PLoS ONE: High Frequency af Fusion Udskrifter Inddragelse TCF7L2 i kolorektal cancer: Novel Fusion Partner og Splice Variants

Abstrakt

VTI1A-TCF7L2

blev rapporteret som en tilbagevendende fusion gen i kolorektal cancer ( CRC), viser sig at blive udtrykt i tre ud af 97 primære kræftformer, og en cellelinje, NCI-H508, hvor et genomisk sletning forbinder de to gener [1]. For at undersøge denne fusion videre, analyserede vi high-throughput DNA og RNA sekventering data fra syv CRC-cellelinjer, og identificeret det gen

RP11-57H14.3

(ENSG00000225292) som en ny fusionspartner for

TCF7L2

. Sammensmeltningen blev opdaget fra både genomet og transkriptom data i HCT116 cellelinie. Ved tre eksemplarer nested RT-PCR, vi testet både den hidtil ukendte fusion transcript og

VTI1A-TCF7L2

til ekspression i en serie af 106 CRC væv, 21 CRC-cellelinier, 14 normal tyktarmsslimhinde, og 20 normale væv fra diverse anatomiske steder. I alt 42% og 45% af CRC prøver udtrykt

VTI1A-TCF7L2

TCF7L2-RP11-57H14.3

fusion udskrifter hhv. De fusionstranskripter blev begge set i 29% af de normale kolonmucosa prøver, og i 25% og 75% af de testede normale væv fra andre organer, afslører, at

TCF7L2

fusionstranskripter hverken specifikke for cancer eller til tyktarmen og endetarmen. Syv forskellige splejsningsvarianter blev fundet for

VTI1A-TCF7L2

fusion, hvoraf tre er nye. Fire forskellige splejsningsvarianter blev fundet for

TCF7L2-RP11-57H14.3

fusion. Afslutningsvis har vi identificeret nye varianter af

VTI1A-TCF7L2

fusion udskrifter, herunder en ny fusionspartner gen,

RP11-57H14.

3, og demonstrerede påviselige niveauer i en stor del af CRC prøver, såvel som ved normal colon mucosa og andre vævstyper. Vi foreslår, at fusionstranskripter observeret i en høj frekvens af prøverne er transkriptions- inducerede kimærer, som udtrykkes i lave niveauer i de fleste prøver. De tilsvarende fusion udskrifter induceret af genomiske omlejringer observeret i enkelte cancer cellelinjer kan alligevel har onkogent potentiale som foreslået i den oprindelige undersøgelse, som Bass et al

Henvisning:. Nome T, Hoff AM, Bakken AC, Rognum TO, Nesbakken A, Skotheim RI (2014) High Frequency af Fusion Afskrifter Inddragelse

TCF7L2

i kolorektal cancer: Novel Fusion Partner og Splice Varianter. PLoS ONE 9 (3): e91264. doi: 10,1371 /journal.pone.0091264

Redaktør: Nathan A. Ellis, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: 16 oktober, 2013; Accepteret: 10. februar, 2014 Udgivet: 7 marts 2014

Copyright: © 2014 Nome et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret af tilskud fra det norske Cancer Society (TN og AMH blev finansieret som ph.d.-studerende fra PR-2007-0166 tilskud til RIS), NorStore (til lagring af datafiler; -projektet NS9013K), og dels støttet af forskningsrådet Norge gennem sine Centres of Excellence finansieringsordning, projekt nummer 179571. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklærede, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den anden mest almindelige og dødelige kræftsygdom verdensomspændende [2], og der er stor efterspørgsel på gode biomarkører for både tidlig opsporing og at stratificere patienterne efter prognose og forudsagde behandlingsreaktioner. Men CRC er en heterogen sygdom, og få biomarkører endnu gjort det til rutinemæssig klinisk brug.

Fusion gener udgør en klasse af cancer gener med lovende biomarkør potentiale, og når forårsaget af kromosomale omlejringer såsom translokationer, sletninger eller gentagelser, de er almindeligt meget kræft specifik. Hidtil har par stærkt tilbagevendende fusionsgener blevet identificeret i CRC. Eksempler fra andre typer kræft omfatter den velkendte

BCR-ABL1

fusion (Philadelphia kromosom), til stede i 95% af kronisk myeloid leukæmi [3], og

TMPRSS2-ERG

som er til stede i omkring 50% af prostatacancere [4]. I nogle tilfælde kan fusionsgenet være et terapeutisk mål, demonstreret ved Imatinib binding til og blokering kinasedomænet af BCR-ABL1 fusionsprotein.

Den første fusionsgen rapporteret at være tilbagevendende i CRC, fusing sekvenser af

VTI1A

og

TCF7L2

, blev rapporteret i 2011 [1].

VTI1A-TCF7L2

fusionstranskripter blev påvist i tre ud af 97 (3%) CRCs, samt coloncancercellelinie NCI-H508. I NCI-H508, er fusionen forårsaget af en ~540 kb sletning mellem generne

VTI1A

og

TCF7L2

.

TCF7L2

koder TCF4 transskription faktor, som dimeriserer med β-catenin. β-catenin er involveret i reguleringen af ​​WNT-signalvejen, som er almindeligt ændres i de fleste, om ikke alle, CRCs [5]. Udtømning af

VTI1A-TCF7L2

fusion udskrift resulteret i væsentligt tab af forankring uafhængig vækst i fusion positive CRC cellelinie NCI-H508 [1].

Hyppige mutationer i en polyadenine tarmkanalen i

TCF7L2

gen er tidligere blevet rapporteret for CRC, især i mikrosatellit instabile tumorer [6]. Mikrosatellit stabile tumorer har dog også for nylig vist at huse hyppige mutationer i

TCF7L2

gen, hvilket indikerer en mulig vigtig funktion i CRC biologi [7].

I denne undersøgelse vi sigter til yderligere at undersøge tilstedeværelsen og varianter af

VTI1A

–

TCF7L2

fusioner i CRC. Vi har analyseret dyb sekventering hele-genom og transkriptom data fra CRC efter relaterede fusioner, der involverer en af ​​de fusionspartnere, og for nye fusion breakpoints. Den gentagelse af

VTI1A-TCF7L2

fusion, og en ny fusion udskrift mellem

TCF7L2

og romanen partner genet

RP11-57H14.3,

blev analyseret i en serie af CRC’er og normale prøver.

Materialer og metoder

Materiale

i alt 106 CRC vævsprøver og 14 parrede normale prøver fra to uafhængige patient- serier, serie 1 og serie 2, blev screenet for tilstedeværelsen af ​​fusionstranskripter. Alle CRC’er er fra patienter, der behandles kirurgisk ved hospitaler i Oslo-området, Norge. De to patient serien omfattede både mikrosatellit stabil (n = 85) og ustabil (n = 20) CRC’er (en prøve ikke scoret), som vurderet ved tidligere undersøgelser [8] – [10]. Serien blev beriget til kliniske stadier II og III CRC (52 trin II, 53 fase III, og 1 fase IV). Iscenesættelse var i overensstemmelse med den amerikanske Joint Cancer Udvalg /Union for International Cancer Control (AJCC /UICC). De 14 parrede normale prøver fra Serie 1 blev indsamlet fra visuelt sygdomsfri områder af colon mucosa. Forskningsresultaterne biobanker er blevet registreret i henhold til national lovgivning, og undersøgelsen er blevet godkendt af det regionale udvalg for Medical Research Ethics (tal 2781 og 236-2005-16141).

I alt 21 kolorektale cellelinjer var inkluderet [11]. Cellelinierne HCT116, HCT15, LoVo, NCI-H508, RKO, SW48, og SW620 blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). De cellelinier Co115, Colo320, EB, FRI, HT29, IS1, IS2 IS3, LS1034, LS174T, SW480, TC7, TC71, og V9P blev venligst stillet til rådighed af Dr. Richard Hamelin, Inserm, Frankrig. Identiteter af cellelinjer blev verificeret af AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems af Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

Desuden har vi screenet tyve normale væv fra diverse steder i kroppen til

TCF7L2

involverer fusionstranskripter (adipose, blære, hjerne, cervix, colon, spiserør, hjerte, nyre, lever, lunge, ovarie, placenta, prostata, skeletmuskulatur, milt, mave, testes, thymus, thyroidea og luftrør ; FirstChoice Humant Normal Tissue Totalt RNA, hver en pulje af RNA fra mindst tre personer, med undtagelse af en individuel prøve fra maven;. Ambion, Applied Biosystems af Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)

Identifikation af Fusions fra Whole-transkriptom og Whole-genom sekventering data

Parret-end RNA-sekventering data fra syv kolorektale cancer cellelinier (HCT15, HCT116, HT29, LS1034, RKO, SW48, og SW480) og fra 16 normale væv fra diverse oprindelser blev inkluderet i undersøgelsen. Disse blev alle sekventeret ved hjælp af Illumina GAIIx (cellelinjer) eller HiSeq 2000 (normale væv, begge sequencere fra Illumina Inc., San Diego, CA, USA). De tyktarmskræft RNA-seq data inkluderet 220 mio 76 bp sekvens læser (European Nukleotid Arkiv undersøgelse tiltrædelse ID ERP002049) [12], og de normale prøver indeholdt mellem 73 og 80 millioner 50 bp sekvens læser per prøve (ArrayExpress tiltrædelse id [E-mtab -513] og europæisk Nucleotide Archive undersøgelse [EMBL: ERP000546]). Desuden har vi fået parret-end hel-genom sekvenser af cellelinier HCT15, HCT116, HT29 og SW480 til en gennemsnitlig dækning på omkring 30 × [12] (Data kan stilles til rådighed efter anmodning til forskere).

En liste over potentielle fusion udskrifter blev produceret af afdramatisere udgave 0.6.0 [13] på de syv tidligere nævnte RNA-sekventeret cellelinjer ud over CRC cellelinje NCI-H508 (analyse id 0c7a79cc-bbaf-4c6d-93e1-866f5f5f3d0d ) downloades fra Cancer Genomics Hub (arrangeret af University of California Santa Cruz, Californien, USA), data fra Cancer Cell Linje Encyclopedia [14] og 16 væv fra Illumina human Body Map v2. For cellelinier med parret hel-genom-sekvens (HCT116, HCT15, HT29 og SW480), RNA fusionstranskripter og DNA breakpoints blev identificeret ved nFuse udgave 0.2.0 [15]. En fusion nominering krævede tre spænder læste par og to split læser fra RNA-seq data.

Påvisning af Fusion Afskrifter af Reverse-transkriptase PCR

For

VTI1A-TCF7L2

fusion, de samme RT-PCR-primere og nestede primere blev anvendt som i den oprindelige publikation [1]. For

TCF7L2-RP11-57H14.3

fusion blev primere og indlejrede primere designet til fusion udskrift breakpoint sekvens, som er identificeret ved afdramatisere, ved at udnytte Primer3 web software [16]. De optimale primersekvenser (tabel S1) blev yderligere bestilt fra BioNordika Norway AS (Oslo, Norge) og syntetiseret af Eurogentec (Liège, Belgien). Vi udførte følsom nested RT-PCR med 20 + 30 cykler for begge assays under anvendelse 50 ng cDNA fra hver prøve som input i første runde PCR. Produkterne af den første PCR blev fortyndet til en slutkoncentration på 1/200 i nested PCR. Den følgende cyklus-forløb blev anvendt til alle PCR-reaktioner: 15 minutter af HotStarTaq DNA polymerase aktivering ved 95 ° C, en tre-trins cyklus af denaturering i 30 sekunder ved 95 ° C, primerannealing i et minut og 15 sekunder ved optimal primer smeltning temperaturer (tabel S1) og udvidelse i et minut ved 72 ° C. Efter den sidste cyklus blev en endelig ekstension trin udføres ved 72 ° C i 6 minutter. De indlejrede-PCR-produkter blev separeret ved elektroforese ved 200 V i 30 minutter på en 2% agarosegel og visualiseret ved hjælp af ethidiumbromid og UV-lys. Triplo RT-PCR kørsler blev udført for begge assays under anvendelse af identiske parametre, for alle prøver. Ingen skabelon negative kontroller blev inkluderet fra hver cDNA syntese, første runde PCR og nested-PCR-reaktioner.

Sanger Sekventering af Fusion Transcript breakpoints

Prøver, der var positive for den anden replikat RT-PCR assays, og viste et enkelt nukleotid bånd på agarosegel, blev sekventeret direkte fra begge sider ved hjælp af fremadgående og tilbagegående nestede primere. Inden sekventering, de indlejrede PCR-produkter blev oprenset ved anvendelse ILLUSTRERET Exostar 1-trins oprydning (GE Healthcare, Little Chalfront, UK). Cyklus sekventeringsreaktioner blev udført under anvendelse af BigDye Terminator V.3.1 cycle-sekventeringskit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) efter leverandørens anbefaling. Desuden blev sekventeringsprodukter rengøres og oprenses under anvendelse BigDye Xterminator (Applied Biosystems), før de blev analyseret ved kapillar elektroforese under anvendelse af ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Sekvenserne blev analyseret ved hjælp af Sequencing Analysis v.5.3.1 software.

Vurdering af Identificerede Genomisk Breakpoint

TCF7L2-RP11-57H14.3

ved PCR

Den genomiske breakpoint identificeret fra hel-genom sekventering data, der forbinder

TCF7L2

til

RP11-57H14.3

i tyktarmskræft HCT116 blev valideret ved hjælp af PCR.

Primere til genomisk PCR (tabel S1) blev designet til den genomiske breakpoint sekvens, som identificeret ved nFuse under anvendelse af samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor for RT-PCR-assays. Enogtyve CRC cellelinjer, herunder HCT116, blev testet for den identificerede genomiske breakpoint anvendelse af 100 ng DNA som input til hver reaktion. Den følgende cyklus-forløb blev anvendt til den genomiske PCR: 15 minutter af HotStarTaq DNA polymerase aktivering ved 95 ° C, en tre-trins cyklus (gentages 35 gange) af denaturering i 30 sekunder ved 95 ° C, primerannealing i et minut og 15 sekunder ved 60 ° C og forlængelse i et minut ved 72 ° C. Efter den sidste cyklus blev en endelig ekstension trin udføres ved 72 ° C i 6 minutter. PCR-produkterne blev separeret ved elektroforese ved 200 V i 30 minutter på en 2% agarosegel, og fremkaldes med ethidiumbromid og UV-lys.

Resultater

RP11-57H14.3

er en roman Fusion Partner i

TCF7L2

indeholdende Fusion Udskrifter

for at søge efter den

VTI1A-TCF7L2

fusion og nye fusionspartnere, analyserede vi parret-end-RNA -sequencing data fra otte tyktarmskræft cellelinjer og seksten normale vævsprøver fra diverse anatomiske steder. Ved at anvende softwaren defuse, vi identificeret mellem 16 og 1050 potentielle fusion udskrifter per prøve. Fra hele genom sekventering data for fire tyktarmskræft cellelinjer, den nFuse software identificeret mellem 70 og 126 potentielle genomiske breakpoints. Af alle fusioner identificeret, kun NCI-H508 nærede den

VTI1A-TCF7L2

fusion afskrift, med en enkelt breakpoint spænder fra exon to i

VTI1A

til exon seks i

TCF7L2

, rapporteret som allerede for denne cellelinie af Bass et al. [1]. Men vi identificeret en genomisk breakpoint (chr10:114,850,371-114,640,318 (GRCh37)) i CRC HCT116 der strakte fra intron region

TCF7L2

til opstrøms af

RP11-57H14.3

(ENSG00000225292) med en tilsvarende RNA-fusion (tabel 1).

RP11-57H14.3

er beliggende i den intergeniske region mellem

VTI1A

og

TCF7L2

ca. 44 kb opstrøms for

TCF7L2

. De forudsagte genomiske breakpoints korrelerer med forøget genomisk dækning i regionen mellem dem, hvilket antyder en genomisk gentagelse forårsager fusion (figur 1). Både den genomiske breakpoint og fusion udskrift mellem

TCF7L2

RP11-57H14.3

blev verificeret ved PCR og RT-PCR. Den identificerede genomiske breakpoint blev verificeret i HCT116 cellelinie, men ikke påvist i nogen af ​​de testede, hvilket reducerer sandsynligheden for, at den genomiske breakpoint afspejler et fælles DNA kopital polymorfisme 20 andre cellelinjer.

Tre kimære RNA sekvens-læser spændte fusion udskrift breakpoint, der passerer fra exon 4 af

TCF7L2

(ENST00000369395) til exon 3 af

RP11-57H14.3

(ENST00000428766), på kromosom 10. Mørke farver angiver exons ikke en del af fusion udskrift. RNA-seq ekspression og DNA-seq dækningsniveauer er baseret på sekventeringsdata i HCT116 cellelinie. De to gen loci er markeret med blå og røde kasser. Den genomiske breakpoint sekvens som identificeret af nFUSE i CRC-cellelinien HCT116 er givet; spænder fra intron region

TCF7L2

til opstrøms af

RP11-57H14.3

. Koordinaterne til breakpoint (chr10:114,850,371-114,640,318 (GRCh37)) er markeret på kromosom position akse. Placeringen af ​​breakpoint korrelerer godt med den øgede genomiske dækning fremgår af genom sekventering data.

høj forekomst af

TCF7L2

-involving Fusion Afskrifter, Begge Inddragelse

VTI1A

og

RP11-57H14.3

Gener

Brug de samme primere som beskrevet af Bass et al. [1] (figur 2), vi har registreret

VTI1A-TCF7L2

fusion udskrifter med forskellige exon-exon kombinationer i 45 ud af 106 CRC prøver (42%) (tabel 2). Fusionstranskripter blev såvel påvist fra 4 af 14 normale tyktarmsslimhinde prøver. Ud af de 14 parrede tumor-normal prøver, otte par var positive udelukkende i tumor, tre par var positive i både tumor og normal, og et par positive udelukkende i normale (tabel 3). Udbredelsen af ​​fusion udskrifter var ens i mikrosatellitmarkørerne stabile og ustabile tumorer. Ti ud af 21 cellelinjer, herunder NCI-H508, nærede fusion udskrifter af forskellige størrelser. Endelig fem normale vævsprøver fra forskellige anatomiske steder af kroppen udtrykte fusionstranskripter (Tabel S2). Fordi RT-PCR-resultater viste inkonsistente resultater (Figur S1 og fig S2), udførte vi alle RT-PCR’er i tre eksemplarer, med identiske parametre, undersøge fornyet fusionstranskripter (Tabel S3). Fusion udskrifter blev kun påvist konsekvent i alle tre kørsler i fire prøver; tre tumor prøver og NCI-H508-cellelinje (3,1% af alle CRC prøver og cellelinier). Denne frekvens svarer til den oprindeligt identificeret frekvens på

VTI1A-TCF7L2

transkripter (3%) af Bass et al. [1].

Alle tre gener er placeret inden for 720

VTI1A

ENST00000428766 i

RP11-57H14.3

ENST00000369395 i

TCF7L2

. Desuden er de nestede PCR-assays der anvendes til påvisning af både fusionstranskripter vist. De røde og sorte pile repræsenterer første runde og anden runde primere, henholdsvis. Vejviser

Vi har detekteret

TCF7L2-RP11-57H14.3

fusion udskrifter med forskellige exon-exon kombinationer i 48 ud af 106 CRC prøver (45%; tabel 2). Ud af de 14 parrede tumor-normal prøver, fem par var positive udelukkende i tumor, og fire par var positive i både tumor og normal (tabel 3). 19 ud af 21 cellelinier, nærede fusionstranskripter af forskellig størrelse. Også 15 af 20 normale vævsprøver var positive for fusionstranskripter (Tabel S2). Som med

VTI1A-TCF7L2

fusion, vi udførte alle RT-PCR’er i tre eksemplarer til at undersøge en gentagelse af fusion udskrifter (Tabel S3). I alt var der 20 prøver, der gentagne gange testet positive for fusion udskrifter; seks tumorprøver, fem prøver fra normale væv og ni cellelinjer (herunder HCT116 cellelinie). Interessant, NCI-H508 cellelinje var negativ for

TCF7L2-RP11-57H14.3

fusion udskrifter i alle tre gentagelser.

Vi fandt ingen sammenhæng mellem CRC’er positive for

TCF7L2

indeholder fusion udskrifter involverer

VTI1A

RP11-57H14.3

(p = 0,33; Fishers eksakte test). Endvidere frekvenserne af fusion udskrifter var ikke signifikant forskellig mellem mikrosatellit ustabilt

vs.

Stabile tumorer, eller mellem kliniske stadier (data ikke vist).

Alle nested-PCR replikeres for begge analyser indeholdt negative kontroller uden skabelon. Disse negative kontrolreaktioner aldrig produceret påviselige PCR-produkter (Figur S1 og S2).

Kimære Sekvenser Generelt Overdækket Intakte exoniske Splice steder fra Partner Gener

Fra en af ​​RT-PCR løber, alle prøver, der var positive for fusioner og havde et enkelt PCR-produkt blev udvalgt til Sanger-sekventering af de kimære RNA-sekvenser for at identificere de præcise breakpoints. For

VTI1A-TCF7L2

(n = 25), vi opnåede sekvenser fra alle 25 sådan isoleret fusion transcript RT-PCR-produkter, hvor 24 ud af 25 havde sekvenser, der forbinder opstrøms sekvenser af exon 1, 2, 3, 5 eller 7 i

VTI1A

til nedstrøms sekvenser af exon 4 eller 6 i

TCF7L2

, med bevarelse af de samme exon-exongrænser som i de allerede kommenterede gen strukturer (ENST00000393077 i

VTI1A

ENST00000369395 i

TCF7L2

). Et sekventeret produkt ikke indeholder klare exon-exongrænser, men forbundet de to udskrifter i midten af ​​exon 7 i

VTI1A

6 i

TCF7L2

. I alt blev syv forskellige fusion breakpoints identificeret (tabel S3), herunder den oprindelige breakpoint mellem exon 2 af

VTI1A

og exon 6 af

TCF7L2

i NCI-H508 (figur 3) [1] . Denne præcise breakpoint blev ikke fundet i nogen af ​​de andre prøver, men de fleste af de intakte fusion udskrifter bestod af den samme del af

TCF7L2

(n = 17) med nogle har exon 4 af

TCF7L2

splejset til exon 6 (n = 7).

VTI1A

opstrøms bidrag varierede mere, har fem forskellige kombinationer forbinder til nedstrøms

TCF7L2

dele.

Sanger sekventering bekræftede den oprindelige fusion udskrift opdaget i NCI-H508, der viser den breakpoint sekvens spænder exon-exon overgange mellem exon 2 i

VTI1A

og exon 6 i

TCF7L2

. Bass et al. også opdaget tre andre fusionstranskripter ved indlejret-PCR. Men som udskrift annotation ikke var tilstrækkeligt beskrevet, er vi ikke i stand til at sige, om disse fusioner er identiske med nogle af de udskrifter, vi har identificeret.

For

TCF7L2-RP11-57H14.3 Hotel (n = 27), vi opnåede sekvenser fra alle 27 isoleret fusion udskrift RT-PCR-produkter, hvor 26 ud af 27 havde sekvenser forbinder sekvenser af exon 4 af

TCF7L2

til sekvenser af exon 1, 2 eller 3 i

RP11-57H14.3

, også med bevarelse af de samme exon-exongrænser som i de allerede kommenterede gen strukturer (exon nummerering er den samme som ovenfor for

TCF7L2

ifølge ENST00000428766 for

RP11-57H14.3

). En nysgerrig tilfælde af kimære sekvens, identificeret i CRC-cellelinje FRI, var en fusion udskrift spænder over tre gener i en ikke-kanonisk genomisk orden, slutter

TCF7L2

exon 4 med

VTI1A

exon 5 , 6 og 7, og yderligere strækker sig ind

RP11-57H14.3 Salg exon 1, 2, og 3. også i dette enestående tilfælde de samme exon-exongrænser blev anvendt som i de allerede kommenterede gen beskrevne strukturer over. I alt blev fire forskellige fusion udskrifter identificeret involverer

TCF7L2-RP11-57H14.3,

alle forekommer i flere prøver hver.

Diskussion

Vi har i denne rapport identificeret genet

RP11-57H14.

3 som en ny fusionspartner for

TCF7L2

i CRC. Ved følsom nested RT-PCR, har vi vist, at både de tidligere rapporterede

VTI1A-TCF7L2

fusion udskrifter, og heri identificerede

TCF7L2-RP11-57H14.3

, er meget hyppig blandt CRCs selv udtrykt ved lave niveauer. Vi har registreret også ekspression af fusionstranskripter i normal tyktarmsslimhinde, såvel som i normale væv fra andre anatomiske steder. Tredobbelte indlejrede-PCR’er at undersøge tilstedeværelsen af ​​

TCF7L2

involverer fusion udskrifter viste variable resultater, med nogle prøver oprindeligt testet positiv for en fusion afskrift, men negativ, når du udfører et træk løb, eller

omvendt

. Men Sanger sekventering resulterede i bekræftelse af ren exon til exon breakpoint vejkryds, hvilket reducerer sandsynligheden for, at PCR-artefakter, såsom polymerase skabelon skift [17], som en årsag til uoverensstemmelsen. Negative kontroller blev også udført på alle RT-PCR trin, herunder cDNA-syntese, første runde PCR og nested-PCR. Ingen af ​​de negative kontroller resulterede i påviselige produkter, understøtter, at den høje frekvens af fusionstranskripter observeret er ikke et resultat af PCR-kontaminering (fig S1 og figur S2). Selvom fusion udskrifter blev fundet ved høj frekvens inden de testede biobank materialer, identifikation af

TCF7L2

holdige fusioner fra hel-transkriptom sekventering data kun var en succes fra de to cellelinjer med matchende genomiske breakpoints. Disse to cellelinjer havde så godt have konsekvent stærke udtryk af fusion udskrifter, som de producerede konsekvente og klare RT-PCR-resultater i alle gentagelser. Baseret på disse resultater, foreslår vi, at fusion udskrifter produceret mellem

TCF7L2

enten

VTI1A

eller

RP11-57H14.3

udtrykkes ved lave niveauer i tumorprøver, og nogle normale prøver. Tilstedeværelsen af ​​fusion udskrifter udtrykt på et lavt niveau er i overensstemmelse med tre fusion udskrifter vi for nylig identificeret i CRC, hvor

AKAP13-PDE8A, COMMD10-AP3S1,

CTB-35F21.1-PSD2

blev identificeret i 17-58% af 106 primære kræft væv [12].

Alle tre partnerlande gener er placeret på den lange arm af kromosom 10, inden 721 kb, og er alle læses fra samme streng i for

VTI1A, RP11-57H14.3, TCF7L2

(figur 2). Dette tyder RNA polymerase gennemlæsning som en potentiel mekanisme til frembringelse af

VTI1A-TCF7L2

transkripter i fravær af en tilsvarende genomisk breakpoint. Adskillige rapporter har vist, at gener i umiddelbar nærhed i det humane genom er udtrykt som forbundne gener, også kaldet tandem kimærer, transkripter, der er kombineret med mindst en del af én exon fra to eller flere distinkte gener, der ligger på det samme kromosom [18] – [20]. Det er blevet foreslået, at ekspressionen af ​​forbundne gener øge kompleksiteten af ​​det humane genom ved at oversætte i adskilte proteiner, eller at disse transkripter spiller en rolle i regulering af kanoniske transkriptniveauer. En foreslåede mekanisme for deres generation er at transkriptionsmaskineriet undgår termineringssignalet af opstrøms genet og fortsætter transskription af nedstrøms-genet før afslutning ved den nedstrøms termineringssignalet [19], [21]. De fleste af de konjunktion gener menes at blive udtrykt på et lavt niveau, da de ofte er understøttet af kun en enkelt udtrykt sekvens tag eller mRNA sekvens i genom databaser, hvilket er i tråd med vores observationer af svagt udtrykt

TCF7L2

holdigt fusion udskrifter i CRC.

generation af

VTI1A-TCF7L2

udskrifter kan vel forklares som et produkt af polymerase read-igennem, men det kan ikke være den mekanisme af drift i den

TCF7L2-RP11-57H14.3

fusion udskrifter. I dette tilfælde de exons af

TCF7L2

RP11-57H14.3

er splejset sammen i et ikke-kanonisk genomisk rækkefølge konsensus splice-sites. Denne transkriptionel mekanisme er tidligere blevet beskrevet af Nigro et al. som exon scrambling; en proces, hvor exoner forenes præcist ved konsensus splejsningssteder, men i en rækkefølge forskellig fra den foreliggende i det primære transkript [22]. De opdagede dette fænomen, når de efterforsker en kandidat tumorsuppressorgen (

DCC

), og identificeret, at de resulterende forvrænget udskrifter udtrykkes og findes på relativt lavt niveau i både normale og neoplastiske celler. For nylig, baseret på dyb sekventering af RNA blev sådanne scrambled udskrifter fra hundredvis af gener identificeret [23]. Denne gruppe foreslog også, at en væsentlig del af de krypterede transkripter er cirkulære RNA’er, som forklarer sammenføjning af exoner i en ikke-kanonisk lineær orden. De fandt også, at mange af de cirkulære isoformer var til stede på et niveau svarende til deres kanoniske lineære modstykker.

Alt i alt, disse ekstra niveauer af transkriptionel og genomisk kompleksitet er i tråd med den seneste rapport fra KODE projektet, rapportering væsentlig reduktion i længderne af intergeniske regioner og i stigende grad overlappende gener hidtil antaget at være selvstændig genetisk loci, helt at spørge en ny definition af begrebet et gen [24].

identifikationen af ​​genomiske breakpoints i individuelle cellelinier for

TCF7L2

fusioner både involverer

VTI1A

og

RP11-57H14.3

, er spændende. De genomiske breakpoints identificeret sammenfaldende godt med de hyppigst observerede fusion udskrifter opdaget i andre prøver, der ikke har sådanne genomiske omlejringer. For cellelinier med identificerede genomiske breakpoints, påvistes de fusionstranskripter på stærke niveauer i alt RT-PCR replikerer, hvilket antyder, at disse celler udtrykker fusionstranskripter på højere niveauer. Desuden cellelinje med

VTI1A-TCF7L2

genomisk fusion (NCI-H508) blev negativ for

TCF7L2-RP11-57H14.3

fusion udskrifter i alle gentagelser, der understøtter ~540 kb genomisk sletning af intergeniske region mellem

VTI1A

og

TCF7L2

oprindeligt identificeret af Bass et al.

tilstedeværelsen af ​​fusion udskrifter i både normale celler og CRC prøver sammen med identifikation af genomiske breakpoints fra individuelle kræftceller, der forbinder de samme to gener på genomet niveau, er i tråd med rapporten fra fusion udskrift

JAZF1-JJAZ1

identificeret i både normale endometrie stromale celler og endometriske stromale tumorer [25].

JAZF1-JJAZ1

kan påvises på udskrift niveau i normal endometrie stromale celler, men genomiske rearrangementer findes kun i de neoplastiske celler. Li et al. hypotesen, at trans-splejsende generere disse fusionstranskripter, samt andre fusionstranskripter, kan forekomme regelmæssigt i normale celler og væv. Endvidere foreslår de, at der kan være en sammenhæng mellem trans-splejsende generere disse fusionstranskripter og genereringen af ​​de genomiske rearrangementer [26]. De genomiske omlejringer eller andre mekanismer kan føre til overekspression af disse fusionstranskripter, som kan have onkogent potentiale.

Betydningen af ​​genet

TCF7L2

i CRC udvikling begunstiges af dens funktion.

TCF7L2

koder for TCF4 transskriptionsfaktoren, som er en vigtig nedstrøms transkriptionsfaktor i WNT /β-catenin-signalvejen, ændres i størstedelen af ​​CRCs [5]. Den oprindelige rapport

VTI1A-TCF7L2

fandt, at nedbrydningen af ​​fusion udskrift resulteret i væsentligt tab af forankring uafhængig vækst i fusion positive CRC cellelinie NCI-H508 [1]. Hyppige mutationer i en polyadenine tarmkanalen i

TCF7L2

gen er tidligere blevet rapporteret for CRC, især i mikrosatellitmarkørerne ustabile tumorer [6]. Endvidere mikrosatellit stabile tumorer er for nylig blevet vist, at huse hyppige mutationer i

TCF7L2

[7]. Den observation, at

TCF7L2

involverer fusion udskrifter kan påvises i en så stor del af CRC prøver, men også normale colon mucosa og andre normale vævstyper, afslører, at

TCF7L2

fusion udskrifter er hverken specifikke til cancer eller til tyktarmen og endetarmen. Derfor behøver de ikke har potentiale som kræft afsløring biomarkører som oprindeligt forventet.