PLoS ONE: Den Hypoxi-inducerbare Transcription Factor ZNF395 styres af IĸB kinase-signalering og Aktiverer gener involveret i den medfødte immunrespons og Cancer

Abstrakt

Aktivering af hypoxi inducerbare transkriptionsfaktor HIF og NF ĸB pathway fremmer inflammation-medieret tumor progression. Den cellulære transskriptionsfaktor ZNF395 har gentagne gange vist sig overudtrykt i forskellige humane cancere, især som reaktion på hypoksi, hvilket indebærer en funktionel relevans. For at forstå den biologiske aktivitet af ZNF395 identificerede vi målgener af ZNF395 gennem et genom-dækkende udtryk skærm. Induceret ZNF395 ekspression førte til opregulering af gener vides at spille en rolle i cancer samt en undergruppe af interferon (IFN) stimuleret gener (ISG) involveret i antivirale responser såsom IFIT1 /ISG56, IFI44 og IFI16. I celler, som mangler ZNF395 blev IFN-α-medieret stimulering af disse faktorer forringet, hvilket viser, at ZNF395 kræves til fuld induktion af disse antivirale gener. Transiente transfektioner afslørede, at ZNF395-medieret aktivering af IFIT1 /ISG56 promotor afhænger af de to IFN-stimulerede responselementer inden promotoren og på DNA-bindende domæne af ZNF395, en såkaldt C-klemme. Vi viser også, at IĸBα kinase (IKK) -signaling er nødvendigt at tillade ZNF395 at aktivere transkription og samtidig øger dens proteolytisk nedbrydning. Således bliver ZNF395 aktiveret på niveauet af protein modifikation af IKK. Desuden bekræfter vi, at ekspressionen af ​​ZNF395 induceres af hypoxi. Vores resultater karakterisere ZNF395 som en ny faktor, der bidrager til den maksimale stimulering af en delmængde af ISGs. Denne transkriptionelle aktivitet afhænger af IKK signalering yderligere underbygger en rolle ZNF395 i det medfødte immunreaktion. På baggrund af disse resultater er det muligt, under hypoxiske betingelser, kan forhøjede niveauer af ZNF395 støtte inflammation og cancer progression ved at aktivere target gener involveret i det medfødte immunrespons og kræft

Henvisning:. Jordanovski D, Herwartz C, Pawlowski A, Taute S, Frommolt P, Steger G (2013) den Hypoxi-inducerbare Transcription Factor ZNF395 styres af IĸB kinase-signalering og Aktiverer gener involveret i den medfødte immunrespons og kræft. PLoS ONE 8 (9): e74911. doi: 10,1371 /journal.pone.0074911

Redaktør: Karen L. Mossman, McMaster University, Canada

Modtaget: 14. marts 2013; Accepteret: August 7, 2013; Udgivet: 23 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Steger et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (tilskud til G. Steger, nummer STE604 /5-1), Deutsche Krebshilfe og Koeln Fortune Program /Faculty of Medicine, University of Cologne, Tyskland, tildele nummer 220/2010. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Gene udtryk arrays gentagne gange fundet udtryk for den cellulære faktor ZNF395 (tidligere kaldet PBF for Papillomavirus bindende faktor) signifikant forøget i forskellige kræftformer såsom renal cell carcinomer, osteosarkomer og Ewing sarkomer [ ,,,0],1,2,3,4]. Især i glioblastomer og neuroblastomer, ZNF395 fik få opreguleres gener, der var karakteristisk for en hypoxisk respons og associeret med sygdom udfald [5,6]. ZNF395 tilhørte også til generne opreguleret i forskellige cancercellelinier efter hypoxi og ved overekspression af hypoxi-inducerbare transkriptionsfaktor-1α (HIF-1α) [7,8,9]. Disse data indebærer, at ZNF395 har en funktionel rolle i baner for hypoxi og cancer. Imidlertid er næsten intet kendt om den biologiske aktivitet af ZNF395 i cellen.

Hypoxi reflekterende iltmangel ofte forekommer i udviklingslandene tumorer og er også en karakteristisk egenskab ved akut foci af vævsinflammation. Prolyl hydroxylaser (ph.d.) hydroxylat HIF-a underenheder og målrette dem til ubiquitin-afhængige nedbrydning. Under betingelser for hypoxi, ph.d.er er hæmmet. HIF-a-underenheder derefter akkumuleres og translokerer til kernen, hvor de dimerisere med deres stabil partner HIF-1β, og binder til deres målsekvens kendt som hypoxi responselement (HRE). HIF inducerer ekspressionen af ​​mere end 100 gener, der regulerer glucosemetabolisme, celleproliferation og celleoverlevelse samt gener, der drev angiogenese og inducerer immuntolerance (gennemgået i [10]). Aberrant aktivering af NF-ĸB, nøglen immunrespons regulator, er en anden karakteristisk for mange cancerformer. Det indledes med IĸB kinase (IKK) -medieret phosphorylering af inhibitorer af NF-ĸB, de IĸBα proteiner, hvilket resulterer i deres proteasom-afhængig nedbrydning (gennemgået i [11,12]). Den IKK-komplekset består af de to katalytiske subunits IKKβ og IKKα og de lovgivningsmæssige IKKγ. NF-ĸB vej er afgørende for medfødte immunreaktion. Dette indledes på anerkendelse af ikke-selvstændige patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs), der detekteres af host mønstergenkendelse receptorer (PRR) såsom den vejafgift-lignende receptor 3 (TLR3). Ved ligandbinding, dvs. viralt RNA, TLR3 udløser aktivering af kinaser TBK1 og IKK, der fører til phosphorylering og aktivering af transkriptionsfaktorer IRF3 og NF-ĸB hhv. IRF3 og NF-ĸB inducere et antiviralt respons ved forøgelse af ekspression af type I-interferoner (IFN) IFN-α og IFN-β, som blev udskilt af de inficerede celler. Deres binding til type I IFN receptor stimulerer JAK-STAT pathway at aktivere transskriptionsfaktoren ISGF3. Komplekset derefter translokerer til kernen, binder til IFN-stimuleret responselement (ISRE) og fremmer transkriptionen af ​​IFN-stimulerede gener (ISGs), der koder for proteiner med antivirale aktiviteter (revideret i [13]). Det medfødte immunrespons og den hypoxiske respons er forbundet da hypoxi ikke blot stabiliserer HIF1-α, men også stimulerer aktiveringen af ​​NF-ĸB [14]. Aktiveret NF-ĸB blev vist til opregulere ekspressionen af ​​HIF-1α [15,16,17,18]. IKKβ også afslører NF-ĸB uafhængige pro-tumorigene funktioner, som omfatter IKKβ-medieret phosphorylering af tumorsuppressorer FOXO3a og p53 henholdsvis som udløser deres proteolytisk nedbrydning [19,20].

Vi har isoleret den åbne læsning ramme (ORF) for ZNF395 gennem dets evne til at binde til regulatoriske sekvenser i kontrolområdet af flere papillomvirustyper (PV) [21]. Det viste sig også, at proteinet binder til kontrol region af Huntington sygdom (HD) genet og blev navngivet HDBP2 (HD bindende protein 2) i denne undersøgelse [22]. ORF’en for ZNF395 er fylogenetisk bevaret i hvirveldyr. Det er meget lig den GLUT4 enhancer faktor (GEF, HDBP1), som aktiverer genekspression af GLUT4, en glukosetransportør, og musen glucocorticoidinduceret gen 1 (GIG1, det humane gen ZNF704). Især disse proteiner deler de tre højt konserverede regioner CR1, CR2 og CR3 og har potentiale til at danne en zinkfinger struktur. ZNF395 blev karakteriseret som en nucleo-cytoplasmatisk shuttling protein [22,23]. Overekspressionen af ​​ZNF395 induceret celledød [24] og undertrykt både HD-promotoren og den humane PV type 8 (HPV8) promotor, der afhang af DNA binding af ZNF395 og målretning af Sin3 /HDAC1 /2-komplekset [25,26] . Vi var interesserede i at identificere andre målgener af ZNF395 og forstå kontrol af dets transkriptionsaktivitet.

Materialer og metoder

Cell kultur

Den menneskelige hudkræft cellelinje RTS3b er beskrevet i [27] og blev venligst tilvejebragt af I. Leigh, London, UK. RTS3b celler blev holdt i E-medium, den monocytisk cellelinie U937 [28] i RPMI1640, U87-MG og C33A celler i DMEM, alle medier blev suppleret med 10% FCS og antibiotika. U937, U87-MG og C33A celler blev indkøbt fra ATCC. Forbigående transfektioner blev udført med X-tremeGENE reagens (Roche Diagnostics) i overensstemmelse med producentens protokol. 48 timer senere luciferaseaktivitet blev bestemt som tidligere [29] beskrevne. De relative lysenheder blev normaliseret ved proteinkoncentrationer på prøverne. Hvor det er angivet, polyI: C (Invivogen) blev tilsat ved 10 ng /ml i 24 timer, TNFa (cellesignalering) på 1 ng /ml i 24 timer, BMS 345.541 (Sigma-Aldrich) ved 5 uM i 24, MG132 (Biomol) ved 25 uM for 24h, og IFN-α (Biomol) på 1000 U /ml i 6 timer. Den RTS3b-TR-ZNF395 cellelinje blev genereret ved stabilt at transficere pcDNA6 /TR, efterfulgt af en pcDNA4 /TO-vektoren (begge fra Invitrogen), der koder FLAG-mærket ZNF395 under kontrol af tet-operator elementer. Cellelinjen blev inkuberet i doxycyclin (Dox) (1 ug /ml) til 24 timer for at inducere ekspressionen af ​​FLAG-ZNF395. Den hypoxiske respons blev frembragt ved at injicere N

2 gas i inkubatoren til opnåelse af en O

2-koncentration på 2%. Celler blev derefter inkuberet i 12 timer og umiddelbart høstet.

Plasmider

pcDNA3.1-FLAG-ZNF395, pcDNA3.1-FLAG-ZNF395ΔCR1 og pcDNA3.1-FLAG-ZNF395mtCR3 blev beskrevet tidligere [ ,,,0],23,25]. pcDNA3.1-FLAG-ZNF395mtNES blev genereret ved steddirigeret mutagenese. Den ISG56-pGL3-Luc-konstruktion er beskrevet af Grandvaux [30]. Deletioner og punktmutationer indført enten ved kloning egnede PCR-produkter ind i pGL3-Luc eller ved site-directed mutagenese. IFI44-Luc blev opnået ved kloning af et PCR-fragment dannet fra genomisk DNA, der koder for 560 nukleotider fra den opstrøms regulatoriske region, herunder en i pGL3-Luc. Ekspressionsvektoren for IRF3-5D er beskrevet af Lin et al. [31]. HA-IKKα (Addgene plasmid 15469), HA-IKKβ (Addgene plasmid 15470) og FLAG-IKKβ, FLAG-IKKβ-K44M, FLAG-IKKβ-S177 /181E (Addgene plasmider 11103, 11104, 11105), offentliggøres [32, 33].

RT-PCR, microarray

Totalt RNA blev fremstillet ved RNeasy Mini Kit fra Qiagen. cDNA syntese og hybridisering til Affymetrix Exon 1.0 ST vifte blev udført af gruppen af ​​Prof. Nürnberg (CCG, Köln, Tyskland). De rå data blev behandlet ved hjælp Affymetrix Elværktøj, version 1.12.0 og Robust Multiarray Gennemsnitlig (RMA) algoritme [34]. Downstream statistisk analyse blev udført ved hjælp af R-sprog til statistisk databehandling, udgave 2.10.0. Til kvantitativ real-time PCR, blev 2 pg af RNA revers transkriberet under anvendelse af tilfældig primer og SuperScript Vilo cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). Real-time PCR blev udført med SybrGreen og et LightCycler-system (Roche Diagnostics). Den signifikans blev beregnet ved hjælp af t-test med parrede prøver. Primersekvenserne er angivet i tabel 1. Vores microarray eksperiment data blev aflejret på GEO-databasen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) og tildelt accessionsnummer GSE44327.

Gene

Forward primer (5’to 3′)

reverse primer (5’to 3´)

IFI16TGCACCCTCCACAAGCCATGGCTGTGGACATGIFI44TGGCAGTGACAACTCGTTTGACCGCTTCCCTCCAAAAISG56TCATCAGGTCAAGGATAGTCTGGGTGTTTCACATAGGCTAGTAGMEF2CGCCCTGAGTCTGAGGACAAGAGTGAGCTGACAGGGTTGCTPEG10AACAACAACAACAACTCCAAGTCTGCACCTGGCTCTGCAGIFIT2ACTGCAACCATGAGTGAGAACGCCTCGTTTTGCCCTTTGAGZNF395CGAAAAAGAAAGAACTCTGTGCTGTGTCCCCCAGATGGAGHPRTTGACACTGGCAAAACAATGCAGGTCCTTTTCACCAGCAAGCTTable 1. Primere anvendt til QRT-PCR.

CSV Hent CSV

Små interfererende RNA-interferens

Små interfererende RNA (siRNA, siGenome SMARTpool) blev opnået som en pulje af fire udglødet dobbeltstrenget RNA ( dsRNA) oligonucleotider: IKKα (M-003.473-02) og IKKβ (M-003.503-02) fra Dharmacon, ZNF395 (sc-77820) fra Santa Cruz Som kontrol siRNA mod onkogenet E6 af HPV8 (8E6) [35. ] blev anvendt i de samme mængder som de specifikke siRNA’er henholdsvis. 6 cm-retter af U87-mG og RTS3b celler blev transficeret med 150pmol siZNF395, 250 eller 500pmol siIKKα, β eller passende mængde af kontrol siRNA hjælp Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) .

Antistoffer, kromatin Immunpræcipitation (chip) Assay, gel shift

kanin polyklonale antistof mod ZNF395 er tidligere beskrevet [21]. The M2 FLAG antistof var fra Sigma-Aldrich, anti- HA-antistof fra Roche, anti-actin antistof fra Santa Cruz, og antistoffer mod IKKα og IKKβ var fra Cell Signaling. Fremstilling af hele celleekstrakter og co-immunopræcipitationer blev udført som tidligere [36] beskrevne. Dephosphorylering reaktioner blev udført med λ-phosphatase (Santa Cruz) ifølge fabrikantens protokol. Chip-analyse blev udført i overensstemmelse med den chip-analysen protokollen af ​​Upstate Biotechnology. Tilstedeværelsen af ​​ISG56 promotorfragmenter i bundfaldet blev analyseret ved qPCR hjælp af LightCycler systemet (Roche Diagnostics) og primer flankerende sekvenserne fra -173 til +1 af ISG56 promotoren (fremadrettet 5′-TGAGATCTGGCTATTCTGTCTTGTGG-3; bagudrettet 5′-ATGGTTGCAGGTCTGCAGTTTATCTG -3′). Gel skift blev udført som tidligere beskrevet [25] med følgende ds oligonukleotid (kun den øverste streng er givet): ISRE-wt: 5′-TTTAGTTTCACTTTCCCCTTTCGGTTTCCCTAGGT-3′; ISRE-mut114 /101:. 5′-TTTAGTGTCACTTTCCCCTGTCGGTTTCCCTAGGT-3′, som er mærket med

32P-γ-ATP eller anvendes som konkurrenter

Resultater

ZNF395 aktiverer gener forbundet med medfødte immunreaktion og kræft

Vi har isoleret cDNA for ZNF395 fra HaCat-celler [21]. Derfor brugte vi en human keratinocytcellelinje at undersøge transkriptionelle begivenheder grundet ekspressionen af ​​ZNF395 af oligonukleotid mikroanalyse. Da vi har observeret tidligere, at overekspression af ZNF395 induceret cellevækstinhiberingen [23], vi frembragte en cellelinie, baseret på hudkræft afledte RTS3b line [27], hvilket tillader inducerbar ekspression af ZNF395 styres af doxycyklin (Dox). Fem uafhængige kulturer blev enten inkuberet i nærvær eller fravær af Dox. Mens et totalt proteinekstrakt blev fremstillet ud fra en prøve indstillet til at bekræfte ekspressionen af ​​ZNF395 ved immunoblot (IB) (figur 1A) blev de resterende fire sæt anvendes til isolering af total RNA, som blev transkriberet til cDNA efterfulgt af hybridisering til GeneChip human Exon 1.0 ST vifte fra Affymetrix. Genekspression forskelle blev vurderet ved Students t-test. Gener med en falsk opdagelse sats p 0,05 og en fold forandring 1,5 blev anset for at være udtrykt forskelligt. Ti kendte gener, som er anført i tabel 2, passerede disse kriterier. Seks af de ZNF395-inducerede gener er kendt for at være reguleret af IFN, som er IFIT1 (ISG56), IFIT2 (ISG54), IFI16, IFI44, CARD6, og SAMD9. Generne MACC1, PEG10, CALCOCO1, og MEF2C har vist sig at være impliceret i cancer (tabel 2). ZNF395 medieret aktivering af IFIT1 /ISG56, IFIT2 /ISG54, IFI44, IFI16, PEG10, og MEF2C i disse celler blev bekræftet ved kvantitativ (q) RT-PCR med RNA fremstillet fra Dox-behandlede RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 celler sammenlignet med RNA fra ubehandlede celler (Figur 1B). Det er meget overraskende, at vi ikke afsløre eventuelle gen undertrykt af ZNF395 selv i reportergenassays ZNF395 effektivt undertrykt promotorer [25].

(A) Stabilt transficerede RTS3b celler, der udtrykker tet repressor og FLAG-mærket ZNF395 under kontrol for tet-inducerbar promotor (bane 3, 4) eller tom vektor pcDNA4 /TO (bane 1, 2) blev enten dyrket i fravær (bane 1, 3) eller nærvær af Dox (bane 2, 4) i 24 timer . Ekstrakter blev anvendt til immunoblot (IB), som blev udviklet med FLAG-antistof og et anti-actin antistof som kontrol. ns (ikke specifikt bånd) (B) Samlet RNA isoleret fra RTS3b TR-FLAG-ZNF395 celler, enten dyrket med eller uden Dox blev anvendt til QRT-PCR for at analysere ekspressionen af ​​de faktorer, der er vist i grafen. De tilsvarende værdier blev normaliseret til værdierne for husholdning gen hypoxanthin guanin phosphoribosyl transferase (HPRT), og dem opnået fra celler dyrket i fravær af Dox blev fastsat som 1 for hver faktor. Grafen repræsenterer middelværdierne af to uafhængige forsøg hver udført in duplo. Fejlbjælkerne viser standardafvigelserne. (C, D) RTS3b og U87-MG-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller siRNA targeting ZNF395 in duplo. Ét sæt prøver blev behandlet med opløsningsmiddel og den anden med IFN-α, før totalt RNA blev isoleret. QRT-PCR blev udført med den specifikke primer til amplifikation ISG56, IFI44, IFI16 og ZNF395 transkripter. CP-værdier opnået for de forskellige faktorer blev normaliseret mod dem for husholdning gen HPRT. Værdien med RNA fra opløsningsmidler behandlede celler transficeret med siControl blev fastsat som en i hvert enkelt tilfælde. De fold aktiveringer blev beregnet efter den sammenlignende tærskel beskrevet i Pfaffl et al. [64]. QPCRs blev udført fire gange, og standardafvigelserne er givet. De i figuren værdier afspejler den ikke-inducerede basale udtryk niveau i fravær af ZNF395 (** p 0,01)

Gene navn.; tiltrædelse

fold ind

t-test

fulde navn.; funktion

Interferon reguleret: IFIT1 /ISG56; NM_0186602.940.0087Interferon-induceret protein med tetratricopeptide gentager 1, antiviral aktivitet [38] IFI16; NM_0055311.510.0278Interferon-induceret protein 16, (Hin200), medfødte sensor til DNA, inducerer aldring [43] IFI44; NM_0064172.890.0280Interferon-induceret protein 44, antiproliferativ og antiviral aktivitet [42] IFIT2 /ISG54; NM_0015471.60.044Interferon-induceret protein med tetratricopeptide gentager 2, inducerer apoptose, antiviral aktivitet [60] CARD6; NM_0325871.580.058Caspase rekruttering domænenavn familie, medlem 6, NF-ĸB aktivator, der er forbundet med karcinomer [61] SAMD9; NM_0176541.60.066Sterile alpha motiv domæne indeholdende 9; medfødte antiviral faktor, TNF lydhør [62] Kræft-associeret: CALCOCO1; NM_0208981.670.0087Calcium binding og coiled-coil-domæne 1, transkriptions-coaktivator med TCF /LEF og β-catenin [58] MEF2C; NM_0023971.640.0087Myocyte enhancer faktor 2C, potentiel onkogen i T-celle akut lymfoblastisk leukæmi [57] PEG10; NM_0150681.570.0278Paternally udtrykte 10, involvering i hepatocellulært carcinom [63] MACC1; NM_1827621.590.0352Metastasis forbundet i tyktarmskræft 1; forbundet med tyktarmskræft metastaser [59] Unknown: ARMCX6; NM_0190071.660.0435Armadillo gentagelse indeholder, X-bundet 6; unknownTable 2. ZNF395-inducerede gener, der er konstateret ved microarray, er involveret i det medfødte immunrespons og kræft progression.

RNA blev oprenset fra fire behandlede og ubehandlede celleprøver henholdsvis revers transkriberet og hybridiseret til otte uafhængige oligonucleotid arrays. Den gennemsnitlige fold forandring og FDR q værdi for t-test til rådighed. Gener, hvor ekspression blev induceret mere end 1,5 gange med en q 0.05 er angivet, herunder deres tiltrædelse nummer og kendte funktioner. CSV Hent CSV

Konstateringen af, at seks af de gener identificeret i microarray kendes regulerede IFN gener indebar en rolle ZNF395 i IFN-α-medieret stimulation af disse målgener. For at analysere det bidrag, ZNF395 vi forbigående transficeret normale RTS3b celler med kontrol siRNA (siControl), der var rettet mod HPV8E6 onkogen, der ikke udtrykkes i disse celler, eller siRNA rettet ZNF395 (siZNF395) og inkuberes cellerne 40h senere med IFN-α i 6 timer. QRT-PCR viste, at ekspressionen af ​​ZNF395 ikke blev ændret i siControl transficerede celler på grund af IFN-α, hvilket indikerer, at ZNF395 ikke er reguleret af dette signal. Den ZNF395-specifikke siRNA reducerede ZNF395 ekspression mere end 90% (figur 1C). IFN-α inducerede ekspressionen af ​​ISG56 190 gange i kontrolcellerne. Efter transfektion af siRNA targeting ZNF395, IFN-α-medieret aktivering nåede kun 43-fold. MRNA-niveauet for IFI44 blev forøget 20 gange af IFN-α, mens undertrykkelsen af ​​ZNF395 gav en 7,4-fold induktion af IFN-α. Vi analyserede også ekspressionen af ​​IFI16, som kun blev svagt induceret i mikroarrayet vist i tabel 2. IFI16 transkripter steg 5-fold som reaktion på IFN-a i siControl transficerede celler og i celler, hvor ZNF395 blev undertrykt, IFN-α aktiveret 2,2 fold (figur 1C). Således manglen på ZNF395 kraftigt forringet IFN-α-medieret induktion af ISG56, IFI44 og IFI16 i epitel RTS3b celler. Vi bekræftede bidrag ZNF395 i IFN-α-afhængig stimulering af ISG56 og IFI44 ekspression i astrocytom-cellelinjen U87-MG. Vi valgte denne cellelinie siden Murat et al. rapporterede, at ZNF395 induceres ved hypoxi i U87-MG-celler [5]. Undertrykkelsen af ​​ZNF395 af siRNA faldt det basale niveau af transkripter for ISG56 og IFI44 med omkring 40 og 50% i henholdsvis den ustimulerede celler (figur 1D). Den ISG56 blev induceret 15-fold i kontrolcellerne og 12-fold i siZNF395-transficerede celler ved IFN-α, mens IFI44 ekspression kun blev øget 2 gange på grund af IFN-α, og 1,6 gange, når ZNF395 blev slået ned . IFI16 var næppe aktiveret uafhængig hvorvidt ZNF395 var til stede eller ej. Således de samlede virkninger af IFN-α samt knockdown af ZNF395 var svagere i U87-MG forhold til RTS3b celler. Ikke desto mindre viser disse resultater, at ZNF395 er nødvendig for den fulde IFN-α reaktion at inducere ekspressionen af ​​IFI44, ISG56 og IFI16.

ZNF395 kræver sin CR3 DNA-bindende region og de to ISREs at stimulere ISG56 promotor

for at undersøge den rolle, ZNF395 i induktionen af ​​ISG56, analyserede vi rekombinant ZNF395 i transiente transfektionsassays med en reporterkonstruktion indeholdende 654bp af den opstrøms kontrolregion af ISG56, der omfatter promotoren. Overekspression af ZNF395 inducerede ISG56 promotoren 4-fold, hvilket er i området observeret i mikroarrayet (figur 2A). Vi identificerede regionerne i ZNF395 påkrævet til aktivering af ISG56 promotoren. CR3 of ZNF395 er nødvendig for sekvensspecifik DNA-binding til et CG-rige element stede i HPV8 og i Huntington sygdom genpromotoren [22,23]. ZNF395mtCR3, med punktmutationer afskaffe DNA binding til HPV8 promotoren [23] mistet sin evne til at aktivere ISG56-Luc-ekspression. Desuden ZNF395ΔCR1, som mangler CR1-regionen til kroppen for at aktivere. Nuclear-cytoplasmatisk shuttling af ZNF395 blev vist at kræve en nuklear eksport signal (NES), der ligger inden for CR1 [22,23]. For at skelne mellem den rolle, NES og CR1, vi indført to punktmutationer at ødelægge NES. ZNF395mtNES aktiveret ISG56 promotoren op til 10 gange (figur 2A). Således er rester til stede inden for CR1 engageret i ZNF395-medieret aktivering af transkription, som ikke blev yderligere behandlet her. Den højere aktivering af ZNF395mtNES korrelerede med den eksklusive kernelokalisering af ZNF395mtNES (upublicerede resultater) [22]. Ekspressionen af ​​de muterede proteiner er tidligere blevet vist [23,25]. For at bekræfte disse aktiveringer, afslørede vi en effekt af endogen ZNF395 på promotoraktiviteten opnået med ISG56-Luc ved forbigående co-transfektion siZNF395 eller siControl med ISG56 Luc reporter konstruktion. Undertrykkelsen af ​​ZNF395 resulterede i en 20% reduktion af Luc aktivitet i RTS3b og C33A celler, (figur 2B). Ektopisk udtrykte ZNF395 var også i stand til at aktivere IFI44 promotor til stede i en reporter konstruktion. Dette omfattede 590bp opstrøms for indledningen site med to overlappende ISREs fra pos. -46 Til -64, som tidligere blev kortlagt til at mediere induktion af IFN-α og IFN-β [37]. Igen ZNF395mtNES viste øget aktivering, selv om den samlede virkning var mindre i forhold til ISG56-Luc (figur 2C).

(A) RTS3b celler blev podet i seks-brønds plader og transient transficeret med 500 ng af ISG56- luc reporter konstrukt og stigende mængder (henholdsvis 5, 10, 20 ng) af ekspressionsvektor for FLAG-ZNF395 eller de forskellige mutanter per brønd, som angivet. Strukturen af ​​ZNF395 med dens konserverede regioner CR1, CR2 og CR3 er afbildet under graferne herunder rækkefølgen af ​​de C-terminale 25 aminosyrer, som er konserverede med E-hale af TCF-1E og TCF-4E [52]. M ved position. 169 og 172 blev ændret til A i mtNES mens i ΔCR1 de aminosyrer fra 165-188 blev slettet. De aminosyrer, der blev muteret i mtCR3 og fører til tab af DNA-bindende, er angivet. (B) RTS3b og C33A celler blev først transficeret med siControl eller siZNF395 og 24h senere med ISG56-Luc reporter konstrukt. Alle grafer repræsenterer resultaterne af mindst tre uafhængige forsøg. De standardafvigelser er givet. (C) RTS3b celler blev transient transficeret med Luciferase reporter konstruktion indeholdende IFI44-promotoren inklusive 560bp baser opstrøms for initieringsstedet. Segmentet rummer to overlappende ISREs, som har vist sig at mægle IFN-afhængige induktion af IFI44. Ekspressionsvektoren for ZNF395 og ZNF395mtNES blev co-transficeret som i A.

Vi derefter bestemmes kravene sekvens af ZNF395 i ISG56 promotoren. Som vist i figur 3A, selvom det lidt reducerer aktivitet, fjernelse af sekvenserne op til -117 eliminerede ikke aktiveringen af ​​ZNF395. Sletningen af ​​segmentet fra -117 til -93 faldet drastisk den basale aktivitet af promotoren, og fjernet enhver stimulering af overudtrykte ZNF395. Dette DNA-segment huser IFN-stimulerede-responselementer (ISRE) I og ISREII der medierer induktion af ISG56 ved IRF3 og IFN-α følsomme transskriptionsfaktor ISGF3 [38]. To punktmutationer inden for ISREs, der blev vist at eliminere reagere på IRF3 [30] og på IFN-α (data ikke vist) afskaffet aktivering ved overekspression af ZNF395 (figur 3B), hvilket viser, at ZNF395 virker gennem den ene eller begge ISRE elementer. Med to modificerede konstruktioner indeholdende enten to kopier af ISREII (ISG56-2x ISREII) eller to kopier af ISREI (ISG56-2x ISREI), ZNF395 opnåede halvdelen af ​​aktiveringen i forhold til vægt promotoren. Ændringerne påvirkede ikke signifikant IRF3-5D, en konstitutiv aktiv mutant af IRF3 [31], i sin kapacitet til at øge luciferase-aktivitet (figur 3C). Således sekvensen sammensætningen af ​​ISREI og -II stede i wt promotoren er optimal for ZNF395 at aktivere. For at teste, om ZNF395 er placeret på den endogene ISG56 promotoren, blev en chip assay med RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 celler udføres. Mængden af ​​fragment indeholdende ISG56-specifikke ISREs som blev trukket ned af FLAG-antistof fra ekstrakterne blev bestemt ved qPCR. Med ekstrakter fra celler dyrket i tilstedeværelse af Dox at inducere ekspressionen af ​​FLAG-ZNF395, FLAG antistof udfældet 288% af input (+ Dox, figur 3D), der repræsenterer en 2,3 gange stigning i forhold til IgG kontrol, som inddrives 127 % af input. For at bekræfte at ZNF395 direkte kan binde til ISREs udførte vi gel skift. His-mærket oprenset ZNF395 flyttet et radioaktivt mærket oligonukleotid, der koder de to ISREs af ISG56 promotoren (ISRE-wt). Overraskende oligonukleotidet koder for disse to ISREs med mutationerne T-G i pos. 114 og 101 (ISRE-mut) var lige så godt bundet og var i stand til at konkurrere om bindingen, når det tilsættes i overskud (figur 3E). Den direkte binding af ZNF395 blev bekræftet med nukleare ekstrakter fremstillet fra RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 celler enten dyrket med eller uden Dox og polyI: C, en efterligner af dsRNA hhv. En prominent band var synlig med alle ekstrakter, uafhængig af polyI: C og Dox. Homologerne ISG56-ISRE-wt oligonucleotid, men ikke det muterede ISRE-mut oligonucleotid var i stand til at konkurrere dette kompleks. Efter induktion af ZNF395 ekspression ved Dox, en yderligere svagt bånd migrerer lige over den store kompleks optrådte (figur 3E, bane 9, 12). Dette kompleks forsvandt i nærvær af et overskud af umærket ISRE-wt samt ISRE-mut oligonucleotid. Da dette band kun blev påvist med ekstrakter af celler, der overudtrykker rekombinant ZNF395 og opførte sig som renset ZNF395 vedrørende sekvensspecificitet, kan det udgøre ZNF395 bundet til ISREs. Disse observationer indebærer, at ZNF395 er direkte placeret på ISREs. Imidlertid kan sekvensen specificitet observeret med de transiente transfektioner ikke stole på ZNF395 binding.

(A) Sekventielle deletioner startende fra 5’ende af ISG56 opstrøms regulatoriske region blev indført i ISG56-Luc-konstruktion som angivet i figuren. De tilsvarende luciferase reporter-konstruktioner blev cotransficeret med 5, 10 og 20 ng af FLAG-ZNF395 ekspressionsvektor. Den relative luciferase aktivitet af den fulde længde ISG56-Luc (= ISG56-654) konstruktion blev sat som 1. Tallene over hvert sæt repræsenterer fold aktiveringer induceret af ZNF395 med den relative aktivitet af hver muteret reporterkonstruktion indstillet som 1. (B ) konstruktionen ISG56Δ117-93 indeholder en deletion af de to ISREs inden for rammerne af den fulde længde ISG56-Luc konstruktion som huser den opstrøms region op til -654bp mens i ISG56-mtISRE i /II et T i hver ISRE er blevet ændret til G, som angivet under grafen. Alle reporterkonstruktioner blev co-transficeret igen med 5, 10 eller 20 ng af ekspressionsvektoren for FLAG-ZNF395. Rækkefølgen af ​​de to ISREs stede i ISG56 promotor med punktmutationer, der er blevet indført tilbydes. (C) Transiente transfektioner med ISG56-Luc reporter-konstruktioner, der blev ændret til at indeholde enten to kopier af RS I (ISG56-2x ISRE I) eller to kopier af RS II (ISG56-2x ISRE II) og 5 ng af ekspressionsvektor for ZNF395 eller IRF3-5D henholdsvis. (D) på chip-assay. RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 celler blev dyrket i fravær eller nærvær af Dox, tværbundet og underkastet en chip assay med antistof mod FLAG-mærke og kontrol muse IgG. De udfældede DNA-segmenter blev amplificeret med en LightCycler anvendelse af primere flankerer ISREs af ISG56 promotoren. Den ISG56-Luc reporter konstruktionen blev inkluderet som standard til at tillade en kvantificering. Kopitallet opnået for input blev fastsat som en for hver ekstrakt og folden berigelse blev beregnet. De PCR’er blev udført i tre eksemplarer (* p = 0,05). (E) Gel shift analyse. Bakterielt udtrykte sin-mærket renset AN-ZNF395 (mangler aminosyrer 1-114) blev inkuberet med 200pg ISREI-WT (bane 1-4) eller ISRE-mut oligonucleotid (baner 5-7), begge radioaktivt mærket med

32P -γ-ATP og binding blev analyseret med en nativ PAA gel. I bane 3 og 6, en 250-fold overskud af umærket ISRE-wt og i bane 4 og 7, af ISRE-mut oligonucleotid blev tilsat som konkurrenter. I gelen shift vist til højre, kerneekstrakter fremstillet ud fra RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 celler, enten i fravær eller nærvær af Dox og polyI: C, som indikeret, blev inkuberet med mærket ISRE-wt oligonucleotid og en 250 fold overskud af umærket ISRE-wt eller ISRE-mut oligonucleotid. Placeringen af ​​den formodede ZNF395-ISRE komplekset er angivet med en pil.

IKK mærker ZNF395 for proteasomalaktivitet nedbrydning

De beskrevne resultater hidtil viser, at ZNF395 er nødvendig for den fulde induktion af ISG56, IFI44 og IFI16. Disse IFN-stimulerede faktorer er kendt for at være en del af et antiviralt medfødte immunreaktion. Desuden kan ISG56 direkte aktiveres af IRF3 upon TLR3 signalering som respons på dsRNA.