som udviser en sammenlignelig vækstprofil til MDA-MB-231 og A549-celler (fig. 2), blev dyrket på 150 Pa og 4800 Pa geler (data ikke vist). Interessant, PC-3 celler (stivhed-uafhængig) var i stand til at sprede sig på 150 Pa geler til en lignende omfang som på de 4800 Pa geler, mens mPanc96 celler (stivhed-uafhængig) ikke spredes mærkbart på enten bløde eller stive underlag (fig . 7A-B). Evnen til at spredes på flere stive substrater også korreleret med evnen hos A549 og MDA-MB-231-celler at migrere. I modsætning hertil både PC-3 og mPanc96 celler ikke påvist signifikante forskelle i migration, når forgyldt på bløde versus mere stive substrater (Fig. 7C). Disse resultater viser, at for stivhed-afhængige cellelinier cellernes evne til at sprede korrelerer med øget proliferation og migration. For stivhed-uafhængige celler disse adfærdsmønstre synes at være frakoblet.

A.) Mikrografier af A549, MDA-MB-231, PC-3, og mPanc96 celler, som blev udpladet på 150 eller 4800 Pa gel substrater for 20 timer. B.) Områder i celler, der var udpladet i 20 timer på 150 eller 4800 Pa gel substrater. Resultaterne viser middelværdien fold stigning over en unspread celle ± SEM af mindst 20 celler talt for hver betingelse. C.) A549, MDA-MB-231, PC-3, og mPanc96 celler blev udpladet i 2 timer, derefter filmet i yderligere 18 timer. Mean celle hastighed ± SEM i um /time blev bestemt ved at spore og måle stierne i 15 celler pr stivhed per celle linje. * P. 0,05

Focal vedhæftning kinase (FAK) er en kritisk signalering komponent i integrin signalering og har været impliceret i sensing stivhed ECM [20], [21]. FAK aktivitet, som målt ved dets autophosphorylering på tyrosine397 blev der kun beskedent aktiveres som en funktion af matrix stivhed i A549-celler, og blev ikke ændret signifikant i de andre celletyper afprøvet (fig. S2) linjer. Disse data understreger, at adfærd af de forskellige cancercellelinier på bløde eller stive substrater ikke uden videre kan tilskrives ændringer i generel vedhæftning signalering gennem FAK aktivering.

De mekaniske egenskaber af mikromiljøet regulere epitel- og mesenchymale egenskaber A549 celler

omdannelsen af ​​normale epitelceller til maligne, metastatiske kolleger ofte indebærer tab af udtrykket E-cadherin og købet af en mere vandrende fænotype – en proces kaldet epitel-til-mesenkymale overgang (EMT). A549-celler dyrket på blød (150 Pa) geler i 5 dage dannede klynger uden synlige fokale adhæsioner eller stress fibre (fig. 8A). I modsætning hertil blev der celler på mere stiv (4800 Pa og 19200 Pa) geler spredt og mere sprede udstiller fremtrædende stress fibre og fokale sammenvoksninger (Fig. 8A), alle kendetegnende for mesenkymale fænotype. Immunofluorescens-farvning eller Western blot-analyse af celler dyrket på 150 Pa geler eller 4800 eller 19200 Pa geler viste signifikant opregulering af E-cadherin-ekspression på bløde substrater (fig. 8B-C). Imidlertid blev ingen signifikant ændring i ekspressionen af ​​mesenchymale markør vimentin observeret i celler, der vokser på de forskellige substrater (fig. 8C).

A.) A549-celler blev dyrket i 3 dage på geler med stivheder på 150 , 4800, eller 19200 Pa. Celler blev fikseret og farvet for actin (grøn) og paxillin (rød). Pile viser fokale adhæsioner. B.) A549-celler blev dyrket på geler med stivheder på 150 eller 19200 Pa. Celler blev fikseret og farvet for actin (grøn) og E-cadherin (rød). C.) A549-celler dyrket på PA geler til 3 dage blev lyseret og blottet for ekspression af E-cadherin, vimentin og actin. D.) De relative niveauer af Slug og E-cadherin-mRNA i A549-celler dyrket på PA-geler i 3 dage som målt ved real-time RT-PCR. Resultaterne viser middelværdien ± SEM af tre uafhængige forsøg.

transskription repressor Slug er medlem af sneglen familien af ​​DNA-bindende elementer, der regulerer E-cadherin-ekspression [22] og er blevet vist at være kritisk for derved tilføres en metastatisk fænotype i en eksperimentel model for melanom [23]. Kvantitativ RT-PCR-analyse af A549-celler dyrket på substrater af forskellige stivheder afslørede en opregulering af Slug mRNA, når cellerne blev dyrket på flere stive geler (4800 og 19200 Pa) i forhold til den bløde gel (150 Pa) (fig. 8D). Slug mRNA niveauer omvendt korreleret med E-cadherin mRNA niveauer, der var lavere i A549-celler dyrkes på de mere stive geler sammenlignet med celler dyrket på den bløde gel, i overensstemmelse med ændringer observeret i E-cadherin-protein-ekspression (fig. 8B-C) . Disse data indikerer, at matrix stivhed kan modulere E-cadherin og Slug ekspression i A549-celler. Interessant, MDA-MB-231-celler, medens de udviser stivhed-afhængig proliferation, udtrykte ikke påviselige niveauer af E-cadherin på enten 150 Pa eller 19.200 Pa (data ikke vist), hvilket antyder, at disse celler, mens morfologisk ligner A549 celler på bløde og stive substrater, som ikke ændrer ekspressionen af ​​dette epitel markør når den udsættes for en blød mikromiljø.

Discussion

undersøgelserne skitseret ovenfor understreger vigtigheden af ​​de mekaniske egenskaber af ECM i reguleringen cancercelleproliferation og overlevelse. Endvidere beskriver vi en effektiv og fleksibel assaysystem at bestemme, hvordan ændringer i matrix stivhed indflydelse celleegenskaber. Analyse af 14 cancer cellelinjer afslørede, at ændre stivhed collagen-coatede matrix fremtrædende ændrer væksten af ​​visse cancer cellelinjer ( “stivhed-afhængige” vækst), mens at have ringe effekt på andre cancer cellelinjer ( “stivhed-uafhængig” vækst ), som voksede robust selv på substrater af meget lav stivhed. De lavere vækstrater i bløde geler i stivhed-afhængige cellelinier blev forårsaget i det mindste delvist af den selektive ændring i cellecyklusprogression og induktionen af ​​apoptose, når cellelinier blev udpladet på bløde matricer. Derudover viste stivheden-afhængige linier et markant fald i cellespredning og migration, når udpladet på bløde versus stive substrater, og mindst en af ​​de cellelinier (A549) udviste en stivhed-afhængig regulering af E-cadherin ekspression og reversibel modulering af epitel- og mesenchymale fænotype. Endelig, når podet i mus lunger, stivhed-afhængige cellelinjer ikke vokse samt stivhed-uafhængige linjer, hvilket indikerer en sammenhæng mellem evnen til at vokse på bløde matricer

in vitro

og proliferativ kapacitet

i vivo

i lungen.

den bløde-plate96 flere brønde assay udgør en relativt high-throughput tilgang til at vurdere, hvilken rolle substrat stivhed om egenskaberne af kræftceller i kultur. I dette system er blevet tilpasset fremgangsmåden ifølge Pelham og Wang [24] for at generere en flerbrøndsplade i hvilken substratet består af polyacrylamidgeler af varierende stivhed, der er blevet funktionaliseret for at tilvejebringe en bindende overflade for ekstracellulære matrixproteiner, fx collagen. I de undersøgelser, der er beskrevet ovenfor pladerne blev designet til at omfatte fem niveauer af elasticitetsmoduler, der spænder fra 150 til 9600 Pa, men andre formater er let oprettes. Endepunktet af assayet i vore studier var celleproliferation, men andre endepunkter, fx celleoverlevelse konfigureres let. Som illustreret, assaysystemet tilvejebringer en hurtig og reproducerbar metode til at vurdere rollen af ​​matrix stivhed på cellevækst og overlevelse.

anvendelse af dette assay har vi undersøgt et panel af cancercellelinjer med det mål at bestemme, hvordan ændringer i de mekaniske egenskaber af matrixen indflydelse celleproliferation. Ni af de kræftceller udstillet en afhængighed af matrix stivhed for vækst, vokser markant bedre på stiv /stive matricer end på de mindre stiv /bløde matricer. Stivhed-uafhængig cellelinjer udstillet næsten ingen ændring i vækstraten over forskellige matrix stivhed bruges på pladerne. Bemærkelsesværdigt, alle de undersøgte i denne undersøgelse kræft cellelinjer var i stand til at prolifererende på bløde underlag, mens normale fibroblaster, glatte muskelceller og epitelceller udviser en streng afhængighed af matrix stivhed for vækst [25]. Dette afspejler formentlig “onkogene” transformation af cancercellelinier forhold til normale celler, begivenheder, der afspejler de multiple mutationer, der karakteriserer kræftceller. Det er uklart på dette tidspunkt, om stivhed profil en cancer cellelinjer afspejler en eller flere specifikke mutationer, der er erhvervet af en individuel cellelinje.

Det er interessant, at de cellelinier, som demonstrerede stivhed-afhængige vækst også viste stivhed-afhængige sprede og migration. Vores resultater parallel analyse af en række gliomcellelinier opformeret på fibronectincoatede polymere substrater med defineret mekanisk stivhed [26]. På meget stive substrater ( 100 kPa) sprede gliom celler ekstensivt, dannet prominente stress fibre og modne fokale sammenvoksninger, og migrerede hurtigt. Men når de dyrkes på mindre stive matricer (værdier er sammenlignelige med normale hjernevæv), optrådte de gliomceller afrundet og undlod at produktivt migrere, svarende til stivheden-afhængige cellelinier er beskrevet i vores undersøgelser. Interessant nok blev gliom cellemotilitet på meget kompatible substrater reddet af farmakologisk inhibering af actinomyosin-baserede kontraktilitet, hvilket antyder, at actinomyosin kontraktilitet kan være en kritisk komponent i mechanosensory apparat. Andre undersøgelser har impliceret FAK, ERK, og den lille GTPase Rho i reguleringen af ​​vækst som reaktion på stivhed [16], eller en stigning i cyclin D niveauer nedstrøms for Rac aktivering [25]. Rho GTPaser og deres downstream mål, som er kritiske formidlere af celle spredning, migration og kontraktilitet [27], kan virke som mechanosensory maskiner, der reagerer på stivhed mikromiljø. For eksempel er Rho og dets effektor Rho-kinase (ROCK) involveret i en tilbagekoblingssløjfe, der regulerer tubulogenesis i normale epitelceller, når de dyrkes i bløde 3-dimensionelle collagenmatricer [28]. Når celler dyrkes i mere stive, high-density matricer, denne feedback loop inducerer phosphorylering af FAK og ERK, hvilket resulterer i stigningen i ekspression af gener associeret med proliferation, antagelig ved FAK-afhængig Ras-aktivering [20]. Mens disse forsøg klart implicerer Rho-vejen i mechanotransduction i normale epitelceller, kræves yderligere forsøg for at bestemme virkningerne af kontraktilitet og Rho GTPase aktivitet på cancercellevækst på bløde substrater, især i cancer-cellelinjer, som huser mutationer i Ras-vejen.

Som vist i dette dokument, ekstracellulære stivhed påvirker væksten af ​​visse cancercellelinjer og evnen af ​​en cellelinje til at vokse på en blød substrat

in vitro

kan forudsige dens evne til at vokse i en blød miljø

in vivo

. Desuden en cellelinie reaktion på ekstracellulær stivhed

in vitro

kan forudsige sin reaktion på den desmoplastiske respons

in vivo

, dvs. om en stigning i stivhed mikromiljø

in vivo

vil fremme væksten af ​​tumorcellerne. En cellelinie bløde-plade vækstprofil kan også forudsige dens følsomhed over for terapeutiske lægemidler i blødt væv. For eksempel har DNA-tværbinder mitomycin C vist sig at hæmme proliferation af mesenkymale stamceller mere effektivt på den stive versus bløde substrater [29]. Desuden bugspytkirtelkræft cellelinjer, der udtrykker epitel markører såsom E-cadherin og lavere niveauer af mesenkymale markør vimentin er mere lydhøre over for erlotinib behandling [30], [31]. Derfor, hvis en cellelinie (såsom A549) skulle blive mere epitel-lignende, når de dyrkes i en blød miljø, det ville forudsiges at være mere følsomme over for erlotinib. Yderligere studere både

in vitro

in vivo

vil være behov for at udforske den prædiktive kapacitet soft-plade assay at bestemme kræft celle responser til

in vivo

blødt væv miljøer og terapeutisk virkning inden for sådanne miljøer.

Cellular plasticitet, eller evnen til at overgangen frem og tilbage mellem en siddende epitelcelle og en vandrende mesenchymal celle, er en velundersøgte fænomen, er kritisk for flere fysiologiske processer, herunder fosterudvikling, sårheling og cancer progression. Et fælles træk for EMT er en nedregulering af celle-celle-adhæsion, primært gennem hæmning af E-cadherin udtryk, og købet af en bevægelige fænotype sammen med forøget ekspression af visse infrastrukturelle komponenter såsom vimentin. Dog kan denne overgang ikke altid være fuldstændig, da der er mange eksempler på celler, der undergår en “delvis” EMT hvori celler bliver motile ved transient erhverve nogle, men ikke alle de mesenchymale cellekarakteristika [32]. Dette antyder, at celler undergår EMT i en kompleks og trinvis måde, og ikke alle EMT begivenheder er nødvendige for at opnå en vandrende fænotype.