PLoS ONE: miR-26a Undertrykker Tumor vækst og metastase ved Målretning FGF9 i Gastric Cancer

Abstrakt

rolle miR-26a i cancerceller syntes kontroversielt i tidligere undersøgelser. Hidtil rolle MIR-26a i gastrisk cancer forbliver udefineret. I denne undersøgelse fandt vi, at MIR-26a var stærkt nedreguleret i gastrisk cancer (GC) væv og cellelinier, og dens ekspressionsniveauer var forbundet med lymfeknudemetastaser og kliniske stadium, samt samlet overlevelse og replase overlevelse af GC . Vi fandt også, at ektopisk udtryk for miR-26a hæmmede GC celledeling og GC metastaser

in vitro

in vivo

. Vi yderligere identificeret en ny mekanisme for miR-26a til at undertrykke GC vækst og metastase. FGF9 blev vist sig at være et direkte mål for miR-26a, hjælp luciferaseanalyse og western blot. FGF9 overekspression i MIR-26a-udtrykkende celler kunne redde invasion og vækst defekter af miR-26a. Desuden MIR-26a-ekspression omvendt korreleret med FGF9 proteinniveauer i GC. Tilsammen vores data tyder på, at miR-26a fungerer som en tumor suppressor i GC udvikling og progression, og lover som en prognostisk biomarkør og potentiel terapeutisk mål for GC

Henvisning:. Deng M, Tang Hl, Lu Xh, Liu Min, Lu Xm, Gu Yx, et al. (2013) miR-26a Undertrykker Tumor vækst og metastase ved Målretning FGF9 i Gastric Cancer. PLoS ONE 8 (8): e72662. doi: 10,1371 /journal.pone.0072662

Redaktør: H. Sunny Sun, Institut for Molekylær Medicin, Taiwan

Modtaget: 29, 2013; Accepteret: 12 Juli 2013; Udgivet: 28 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Deng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Natur Videnskabelige Foundation of China (81101526, 31100936) og Guangzhou Medical College Læge Start Foundation (2012C11). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

miRNA er endogent udtrykt, små ikke-kodende RNA, der negativt regulerer genekspression ved at forårsage nedbrydning af target mRNA, hæmning af oversættelsen af ​​disse mRNA eller begge [1]. miRNA tage del i vigtige cellulære processer, såsom stress respons, udvikling, differentiering, apoptose og proliferation [2]. Altered miRNA ekspression er blevet rapporteret i mange maligniteter, herunder bryst- [3], [4], lunge [5], lever [6], mave [7], colon [8], hjerne [9], leukæmi [10], og lymfom [11]. Et stigende antal undersøgelser har vist, at miRNA kan fungere som onkogener eller tumor undertrykkere, og de er ofte dysreguleret i tumorer [12], [13]. I denne henseende er onkogene miRNA ofte opreguleres, mens tumor-undertrykke miRNA er nedreguleret i tumorer. For eksempel har lad-7 blevet rapporteret at være underexpressed i lungekræft og målrette den onkogene Ras [14], [15]. Vi har tidligere rapporteret, at MIR-216b stærkt nedreguleres i nasopharyngeal carcinom og dæmper tumorvækst ved at målrette KRAS [16]. I modsætning hertil er det onkogene miR-17-92 klynge af miRNA opreguleret i forskellige tumor [17], og håndhæves udtryk for disse miRNA i godt undersøgt Eu-myc transgen musemodel af B-celle lymfom dramatisk accelererer sygdommens opståen og udvikling [18]. Imidlertid rolle MIR-26a i cancerceller syntes kontroversielt, da det er en tumorsuppressor i hepatocellulært carcinom [19], brystcancer [20] og nasopharyngeal carcinom [21], [22], men som et onkogen i gliom [23 ] og cholangiocarcinom [24]. Hidtil rolle MIR-26 i gastrisk cancer var udefineret.

I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi MIR-26a-ekspression i 40 parrede normale og GC prøvemateriale ved kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) analyse . MIR-26a viste sig at være stærkt nedreguleret i GC væv sammenlignet med den for tilstødende normale mave væv. Dette resultat blev yderligere bekræftet ved in situ hybridisering på væv microarrays bestående af 126 tilfælde af GC væv og 41 tilfælde af hosliggende normale væv. Desuden faldt miR-26a var forbundet med dårlig prognose og kan uafhængigt forudsige samlet overlevelse (OS) og replase overlevelse (RFS) i mavekræft. Funktionelle undersøgelser viste, at miR-26a undertrykt GC cellevækst og metastase ved at målrette FGF9.

Resultater

miR-26a nedreguleres i Human Gastric Cancer

Ved hjælp af en QRT-PCR fremgangsmåde blev mIR-26a-niveauer detekteret i 40 par af mavekræft væv og deres matchede tilstødende væv, såvel som gastriske cellelinier. Blandt de 40 patienter med gastrisk cancer, ca. 70% (28 af 40 patienter) af tumorer afslørede en mere end to-fold reduktion i MIR-26a-niveauer, med en 5,76-gange reduktion i forhold til tilstødende normale væv, hvilket antyder, at reduktion af miR -26a var en hyppig begivenhed i menneskets GC (figur 1A). Desuden blev miR-26a udtryk reduceret i alle gastrisk cancer cellelinjer (MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, og BGC-823) sammenlignet med ikke-malign gastrisk cellelinie GES-1 (figur 1B). For yderligere at verificere resultaterne vedrørende biologiske rolle miR-26a i human gastrisk carcinogenese, vi ansat in situ hybridisering til at evaluere miR-26a udtryk i 126 GC’er og 41 ikke-tumorvæv på væv microarrays (TMAS). Resultaterne viste, at udtrykket snesevis af MIR-26a blev signifikant reduceret i GC’er sammenlignet med normale væv (figur 1C). Dernæst vi bestemt de potentielle klinisk-patologiske konsekvenser af ændret miR-26a udtryk. Kliniske prøver blev inddelt i lav ekspression og høje ekspressionsniveauer grupper baseret på MIR-26a udtryk scorer større eller mindre end medianen. I overensstemmelse med ovennævnte data ud af 41 total normale mave prøver, 35 (85%) havde høj ekspression af miR-26a. I modsætning hertil 60% (76 af 126) af gastrisk carcinoma prøver havde lav til negativ ekspression af MIR-26a. Af de 126 personer med GC, 38 var negative for lymfeknudemetastaser, og 45% af disse patienter havde lav til negativ ekspression af MIR-26a (tabel 1). Otteogfirs patienter var positive for lymfeknudemetastaser, og 67% af dem viste nedregulering eller tab af MIR-26a (tabel 1). Endvidere fandt vi lav ekspression af MIR-26a i 37% og 77% af gastriske tumorer klassificeret som fase I /II og trin III /IV (tabel 1). Derfor miR-26a udtryk omvendt korrelerer med lymfeknude metastaser og klinisk fase (

P

= 0,019 og

P

0,001 henholdsvis). Desværre fik miR-26a ikke korrelerer med alder, køn, celledifferentiering, eller invasion dybde (T etape). Disse resultater antyder, at MIR-26a kan spille en kritisk rolle i GC metastase og progression.

(A) MIR-26a blev påvist i 40 mavecancerpatienter ved QRT-PCR. Data er vist som log2 af folden ændring i gastrisk cancer væv (tumor) i forhold til tilstødende normale væv (normal). (B) Relativ ekspression af MIR-26a i 6 cellelinjer afledt fra gastrisk cancer og en ikke-malign gastrisk cellelinie (GES-1) blev bestemt ved QRT-PCR. Data er vist som log2 af folden ændring i GC cellelinier i forhold til GES-1. (C) MIR-26a-ekspression blev analyseret i tilgrænsende normale væv (Normal) og GCS (tumor) prøver på vævet mikroarrays ved in situ hybridisering. Expression scoringer vises som box plots. Repræsentative billeder af MIR-26a-ekspression ved in situ-hybridisering er vist. Original forstørrelse: × 200. (D) Overlevelse analyse af GC. OS og RFS kurverne for 126 GC patienter med høj eller lav miR-26a udtryk blev konstrueret ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden og evalueret ved brug af log-rank test.

Nedsat miR-26a korrelerer med dårlig klinisk prognose

for yderligere at analysere betydningen af ​​miR-26a i form af klinisk prognose, blev Kaplan-Meier overlevelse analyse udført ved hjælp af patientens samlede overlevelse og tilbagefald overlevelse. Resultaterne viste, at patienter med lav miR-26a udtryk havde kortere median OS og RFS end patienter med høj miR-26a udtryk (21,6 måneder vs 39,0 måneder,

P

0,001 til OS, 15,2 måneder vs . 31,6 måneder,

P

= 0,002 for RFS, figur 1D). Vi brugte Cox proportional-farer regression for yderligere at vurdere sammenhængen mellem miR-26a udtryk og prognose. I univariat analyse, lymfeknudemetastase, TNM stadie, og MIR-26a-niveauer var signifikant forbundet med OS og RFS (tabel 2, 3). Den endelige multivariate model viste, at den samlede overlevelsestid væsentligt afhang lymfeknudemetastaser, TNM stadie, og MIR-26a-niveauer (tabel 2), og tilbagefald overlevelsestid gjorde på lymfeknudemetastaser og MIR-26a-niveauer (tabel 3).

miR-26a Undertrykker GC vækst og metastase

noterer den inverse korrelation mellem miR-26a niveauer og metastase, undersøgte vi effekten af ​​miR-26a re-udtryk på migrationen og invasion evner GC-cellelinjer. To GC cellelinjer (SGC-7901 og AGS) med forholdsvis lav basal udtryk for miR-26a (figur 1B) smittet med enten miR-26a eller kontrol lentivirus og udvalgt med 5 mg /l puromycin i to uger. Dernæst sårheling assay og transwell assay blev udført. Som forventet overekspression af MIR-26a undertrykte signifikant cellemigration og invasion evner (figur 2A, B, figur S1).

(A, B) den sårhelende assay (A) og invasion assay (B), i SGC-7901 og AGS celler inficeret med miR-26a eller scramble lentivirus. Invasionen assay blev målt ved hjælp af Transwell assays med Matrigel. (C) Væksten af ​​SGC-7901 og AGS celler inficeret med miR-26a eller scramble lentivirus blev analyseret. (D) Colony vækst analyser i blød agar blev udført på SGC-7901 med overekspression af miR-26a eller scramble. Repræsentative billeder af assays er vist (venstre panel). Original forstørrelse: × 200. (E) Overekspression af MIR-26a inducerer tumorcelle apoptose. SGC-7901 celler blev inficeret med miR-26a eller scramble lentivirus. De apoptotiske celler blev evalueret ved Annexin V-FITC og propidium iodfarvning og analyseret med FACS. Alle data er presented.as gennemsnit ± sem fra mindst tre separate eksperimenter.

For at demonstrere effekten af ​​miR-26a på GC vækst, vi udførte GC celleproliferationsassay. Spredningen assay viste, at ektopisk udtryk for miR-26a i SGC-7901 og AGS svækkede celledeling i forhold til kontrol-celler (Figur 2C). Desuden ektopisk MIR-26a-ekspression inhiberes kolonidannelse evne i blød agar (figur 2D). Vi derefter udført celleapoptose analyse og viste, at MIR-26a overekspression i SGC-7901 induceret celle apoptose (figur 2E).

Dernæst testede vi, om MIR-26a kunne spille en rolle i tumorigenese ved at anvende nøgne mus xenograft modeller. Vi fandt, at overekspression af MIR-26a i SGC-7901 celler undertrykte signifikant tumorvækst i nøgne mus (figur 3A, figur S2). Derefter blev SGC-7901 celler inficeret med enten MIR-26a eller bekæmpelse lentivirsus injiceret i halevenen hos nøgne mus for at undersøge lunge metastase. Som vist figur 3B kunne observeres en signifikant lavere antal makroskopiske lungemetastaser i MIR-26a overudtrykker celler end kontrolceller. Disse resultater indikerer, at MIR-26a kan undertrykke GC vækst og metastase.

(A) tumorvækst i mus xenograftmodeller. SGC-7901 celler inficeret med MIR-26a eller scramble lentivirus blev injiceret subkutant i nøgne mus. Tumorstørrelse blev målt hver 5 dage. Efter 30 dage blev musene aflivet, obduktioner blev udført, og tumorer blev vejet. (B) tumormetastase i mus xenograftmodeller. SGC-7901 celler med overekspression af MIR-26a eller scramble blev injiceret i halevenen hos nøgne mus. Efter 45 dage blev musene aflivet. mikrometastaser i lunge pr HE-farvede sektion i individuelle mus blev beregnet. Hver gruppe havde seks mus. Original forstørrelse, × 100; Målestokken: 50 um. Alle data er vist som gennemsnit ± sem

miR-26a Direkte Mål og Hæmmer FGF9

For at forstå hvordan miR-26a undertrykker GC vækst og metastase, vi brugte tre algoritmer (Targetscan, Pictar og Miranda) at hjælpe med at identificere miR-26a mål i humane gastrisk kræft. Af disse målgener, der blev forudsagt af alle tre algoritmer (tabel S1), FGF9 tiltrukket vores opmærksomhed straks som det er blevet impliceret i tumorgenese eller metastase [26] – [28]. Vi klonede fuldlængde FGF9 3′-UTR i en luciferase reporter vektor. Luciferase assay viste, at MIR-26a direkte bundet til FGF9 3′-UTR, og hvorved det bemærkelsesværdigt reduceret luciferaseaktiviteter (figur 4A). Imidlertid mutation af de formodede MIR-26a sites i 3′-UTR af FGF9 ophæves luciferase kan reagere på MIR-26a (figur 4A). Til direkte vurdere virkningen af ​​MIR-26a på FGF9-ekspression, udførte vi western blot-analyse. Som det ses i figur 4B, lentiviral induceret ektopisk MIR-26a dramatisk undertrykt FGF9 proteinniveauer i SCG-7901 og AGS celler. Endvidere knockdown af MIR-26a, gennem transfektion af anti-MIR-26a, i GES-1-celler forøgede FGF9 proteinniveauer (figur 4B; fig S1). Taget sammen indikerer disse resultater, at FGF9 er en direkte nedstrøms target for MIR-26a i GC-celler. Ovenstående resultater fik os til at undersøge, om miR-26a undertrykker GC vækst og metastase gennem undertrykke FGF9 udtryk. Til dette formål FGF9 blev igen udtrykt i MIR-26a-transficerede SGC-7901 celler. I MIR-26a-udtrykkende celler, re-ekspression af FGF9 reddet invasion og vækst defekter af MIR-26a (figur 4C, D, E). Endelig har vi testet hvis miR-26a udtryk korreleret med FGF9 protein niveauer i GC. Der var en omvendt korrelation mellem FGF9 proteinniveauer, angivet ved immunhistokemi farvning, og MIR-26a-ekspression vurderet ved in situ hybridisering i 126 GC væv på TMAs som anvendt ovenfor (fig 4F; Figure1C). Vores resultater viser, at MIR-26a har egenskaber i overensstemmelse med tumorsuppressorfunktion. Evnen til at modulere FGF9 niveauer kan forklare, i det mindste delvis, hvorfor MIR-26a kan hæmme GC vækst og metastase.

(A) den 3′-UTR element i FGF9 messenger RNA er delvis komplementær til miR- 26a. MIR-26a eller scramble-kontrol og luciferase reporter indeholdende enten en vildtype eller en mutant 3′-UTR blev co-transficeret ind i HEK-293T-celler. Og en Renilla luciferase udtrykker konstruktion udøver som intern kontrol. (B) Western blot-analyse af FGF9 ekspression i SGC-7901 og AGS celler inficeret med MIR-26a, og GES-1 transficeret med MIR-26a-inhibitorer (anti-MIR-26a). (C, D, E) FGF9 modvirker den undertrykkende roller MIR-26a i GC celleinvasion og vækst. SGC-7901 celler stabilt udtrykker miR-26a eller kapløbet blev transfektion med eller uden FGF9 plasmider. Invasion assays (C), Apoptosis analyse (D), og Celleproliferation analyse (E) blev udført med ovennævnte celler som beskrevet i Materialer og Metoder. Data er præsenteret som middelværdi ± sem fra mindst tre uafhængige forsøg. (F) Spearmans korrelation scatter plot af indholdet af miR-26a (bestemt ved in situ hybridisering) og FGF9 protein (bestemt ved immunhistokemi) i 126 GC prøver. Repræsentative billeder af FGF9 ekspression ved immunhistokemi er vist (højre panel). Original forstørrelse:. × 200

Diskussion

MIR-26a tilhører miR-26 familien, som indeholder et andet medlem miR-26b, som begge hus identisk sekvens med undtagelse af 2 forskellige nukleotider i modne miRNA. miR-26a er en funktionel miRNA, der har fortjent tidligere undersøgelse [29]. Det er kendt, at MIR-26a spiller en væsentlig rolle i vækst, udvikling og celledifferentiation af forskellige væv [29]. Flere undersøgelser har vist, at MIR-26a-ekspression er forstyrret i en række humane tumorer [19], [22], [24], [30], [31]. Imidlertid er ingen af ​​disse undersøgelser relateret til gastrisk cancer. I den aktuelle undersøgelse, vi brugte QRT-PCR og ISH at vise, at miR-26a niveauer i gastrisk kræft væv var betydeligt lavere end i ikke-tumorvæv. Desuden blev de MIR-26a, der er forbundet med den kliniske fase og tilstedeværelse af lymfeknudemetastaser. Kaplan-Meier overlevelse analyse viste, at patienter, hvis primære tumorer viste lav ekspression af MIR-26a havde en kortere OS og RFS i GC. Desuden viste Cox proportional-risiko regressions analyse, reduceret miR-26a i tumorer var en stærk og uafhængig prædiktor for kortere OS og RFS. Baseret på array-data blev det tidligere rapporteret, at en kombination af flere miRNA kan være nyttige som prognostiske markører i gastrisk cancer [32], [33]. Derudover en enkelt miRNA, såsom MIR-218, kan være en prognostisk indikator [34]. Men disse miRNA er blevet undersøgt i kun et par mavecancerpatienter,. Her kan MIR-26a være nyttig som en prognostisk markør til at forudsige overlevelse og tilbagefald i gastrisk cancer.

Denne undersøgelse viste, at ektopisk ekspression af MIR-26a i GC-celler nedsat migration, invasion, proliferation og kolonivækst som samt induceret apoptose. Endvidere demonstrerede in vivo data MIR-26a inhiberede tumorvækst og metastase. Disse in vitro og in vivo data indikerer endvidere, at MIR-26a fungerer som en tumorsuppressor i gastrisk cancer. Flere undersøgelser understøtter vores resultater. For eksempel er dette miRNA faldt i NPC væv og kan dæmpe cellevækst og tumorigenese ved at målrette EZH2 [22]. Hepatocellulært carcinom udviser også reduceret ekspression af MIR-26a [19]. Systemisk administration af denne miRNA i en musemodel af HCC anvendelse af en adenoassocieret virus (AAV) resulterer i inhibering af cancercelleproliferation, induktion af tumorspecifikke apoptose og dramatiske beskyttelse mod sygdomsprogression uden toksicitet [35]. Men afslørede forskellige nyere undersøgelser onkogene rolle miR-26a i tumorer såsom gliom og cholangiocarcinom. Huse et al. rapporterede, at miR-26a blev overudtrykt i high-grade gliom og direkte målrettet PTEN [23]. Tilsvarende blev MIR-26a fundet at være overudtrykt i humane cholangiocarcinom væv og fremme cholangiocarcinom vækst ved at aktivere B-catenin [24]. Disse kontroversielle resultater tydede på, at den rolle, miR-26a var muligvis tumor specifikke og meget afhængige af sine mål i forskellige kræftceller. Forskellige undersøgelser har vist, at PTEN [23], EZH2 [21], [22], SMAD1 [36], CDK6 og cyclin E1 [37] er potentielle nedstrøms målgener af MIR-26a. I denne undersøgelse FGF9, en ny direkte og funktionelle mål for MIR-26a, blev identificeret i GC. FGF9, også kendt som glial aktiverende faktor, er en af ​​23 medlemmer af stærkt bevaret FGF-familien. Som et udskilt glycosyleret 26 kDa-protein, har det mitogene virkninger på en række forskellige celletyper [26]. FGF9 har vist sig at være impliceret i forskellige cancertyper, såsom ovariecancer endometrioide adenocarcinom [26], hepatocellulært carcinom [27] og prostatacarcinom [28]. I vores undersøgelser har vi bekræftet, at FGF9 var et direkte mål for miR-26a i GC celler. For at bestemme om miR-26a undertrykker GC vækst og metastase gennem undertrykke FGF9 udtryk, fandt vi, at FGF9 overekspression kunne redde invasion og vækst defekter af miR-26a. Disse resultater antydede, at MIR-26a inhiberer GC vækst og metastase dels ved at målrette FGF9.

Taget sammen, vi observerede nedregulering af MIR-26a i gastriske cancerceller og viste, at MIR-26a kan virke som en uafhængig forudsiger af OS og RFS. Vi fandt endvidere, at MIR-26a besidder styrken til at undertrykke GC vækst og metastase ved regulering FGF9. Vores resultater tyder miR-26a fungerer som en tumor suppressor i GC og har lovende som en prognostisk biomarkør og potentiel terapeutisk mål for GC.

Materialer og metoder

Cell Culture

den gastriske epithel cellelinie GES-1 blev købt fra Beijing Institute for Cancer Research (Beijing, Kina). De GC cellelinjer MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, og BGC-823 blev opnået fra Chinese Academy of Medical Science (Beijing, Kina). Disse celler blev holdt ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2 i RPMI-1640 (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901), DMEM (GES-1) eller F12 ( AGS) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, penicillin og streptomycin (Gibco BRL, NY, USA). Alle transfektioner brugte lipofectamin 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, USA)).

kliniske prøver

Alle vævsprøver, der anvendes i den foreliggende undersøgelse blev indsamlet fra Hunan Provincial Tumor Hospital (Changsha, Hunan, Kina). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Guangzhou Medical University Health Authority. Indsamling og anvendelse af væv fulgt de procedurer, der er i overensstemmelse med de etiske standarder, som er formuleret i Helsingfors-erklæringen

Vævsprøver fra 40 patienter mavekræft (23 mænd og 17 kvinder,. Medianalder 59 år; rækkevidde 40-84 år) blev anvendt til kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) analyse. Resekteres ondartede væv (tumor) og parret matchede normale gastriske væv (Normal) blev straks skåret, frosset i flydende nitrogen og holdes ved -80 ° C indtil RNA ekstraktion.

væv microarrays (TMA’er), der består af 126 GCS og 41 hosliggende normale mave væv, blev anvendt til in situ-hybridiseringsanalyse. Den mediane alder af mavecancerpatienter ved diagnose var 57 år (spændvidde 31-82). Den mediane follow-up tid for samlet overlevelse (OS) og tilbagefald overlevelse (RFS) var 22 måneder og 15 måneder. Alle data for 126 GC prøver, herunder alder, køn, tumor site, histologisk kvalitet, invasion dybde (T etape), klinisk fase, og lymfeknude metastaser blev indhentet fra kliniske og patologiske optegnelser og sammenfattes i supplerende tabel 2.

Kvantitativ RT-PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA). Revers transkription og QRT-PCR reaktioner blev udført ved anvendelse af et qSYBR-grøn PCR-kittet (Qiagen, Germantown, USA) og U6 snRNA blev anvendt som en endogen kontrol. Fold ændring blev bestemt som 2

-ddCt. Ct er den fraktionerede cyklusnummer hvor fluorescensen af ​​hver prøve passerer fast tærskelværdi. Den ddCt blev beregnet ved at fratrække DCT for referenceprøven (parret ikke-tumorvæv for kirurgiske prøver og GES-1 celle i seks på gastriske cancercellelinjer) fra DCT af hver prøve. Sekvenserne af de specifikke primere for MIR-26a og U6 snRNA var 5′-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 ‘og 5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’, henholdsvis.

In situ

hybridisering og immunohistokemi

Påvisning af mIR-26a ved in situ hybridisering under anvendelse af DIG-mærkede låst nukleinsyre (LNA) -baseret probe specifik for mIR-26a (Exiqon, Vedbæk, Danmark) blev udført ifølge producentens instruktioner og U6 snRNA blev anvendt som en positiv kontrol. Brie fl y, tissue microarray objektglas blev afparaffiniseret, behandlet med proteinase K (5 min i 2 pg /ml protease K), vasket i PBS og derefter blokeret endogen peroxidaseaktivitet med 3% H

2O

2. Hybridisering blev udført ved 52 ° C natten over efter tilsætning af 50 nM DIG-mærkede LNA prober, efterfulgt af en stringens vask i SSC buffere. Efter blokering (2% fåreserum og 2 mg /ml BSA i PBS med Tween-20) ved stuetemperatur blev probe-target komplekset visualiseret under anvendelse af et anti-DIG-POD-antistof, og DAB kompleks.

immunhistokemi blev udført på væv microarray sektioner ved hjælp af anti-FGF9-antistof (Santa Cruz, CA, USA). Komplekset blev visualiseret med streptavidin /peroxidase og DAB kompleks, og kerner modfarvet med hæmatoxylin. In situ blev hybridisering og immunhistokemi resultater scoret af intensitet (0-4), og procentdelen af ​​farvning (0 til 100%). Relative ekspression blev opnået ved at gange intensiteten i procent. Glassene blev analyseret af to uafhængige patologer.

Rekombinant Vector

Rekombinante lentivirus indeholder miR-26a precursor eller kapløbet sekvenser blev købt fra SunBio (Shanghai, Kina). For luciferase analyse blev FGF9 med fuld længde 3′-UTR amplificeret fra humant blod genomisk DNA og derefter klonet ind i nedstrøms område af en ildflue-luciferase-kassette i pMIR-RAPPORT luciferase vektor (Ambion, Austin, TX, USA). De tilsvarende mutante konstruktioner, hvori de første seks nukleotider er komplementære til MIR-26a seed-region blev muteret ved site-directed mutagenese (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Til konstruktion FGF9-udtrykkende vektor, blev FGF9 ORF cDNA indkøbt fra GeneCopeia (Rockville, MD, USA) og subklonet i den eukaryote ekspressionsvektor pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).

Luciferase Reporter Assay

mIR-26a eller kapløbet lentivira og pMIR-3’UTR vektor blev cotransficeret ind i HEK-293T-celler. Renilla og ildflueluciferase aktiviteter blev målt med Dual-Luciferase Reporter-systemet (Promega, Madison, WI) 24 timer efter transfektion. Ildflueluciferase aktivitet blev normaliseret til Renilla luciferase-ekspression for hver prøve. Hvert eksperiment blev udført tre gange.

Western Blot

Western blotting blev udført som tidligere [16] beskrevne. Kort fortalt blev proteinlysater separeret ved 10% SDS-PAGE og elektro-trophoretically overført til PVDF (polyvinylidendifluorid) membran. Derefter blev membranen inkuberet med muse-antistof mod anti-FGF9-antistof (Santa Cruz, CA, USA) efterfulgt af HRP (peberrodsperoxidase) -mærket gede-antimuse-IgG (Santa Cruz, CA, USA) og detekteres ved kemiluminescens. β-actin blev anvendt som et protein-loading kontrol.

celleproliferationsassay

Celler blev udpladet på 12-brønds plader ved de ønskede cellekoncentrationer. Celletællinger blev estimeret ved trypsinbehandling cellerne og udfører analyse under anvendelse af en Coulter Counter (Beckman Coulter, Fullerton, USA) ved de angivne tidspunkter i tre eksemplarer.

Cell Migration og invasion assays Salg

Cellemigration blev undersøgt under anvendelse sårhelende assays. En kunstig “sår” er skabt på en sammenflydende cellemonolag, og fotografierne blev taget under anvendelse af et omvendt mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) ved 24 timer.

I celleinvasion assay celler podedes på basalmembranen matrix til stede i insertet af en 24-brønds kulturplade (EF matrix, Chemicon, Temecula, CA) og føtalt bovint serum blev tilsat til det nederste kammer som en kemoattraktant. Efter yderligere 48 timer blev de ikke-invaderende celler og EF matrix forsigtigt fjernes med en vatpind. Invasive celler placeret på den nedre side af kammeret blev farvet med krystalviolet, talt og afbildes.

kolonidannelse Assay Salg

Six-brønds plader blev dækket med et lag af 0,6% agar i medium suppleret med 20% føtalt bovint serum. Celler (1 x 10

4) blev fremstillet i 0,3% agar og podet i tre eksemplarer. Efter pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i to uger blev kolonierne talt.

Apoptose Analyse

apoptotiske celler blev evalueret ved Annexin V-FITC og propidium iodfarvning (BD, USA ) og analyseret med et FACS Calibur-instrument (BD, USA). De indsamlede data blev analyseret ved hjælp FlowJosoftware.

Mus xenograftmodel

mavekræft model i nøgne mus blev konstrueret som beskrevet før [25]. For at evaluere rollen af ​​MIR-26a i tumordannelse, blev SGC-7901 celler inficeret med MIR-26a eller scramble vira opformeres og inokuleres subkutant i den dorsale flanker af nøgne mus (5 i hver gruppe). Tumorstørrelse blev målt hver 5 dage. Efter 30 dage blev musene aflivet, obduktioner blev udført, og tumorerne blev vejet. Tumorvolumener blev bestemt ifølge den følgende formel: A × B

2/2, hvor A er den største diameter, og B er diameteren vinkelret på A. For at analysere MIR-26a virkning på tumormetastase, SGC-7901 celler inficeret med mIR-26a eller scramble vira blev injiceret i halevenen af ​​nøgne mus (6 i hver gruppe). Efter 45 dage blev nekropsier udført. Antal mikrometastaser i lunge pr HE-farvede snit i individuelle mus blev analyseret ved morfologi observation. De eksperimentelle protokoller blev godkendt af Udvalget for Animal Research Beskyttelse af Guangzhou Medical University. Standard dyr pleje og laboratorie retningslinier blev fulgt.

Statistisk analyse

Sammenligninger mellem grupper blev analyseret af

t-

test og x

2 test. Total overlevelse kurver og attakfri kurver blev plottet ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden, med log-rank test anvendt til sammenligning. Overlevelse blev målt fra operationsdagen. Variabler med en værdi på

P

0,05 i henhold til den univariate analyse blev anvendt i efterfølgende multivariat analyse baseret på Cox proportional hazards model. Spearmans sammenligningstabeller tests blev anvendt til at evaluere den parvise udtryk korrelation mellem MIR-26a og FGF9 i GC væv. Alle forskelle var statistisk signifikant på niveau med

P

≤0.05. Statistiske analyser blev udført ved hjælp SPSS15.0 software.

Støtte Information

Figur S1.

QRT-PCR målte MIR-26a ekspressionsniveauerne i SGC-7901 og AGS celler inficeret med miR-26a lentivirus samt GES-1 celler transficeret med miR-26a hæmmere

doi:. 10,1371 /journal.pone .0072662.s001

(TIF)

figur S2.

QRT-PCR målte MIR-26a ekspressionsniveauer af tumorvæv udvundet af nøgne mus på den 30. dag efter kræftceller injektion. Alle data er vist som gennemsnit ± sem

doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s002

(TIF)

tabel S1.

Target gener, der blev forudsagt af alle tre algoritmer (Targetscan, Pictar og Miranda)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s003

(XLS)

tabel S2.

Karakteristik af patienter med mavekræft

doi:. 10,1371 /journal.pone.0072662.s004

(DOC)

Tak

Vi takker J Ma og CK Wang for deres tekniske assistance.