PLoS ONE: Metabolomics Analyse af metaboliske virkninger af Nicotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) Hæmning på human Cancer Cells

Abstrakt

Nicotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) spiller en vigtig rolle i cellulære bioenergetik. Den er ansvarlig for omdannelse af nikotinamid til nicotinamidadenindinucleotid, et væsentligt molekyle i cellulær metabolisme. NAMPT er blevet grundigt undersøgt i det sidste årti på grund af dets rolle som en vigtig regulator af nikotinamidadenindinucleotid-forbrugende enzymer. NAMPT er også kendt som et potentielt mål for terapeutisk intervention på grund af sin deltagelse i sygdom. I den aktuelle undersøgelse, brugte vi en global massespektrometri-baserede metabolomiske tilgang til at undersøge virkningerne af FK866, en lille molekyle hæmmer af NAMPT øjeblikket i kliniske forsøg, på metaboliske forstyrrelser i humane cancerceller. Vi behandlede A2780 (ovariecancer) og HCT-116 (colorectal cancer) cellelinier med FK866 i nærvær og fravær af nicotinsyre. blev observeret Væsentlige ændringer i aminosyrer stofskifte og purin og pyrimidin metabolismen den. Vi observerede også stofskifteforandringer i glycolysen, citronsyrecyklus (TCA), og pentosephosphatvejen. For at udvide udvalget af de fundne polære metabolitter og forbedre data tillid, vi anvendte en global metabolomics profilering platform ved hjælp af både ikke-målrettet og målrettet hydrofile (HILIC) -LC-MS og GC-MS-analyse. Vi brugte Ingenuity Knowledge Base for at lette projektionen af ​​metabolomics data på metaboliske veje. Adskillige metaboliske veje viste differentierede reaktioner på FK866 baseret på flere kampe på listen over kommenterede metabolitter. Denne undersøgelse tyder på, at de globale metabolomics kan være et nyttigt redskab i farmakologiske undersøgelser af virkningsmekanismen af ​​lægemidler på celleniveau

Henvisning:. Tolstikov V, Nikolajev A, Dong S, Zhao G, Kuo MS (2014 ) Metabolomics Analyse af metaboliske virkninger af Nicotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) Hæmning på humane cancerceller. PLoS ONE 9 (12): e114019. doi: 10,1371 /journal.pone.0114019

Redaktør: Ramón Campos-Olivas, spansk National Cancer Center, Spanien

Modtaget: 24. februar, 2014 Accepteret: November 4, 2014; Udgivet: 8. december 2014

Copyright: © 2014 Tolstikov et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Eli Lilly and Company. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfattere er medarbejdere i Eli Lilly and Company og som sådan, har overbevisninger, eller finansielt engagement med Eli Lilly and Company. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Som en fortsættelse af en tidligere undersøgelse om den farmakologiske hæmning af nikotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) beskriver metaboliske grundlag af NAMPT hæmning [1], rapporterer vi her resultaterne af en global metabolomics analyse, der afslørede de metaboliske ændringer af NAMPT hæmning i humane cancerceller. Den nikotinamidadenindinukleotid (NAD) cofaktor er afgørende for en række cellulære processer. I pattedyr kan NAD syntetiseres ud fra nicotinamid, nicotinsyre, eller tryptophan [2] – [5]. In vivo koncentration af nikotinsyre er lav på grund af dens hurtige udskillelse og metabolisme, hvilket tyder på, at anvendelsen af ​​nikotinsyre for NAD-biosyntese sammenlignet med nicotinamid er begrænset i pattedyr [3]. De novo-biosyntesen af ​​NAD fra tryptophan sker hovedsageligt i leveren [4]. Derfor totrins frelsesyntesevejen der konverterer nikotinamid til NAD repræsenterer den største del til NAD-biosyntese hos pattedyr [6] – [8]. NAMPT, oprindeligt identificeret som en præ-B-celle koloni-styrke faktor [9], er det hastighedsbegrænsende enzym, som katalyserer det første trin i biosyntesen af ​​NAD fra nikotinamid [10], [11]. Nyere undersøgelser har vist, at NAMPT-medieret NAD-biosyntese i cancerceller spiller en afgørende rolle i flere fysiologiske processer, herunder metabolisme, energiproduktion, overlevelse, apoptose, DNA-reparation, og inflammation [2], [12] – [14]. Det blev påvist, at NAMPT overudtrykkes i flere typer af tumorer, herunder bryst-, tyktarms-, mave-, lunge-, prostata- og andre carcinomer [15] – [18], og dens ekspression forekommer at være associeret med tumorudvikling [19]. I cellen NAMPT er rigeligt i cytosolen og er til stede i kernen. Det har været tilstrækkeligt rapporteret, at NAD omsætning i kræft eller prolifererende celler er steget markant i løbet sunde eller ikke-prolifererende celler [1], [7]. Disse bemærkninger om mulig inddragelse af NAMPT i sygdom er nu blevet støttet af forskellige tilgange i cancerceller undersøgelser [10] – [14]. Nedreguleringen af ​​NAMPT undertrykker tumorcellevækst in vitro og in vivo og sensibiliserer celler for oxidativ stress og DNA-beskadigende midler [8], [15], [18], [20] – [22]. Inhiberingen af ​​NAMPT fører også til dæmpning af tumorvækst og induktion af apoptose som følge af NAD depletion [8], [21] – [24]. Tilsammen NAMPT eksemplificerer en lovende terapeutisk mål for udviklingen af ​​potentielle nye cancerlægemidler.

NAD er et substrat for dehydrogenaser, poly (ADP-ribose) polymeraser, sirtuins, mono (ADP-ribosyl) transferaser, og ADP-ribosyl cyclaser [2], [4], [12]. I de fleste cancerceller, poly (ADP-ribose) polymerase, en nøgle protein kræves til DNA-reparation, der også er involveret i apoptose, aktiveres som følge af DNA-skader og genom ustabilitet [2], [25] – [27]. Aktiveringen af ​​poly (ADP-ribose) polymerase fører til NAD udtømning i cancerceller [2], [8], [25] – [27]. Som et resultat heraf nedregulering af NAMPT sensibiliserer cancerceller til DNA-skadelige midler og apoptose [10], [21]. Tilsvarende SIR2 protein fungerer også som en vigtig nedstrømseffektor af NAMPT der regulerer en række cellefunktioner, herunder overlevelse og inflammation [28] – [30]. Nyere undersøgelser har vist, at SIR2 proteiner regulerer cytokinproduktion [30], hvilket igen reducerer NAD-niveauer gennem inhibering af NAMPT. Endvidere har en NAMPT hæmmer vist anti-inflammatoriske virkninger i dyremodeller af inflammation [20], [30]. Endelig nøglen virkningsmekanisme NAMPT hæmning er blokaden af ​​glycolysen ved glyceraldehyder-3-phosphatdehydrogenase trin ansvarlig for adenosintriphosphat (ATP) udtømning, metabolisk forstyrrelse, og efterfølgende tumorvækstinhibering [1]. Men hvordan modulere NAMPT aktivitet i cancerceller påvirker cellulær metabolisme, uden for energistofskiftet som tidligere rapporteret [1], forbliver ukendt. FK866, et lille molekyle inhibitor for NAMPT, har været genstand for omfattende undersøgelser [2], [21], [31]. Molekylet er blevet co-krystalliseret med og fundet at være bundet til nicotinamid bindende lomme af NAMPT, hvilket viser dens mekanisme som en kompetitiv inhibitor af NAMPT med hensyn til nicotinamid [32]. Adskillige undersøgelser antyder også, at FK866 specifikt inhiberer NAMPT i cellen og udviser antitumoraktivitet i prækliniske tumormodeller [11], [14], [20], [30], [32] – [35]. Synes således FK866 at være et ideelt værktøj molekyle til vurdering af den fysiologiske funktion af NAMPT i cellen. I den aktuelle undersøgelse, vi ønskede at yderligere at vurdere de globale virkninger af NAMPT hæmning af FK866 om kræft metabolisme ved hjælp af globale massespektrometri-baseret metabolisk profilering. Vi har valgt to humane cancercellelinjer der er forskellige i den måde, de bruger nikotinsyre og nikotinamid for NAD-dannelse under antagelse, at tilsætning af nicotinsyre til vækstmediet kan ophæve NAMPT inhibering i en cellelinie, men ikke i den anden. Vi har fundet, at inhiberingen af ​​NAMPT ved FK866 resulterer i ændringen af ​​talrige metaboliske veje langt ud over energimetabolisme. Derfor er den globale massespektrometri-baseret metabolisk profilering tilgang er et nyttigt redskab for mekanistiske studier af narkotika handlinger og til at identificere potentielle farmakodynamiske markører.

Materialer og metoder

Study Design

Hver af to cellelinjer blev behandlet med 5 og 50 nM FK866 (i 0,1% DMSO) og 0,1% DMSO med og uden nikotinsyre (10 uM) i 24 timer. Hver gruppe blev drevet med 6 biologiske gentagelser. Cellelinier, der ikke blev behandlet med lægemiddel og nikotinsyre fungerede som kontroller.

Cancer Cells

A2780 (NCI DCTD), en ovariecancer cellelinie, og HCT-116 (ATCC), en colorektal cancer cellelinie, blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen 30-2001) og McCoys 5a (Hyclone SH30200) henholdsvis i nærvær af 10% FBS. Celler blev podet i en 6-brønds dyrkningsplade med en tæthed på 1,0 x 10

6 brønd og inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2 i 24 timer og derefter behandlet med FK866 i DMSO ved forskellige koncentrationer i 24 timer. FK866 blev syntetiseret som tidligere beskrevet [36], [37]. Som en del af undersøgelsen design blev celler også dyrket og behandlet med nicotinsyre (10 uM) og FK866 i 24 timer før høst. Cellelevedygtighed blev vurderet ved måling af total proteinindhold under anvendelse af et CytoScan SRB cytotoksicitet Assay Kit (Cat No. 786-213;. G-Biosciences, St. Louis, MO). Efter 24 timers behandling blev mediet fjernet, og præ-kølet ved -20 ° C; Dernæst blev 500 pi af 80% methanol tilsat til hver brønd. Cellerne blev skrabet og opsamlet ved -20 ° C i 1,5 ml eppendorfrør. Efter 60 minutter blev eppendorfrør centrifugeres i 5 minutter ved 14.000 omdrejninger i minuttet og placeret supernatant i nye rør til yderligere analyse.

Metabolomics Analyse

Analyser blev udført ved hjælp af ikke-målrettede og målrettet protokoller bruger GC-TOF-HRMS, om gennemførelse hydrofile (HILIC) -LC-HRMS og HILIC-LC-MS /MS instrumentering tidligere rapporteret metodologi [38] – [40]. En standard kvalitetskontrol (QC) prøve indeholdende en blanding af aminosyrer og organiske syrer blev injiceret dagligt at overvåge massespektrometer respons. Den poolede QC prøve blev opnået ved at tage en portion af det samme volumen af ​​alle prøver fra undersøgelsen. Den poolede QC prøve blev injiceret dagligt med en batch af analyserede prøver og blev anvendt til at bestemme den optimale fortynding af batch prøver og at validere metabolit identifikation og peak integration (S1 File). Supernatanter af celleekstrakter blev opdelt i tre dele: 75 pi til GC-TOF-MS-analyse, 175 pi for HILIC-LC /MS-analyse, og 175 pi for HILIC-LC /MS /MS-analyse

. Prøve Derivatisering og GC-TOF-HRMS Analyse

Ekstrakter blev tørret ved hjælp SpeedVac Concentrator Savant DNA120 (ThermoScientific, San Jose, CA) med badtemperaturen indstillet under 30 ° C. Pre-kølede prøver blev yderligere tørret over 1 time ved hjælp af en frizone lyofiliseringsapparat (Labconco, Kansas City, MO). Tørrede prøve derivatisering med methoxylaminhydrochlorid i pyridin og N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide blev udført som beskrevet af Tong et al. [37]. Gaschromatografi blev udført under anvendelse af en Agilent 7890A gaskromatograf (Agilent, Palo Alto, CA) forbundet med en høj opløsning time-of-flight Pegasus GC-HRT massespektrometer (Leco, St. Joseph, MI). Automatiserede injektioner blev udført ved hjælp af en MPS2 programmerbar robot MP sampler (Gerstel, Muhlheim an der Ruhr, Tyskland). Gaskromatografisystemet var udstyret med en Gerstel temperatur-programmeret injektor, afkølet indsprøjtningssystemet (model CIS 4). En automatiseret liner udveksling (Alex) (Gerstel) blev anvendt til at eliminere krydskontaminering fra prøvematrixen, der foregik mellem prøve kørsler. Multiple deaktiverede ledeplader liners for GC-tilførsel blev anvendt. Den Gerstel injektor blev programmeret til den følgende sekvens: indledende temperatur 50 ° C, hold i 0,1 minutter, øge temperaturen med en hastighed på 10 ° Cs-1 til en endelig temperatur på 330 ° C, og hold tid 15 minutter). Injektioner af 1 pi blev foretaget i splitless mode. Kromatografi blev udført på et RTX-5Sil MS-søjle (længde: 30 m; ID: 0.25 mm; df: 0,25 um) med en Integra-Guard-søjle (Restek, Bellefonte, PA). Heliumbærergas blev anvendt i en konstant strøm på 1 ml min-1. GC ovntemperatur blev programed for den følgende sekvens: 50 ° C starttemperatur med 1 minuts holdetid og derefter ramping ved 10 ° C per minut til en temperatur på 140 ° C, derefter ramping ved 4 ° C per minut til en temperatur på 240 ° C, og derefter ramping ved 10 ° C per minut til en temperatur på 300 ° C med 8 minutters holdetid. Både overførsel linje og kilden temperaturer var 250 ° C. Ionkilde der drives ved -70 filament kV spænding. Efter et opløsningsmiddel forsinkelse på 500 sekunder, blev massespektre opnået ved 2,4 spektre per sekund med en ekstraktion på 2 kHz og en masse mellem 60 520 m /z. Resolution var sat til 25 K. Mass nøjagtighed blev styret med PFTBA tuning på en sub-ppm-niveau under hele driftstiden. Standarden QC’er og samleprøve QC’er blev brugt til at overvåge GC-TOF-HRMS dataopsamling (S1 File) [41] – [43]. Massespektrometer kalibrering blev udført på daglig basis under anvendelse leverandør protokol. Masse nøjagtighed blev rutinemæssigt opretholdt i en sub-ppm-niveau ved en opløsning på 30 og 40 K. Dataanalyse blev udført med leverandør software ChromaTof (LECO, St. Joseph, MI) og AnalyzerPro (SpectralWorks Ltd, Runcorn, UK) ved hjælp af den nyeste NIST-MS database (https://chemdata.nist.gov/).

HILIC-LC-MS /MS analyse

Ekstrakter blev anvendt uden yderligere derivatisering. HILIC-LC-MS /MS erhvervelse og behandling af data blev overvåget ved hjælp af standard QC’er [42], [43] og samleprøve QC’er (S1-fil). Væskekromatografi blev udført ved anvendelse af NEXERA UPLC systemet (Shimadzu, Columbia, MD) koblet med Triple Quad 5500 System (AB Sciex, Framingham, MA). HILIC separationer blev opnået ved anvendelse af en polyamin-bundet polymer gel søjle (apHera NH2 Polymer) med en 150 x 2 mm, 5 um partikelstørrelse, udstyret med en forkolonne (apHera NH2 Polymer) med en 10 x 2 mm, 5 um partikelstørrelse (Supelco, Bellefonte, PA). De mobile faser var acetonitril (A) og 50 mM ammoniumbicarbonat (pH 9,4, indstillet med ammoniumhydroxid) (B) til strømningshastigheder på 0,25 ml /min ved 30 ° C. Efter 3 minutters isokratisk kørsel ved 15% B, blev en gradient til 30% B indgås på 12 minutter og en gradient til 60% B blev afsluttet på 15 minutter. Derefter blev en gradient til 75% B indgås på 21 minutter og en gradient til 98% B blev afsluttet ved 22 minutter. Efter søjle vask, blev kørslen indgået med 98% B ved 29 minutter. Kolonne ækvilibrering med en udgangsbuffer tog 6 minutter før den næste injektion. Dataopsamling blev udført under anvendelse planlagte MRMs. Samlet liste indeholdt mere end 200 MRM overgange genereret med autentiske standarder i positiv og i negativ tilstande [43] (S1-fil).

HILIC-LC-HRMS Analyse

Ekstrakter blev anvendt uden yderligere derivatisering. Standarderne QC’er og samleprøve QC’er blev anvendt til at overvåge HILIC-LC-HRMS datafangst som tidligere beskrevet (S1 File) [42] – [44]. Væskekromatografi blev udført ved hjælp af WATERS UPLC systemet (Waters, Milford, MA) kombineret med Triple TOF 5600 System (AB Sciex). HILIC separationer blev opnået ved anvendelse af de ovenfor beskrevne protokoller. Informationen Dependent Acquisition forsøg blev anvendt til dataopsamling i en 70 til 800 m /z masse interval for positive og negative ioner separat. Data blev behandlet ved hjælp MarkerView version 1.2.1 software (AB Sciex). Spiking samleprøver med kommercielt tilgængelige autentiske standarder er tilladt til identifikation af prøven komponenter. Data blev indsamlet for positive og negative ioner særskilt inden en 70 til 800 m /z masse interval, gennemføre forsøg beregnet til at fragmentere alle ionerne over udvalgte tærskel, mens anvendelse rullende fragmentering energi. Massespektrometer kalibrering blev udført på daglig basis under anvendelse af sælgeren protokol for positive og negative ioner. Masse nøjagtighed blev rutinemæssigt opretholdt ved 5 ppm-niveau med en opløsning på 20 til 30K. Komponent identifikation blev udført med spiking autentiske standarder, når de foreligger. Ukendte komponenter blev identificeret ved hjælp af rekalibreret spektrale data med bistand fra PeakView-version 1.2.0.3 software (AB Sciex). Batch rekalibrering blev udført ved anvendelse tidligere identificerede bestanddele med forskellige masser og retentionstider som interne standarder. Denne protokol tilladt for den rutinemæssige opnåelse af en 2 til 5 ppm masse nøjagtighed afvigelse for forældre ioner og deres fragmenter (S1-fil). METLIN (https://metlin.scripps.edu/index.php), HMDB (https://www.hmdb.ca/), MASSBANK (https://www.massbank.jp/), NIST-MS (http : //chemdata.nist.gov/), IDEOME (https://mzmatch.sourceforge.net/ideom.php), mzCloud (https://mzcloud.org/), og in-house genererede HRMS og HRMS /MS databaser blev anvendt til grundstofsammensætningen opgaven, spektrale data sammenligninger, og detaljeret manual fortolkning. Denne opdagelse protokol tilladt for annotation af metabolitter, som ikke var kommercielt tilgængelige (S1 File). Annoterede data blev yderligere behandlet med MarkerView version 1.2.1 software (AB Sciex) til at beregne metabolitten topareal. Uidentificerede funktioner blev rutinemæssigt udelukket fra top listen. HILIC-LC-HRMS data blev brugt til at afklare cross-talk observeret under HILIC-LC-MS /MS-analyse, og det blev brugt til måling af metabolitter, der havde koncentrationer over lineære område under HILIC-LC-MS /MS-analyse . Det blev også brugt til opgaven retentionstider for isomerer (S1-fil).

Databehandling og statistisk analyse

GC-MS dataanalyse ved hjælp ChromaTof tilladt for peak lister generation, som yderligere blev udtrukket på tværs datablade og kombineres i en master listen. Desuden blev databehandlingen udført med AnalyzerPro og en matrix analysator add-on blev anvendt til at generere en matrix target bibliotek. NIST-MS database blev anvendt til at generere dette bibliotek. Denne protokol resulterede i dannelsen af ​​flere tusinde funktioner. Data blev yderligere filtreret som beskrevet i Chan et al. [41] og Dunn et al. [42] og fusioneret med de data, der genereres med ChromaTof bistand. fjernelse manuel inspektion og duplikater blev udført for at danne en endelig metabolitter peak tabel identificeres og måles med GC-MS-metoden. Median data normalisering (række skalering), logaritmisk transformation, og data skalering (Pareto) for GC-MS og LC-MS-data blev udført ved hjælp MetaboAnalyst version 2.0 software [45] med henblik på at kompensere for inter- og intra-instrumental variation. En endelig metabolit peak tabel blev konstrueret ved at sammenlægge data indhentet med alle metoder. Peak liste, der genereres med LC-MS /MS-metode, tjente som grundlag for data sammenlægning og integration (S1 File). Dubletter indført med de komplementære metoder (GC-HRMS og HILIC-LC-HRMS) blev fjernet efter manuel inspektion. Metabolit-intensiteter fra individuelle prøver blev normaliseret til tilsvarende proteinkoncentration inden yderligere statistisk analyse. Statistiske analyser blev udført ved anvendelse univariate og multivariate tilgange. MetaboAnalyst version 2.0 [45] og JMP-version 11 pakker blev anvendt til statistiske analyser. Analyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Dunnett Multiple Sammenligning Test blev udført for data-sammenligninger mellem grupper, der er defineret med studiet design som følger: kontrol (betegnet som -NA) og behandlede celler (betegnet + NA, 50 nM-NA, 5 nM-NA, 50 nM + Na, 5 nM + Na). Tal, som indeholder illustrationer af ANOVA resultater har grafisk information forklares således: forskelle mellem grupper blev betragtet som statistisk signifikant, når p 0,05. Grand middelværdi er vist som en vandret linie beliggende i panelet (fig. 1). Y-aksen illustrerer normaliseret, log forvandlet, og skaleres peak område. Eksperimentelle grupper ved de forskellige behandlinger blev yderligere klassificeret ved hjælp af ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse, principal komponent analyse, og overvåges multivariat analyse partielle mindste kvadrater-diskriminant analyse (S3 File).

Grand middelværdi vises som en vandret linje ligger inden panel . Y-aksen illustrerer normaliseret, log forvandlet, og skaleres peak område. Dots repræsenterer prøver. Gruppe betyder vist som en vandret linje i boksen.

Pathway og Network Analysis

Identificerede metabolitter blev udsat for IPA-analyse (Ingenuity System, Redwood City, CA). Tiltrædelsespartnerskaber antal påviste metabolitter (HMDB, pubchem, og Kegg identifikatorer) optaget i MS Excel og importeret til IPA til at kortlægge de kanoniske veje og generere netværk af interagerende biologiske enheder. Data blev indsendt som fold ændre værdier (forhold) beregnet mod kontrolgruppen (betegnet som -NA). Omfattende pathway og netværk analyser blev udført. Downstream biologiske processer blev scoret i overensstemmelse med den ontologi support hjælp Ingenuity Knowledge Base (https://www.ingenuity.com/science/knowledge-base). IPA analyse indstillinger var som følger:

Reference sæt:. Ingenuity Knowledge Base (endogene kemikalier)

Forholdet til også at omfatte:.. Direkte og indirekte

Indeholder endogene kemikalier

Filter resumé: Overvej kun relationer, hvor tillid er eksperimentelt observerede eller høj (forudsagte)

Analyse indstilling inkluderet data indsamlet fra humane celler

P-værdi forklaring er.. som følger: et mål for sandsynligheden for, at sammenhængen mellem et sæt af metabolitter i datasættet og en relateret funktion skyldes tilfældig forening. Jo mindre p-værdi, jo mindre sandsynligt er det, at foreningen er tilfældig og mere markant foreningen. Generelt p-værdier 0,05 indikerer en statistisk signifikant, ikke-tilfældige association. IPA bruger aktivering z-score algoritme til at gøre forudsigelser. Den z-score algoritme designet til at producere enten en forudsigelse af aktivering eller hæmning (eller ingen forudsigelse), samt for at reducere risikoen for, at tilfældige data vil generere betydelige forudsigelser.

Resultater

for at vurdere virkningerne af NAMPT hæmning på kræft metabolisme anvendte vi to forskellige cellelinier: A2780, en NARPT-negative cellelinie, der kun kan udnytte NAMPT-medierede nicotinamid vej for NAD-biosyntese, og HCT-116, en NAPRT-positive celle linje, der kan bruge både NAMPT-medieret nikotinamid og NAPRT-medierede nikotinsyrederivater veje for NAD biosyntese. Fordi HCT-116 kan bruge nicotinamid og nikotinsyre for NAD-dannelse, kan tilsætning af nicotinsyre til vækstmediet afskaffe NAMPT inhibering i HCT-116, men ikke i A2780. Derfor blev nikotinsyre anvendes i den nuværende undersøgelse for at vurdere specificitet NAMPT hæmmere.

Aminosyrer Metabolisme

Brug de globale metabolomik protokoller, vi observerede signifikante ændringer i aminosyremetabolismen på NAMPT hæmning med FK866 i begge cellelinier, med undtagelse af glycin og serin metabolisme, arginin stofskifte og histidin metabolisme (S2-S5 Files). Som vist i fig. 1, blev alanin og aspartat stofskifte væsentligt påvirket. Drug dosisafhængige inducerede ændringer i aspartat, alanin og N-carbamoyl-aspartat niveauer blev observeret. Tilsætning af nikotinsyre helt afskaffet disse virkninger observeret i HCT-116, men ikke i A2780 (fig. 1, S4 File og S5 Files), hvilket indikerer, at disse virkninger skyldtes NAMPT hæmning. Det er interessant, at asparagin og glutamat niveauer ikke var signifikant ændret. En marginal nedgang i glutamat og glutamin niveauer i HCT-116 celler blev også observeret. Forhøjet threonin niveauer blev observeret (S2 File) og vendes med nikotinsyrebehandlingen i HCT-116 celler, understøtter forbindelsen til aspartat, som er en kilde til threonin-biosyntese.

Interessant niveauerne af N-acetylglutamine var forhøjet i begge cellelinier, når de behandles med FK866 og kun er virkningerne i HCT-116 blev reddet ved tilsætning af nicotinsyre. Lignende resultater blev opnået for lysin, N-acetyl-lysin, phenylalanin, tryptophan, tyrosin, leucin, isoleucin, methionin, SAM, og prolin (S3 Fil, S4 Fil og S5 Files). SAM er kendt for at deltage i cystein og methionin-metabolisme, arginin og prolin metabolisme, biosyntesen af ​​aminosyrer, og i transmethylering, transsulfureringsvejen, og aminopropylation. Det blev konstateret, at ændringer af SAM niveauer er forbavsende ens for ændringer i aspartat niveauer (S3 Fil, S4 Fil- og S5 filer). Endelig NAMPT inhibering fører også til ændret polyamin metabolisme fordi spermin og spermidin niveauer var forhøjet i en dosisafhængig måde efter behandling med FK866. Tilsætning af nikotinsyre helt afskaffet de observerede i HCT-116 celler virkninger, men ikke i A2780-celler (S3 Fil, S4 Fil og S5 Files). Synes således NAMPT inhibering at forstyrre adskillige aminosyre-pathways og nogle af de virkninger synes at være cellelinie specifikke.

purin og pyrimidin-metabolismen

Fordi flere trin af purin og pyrimidin biosyntese kræver NAD og mellemprodukter, der stammer fra kulhydrat metabolisme, vi vurderet virkningerne af NAMPT hæmning på nukleotid-relaterede metabolism.As vist i fig. 2 og i S3 Fil, S4 Fil og S5 Files, vi observerede ændringer i niveauet af puriner som reaktion på FK866 behandling, fordi der var en dosisafhængig stigning i niveauet af adenin, cytidin, cytosin, adenosin, 1-methyladenosin, inosin, adenosin monophosphat (AMP), adenosindiphosphat (ADP), inosinmonophosphat (IMP), inosin diphosphat (IDP), cytidindiphosphat (CDP), deoxyguanosin diphosphat (dGDP), 5-aminoimidazol-4-carboxamid ribonukleotid (AICAR), AICAR 3 ‘ , 5’-cyklisk phosphat, N-formylglycinamidribo- ribonukleotid, orotidin, purin, thymidin og uridin i begge cellelinier, svarende til stigningen på aminosyrer niveauer. Interessant tilsætning af nikotinsyre afgørende formindsket de forhøjede niveauer af inosin i begge cellelinier (fig. 2, S2 Fil, S3 Fil, S4 Fil- og S5 filer). Niveauer af xanthin blev ikke ændret i A2780 celler, men steg på en dosisafhængig måde i HCT-116-celler, hvilket antyder en cellelinie specifik forskel i xanthin-relaterede metabolisme. Der var en dosisafhængig fald i 7-methylguanosin, deoxyadenosin, deoxyuridin, guanosinmonophosphat (GMP), cytidinmonofosfat (CMP), deoxycytidin monophosphat (dCMP), deoxyadenosin monophosphat (DAMP), og uridintriphosphat (UTP) niveauer. Disse virkninger skyldtes NAMPT inhibering fordi tilsætning af nikotinsyre afskaffet disse virkninger i HCT-116 celler, men ikke i A2780 celler. Interessant, behandling med 5 nM FK866 øgede dCMP niveauer kan sammenlignes med 50 nM FK866 i A2780 celler. Igen var der en cellelinje specifik effekt observeret fordi NAMPT hæmning forårsagede et fald i niveauet cyklisk AMP og AICAR ribotid i A2780 celler, men ikke i HCT-116 celler (S2 Fil, S3 Fil, S4 Fil og S5 Files).

Grand middelværdi er vist som en vandret linie beliggende inden panel. Y-aksen illustrerer normaliseret, log forvandlet, og skaleres peak område. Dots repræsenterer prøver. Gruppe betyder vist som en vandret linje i boksen.

Kreatin Metabolisme

NAMPT hæmning førte til en dosisafhængig stigning i kreatin og kreatinin niveauer i begge cellelinier lignende til aminosyrer niveauer. I overensstemmelse med dette, tilsætning af nikotinsyre afskaffet disse effekter i HCT-116 celler, men ikke i A2780 celler (S2 Fil, S3 Fil, S4 Fil og S5 filer).

Lipid Metabolism

fedtsyrebiosyntese kræver en stor mængde NADP /NADPH stammer fra NAD og citrat (en TCA mellemliggende); vi observeret signifikante ændringer i lipid metabolisme i respons på FK866 behandling. Palmitinsyre og stearinsyre niveauer var forhøjet i en dosisafhængig måde i begge cellelinier. Interessant tilsætning af nikotinsyre afskaffet disse virkninger i begge cellelinier. Behandlingen med FK866 førte til øget cholin, phosphorylcholin, og phoshatydylglycerol i HCT-116 celler, men ikke i A2780 celler. Disse virkninger observeret i HCT-116-celler var et resultat af NAMPT inhibering fordi virkningerne blev afskaffet ved tilsætning af nicotinsyre til vækstmediet. Interessant, observerede vi en stærk dosisafhængig stigning i glycerophosphocholine og glycerol-3-phosphat-niveauer i A2780 celler, men ikke i HCT-116-celler. Den FK866 behandling resulterede også i en signifikant dosisafhængig fald i lyso-PC og PC-niveauer detekteret i A2780 celler, men marginale ændringer i HCT-116-celler (S2 Fil, S3 Fil, S4 Fil og S5 filer).

disse observationer kan have afspejlet en cellelinje-specifikke forskel i disse særlige metaboliske veje. Endelig NAMPT inhibering også væsentligt påvirket carnitin metabolisme på en dosis-afhængig måde (Fig. 3).

Grand middelværdi er vist som en vandret linie beliggende inden panel. Y-aksen illustrerer normaliseret, log forvandlet, og skaleres peak område. Dots repræsenterer prøver. Gruppe betyder vist som en vandret linje i boksen.

Carnitin er et vigtigt molekyle for reguleringen af ​​den cellulære energi metabolisme af fedtsyrer og glukose. Carnitin er involveret i langkædet fedtsyre transport over den indre membran af mitochondria, og det letter transporten af ​​kæden-afkortet acylgrupper produceret i peroxisomer til mitokondrierne for yderligere energiproduktion. Cell-specifikke ændringer i carnitin stofskifte blev observeret, hvilket indikerer en anden virkning af FK866 administration på carnitin biosyntese og nedbrydning. Acetylcarnitin stammer fra acetyl-CoA, det universelle nedbrydningsprodukt af alle metaboliske substrater. Acetylcarnitin ændringer fandtes at svare til acetyl-CoA ændringer (S2 Fil, S3 Fil, S4 Fil- og S5 filer). Butyrylcarnitin kan afledes fra både fedtsyrer og aminosyrer. Dets ændringer viste sig at være dosisafhængige, hvilket kan afspejle observerede ændringer i aminosyrer og fedtsyrer stofskifte.

Glycolysis, pentosephosphatvejen, og TCA Cycle

Det blev for nylig vist, at NAMPT inhibering dæmper glyceraldehyder-3-phosphat-dehydrogenase-aktivitet, hvilket igen påvirker glycolysen, pentosephosphatvejen, og den TCA-cyklus og deres nedstrøms veje i cancerceller [1]. Resultaterne af denne undersøgelse er i tæt overensstemmelse med de af den tidligere undersøgelse [1] (S2-S5 Filess).

Clustering Analyse

For yderligere at forstå den metaboliske tilslutningsmuligheder og at fange den globale virkninger, udførte vi et uovervåget hierarkisk klyngeanalyse. Fig. 4 illustrerer de udvalgte metabolitter varme kort. Farven intensiteter af kortene viser, at NAMPT hæmning med FK866 er celle specifikke og fig. 4 viser nikotinsyrebehandling.