PLoS ONE: dosisafhængig AMPK-afhængige og uafhængige mekanismer Berberin og Metformin Hæmning af mTORC1, ERK, DNA Synthesis og spredning i bugspytkirtelkræftceller

Abstrakt

Naturprodukter repræsenterer en rig reservoir af potentielle små kemiske molekyler udviser anti-proliferative og kemoforebyggende egenskaber. Her viser vi, at behandling af pancreas ductus adenocarcinom (PDAC) celler (Panc-1, MiaPaCa-2) med den isoquinolin alkaloid Berberin (0,3-6 uM) inhiberede DNA-syntese og proliferation af disse celler og forsinke progression af deres cellecyklus i G1. Berberine behandling også reduceret (med 70%) væksten af ​​MiaPaCa-2 cellevækst når implanteret i flankerne af nu /nu-mus. Mekanistiske undersøgelser afslørede, at berberine faldt mitokondriske membranpotentialet og intracellulære ATP-niveauer og inducerede potent AMPK aktivering, som vist ved phosphorylering af AMPK α subunit ved Thr-172 og acetyl-CoA-carboxylase (ACC) ved Ser

79. Endvidere berberine dosisafhængigt inhiberede mTORC1 (phosphorylering af S6K på Thr

389 og S6 ved Ser

240/244) og ERK-aktivering i PDAC celler stimuleret af insulin og neurotensin eller føtalt bovint serum. Knockdown af α

1 og α

2 katalytiske underenhed ekspression af AMPK vendt inhiberende virkning ved behandling med lave koncentrationer af Berberin på mTORC1, ERK og DNA-syntese i PDAC celler. Men ved højere koncentrationer, berberine inhiberede mitogene signalering (mTORC1 og ERK) og DNA-syntese gennem en AMPK-uafhængig mekanisme. Lignende resultater blev opnået med metformin anvendt i doser, der inducerede enten beskedne eller udtalt reduktion i intracellulære ATP-niveauer, som var praktisk talt identiske med faldene i ATP-niveauer opnået i reaktion på berberine. Vi foreslår, at Berberin og metformin hæmme mitogen signalering i PDAC celler gennem dosisafhængig AMPK-afhængige og uafhængige veje

Henvisning:. Ming M, Sinnett-Smith J, Wang J, Soares HP, Young SH, Eibl G et al. (2014) dosisafhængig AMPK-afhængige og uafhængige mekanismer Berberin og Metformin Hæmning af mTORC1, ERK, DNA Synthesis og spredning i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 9 (12): e114573. doi: 10,1371 /journal.pone.0114573

Redaktør: Richard Pearson, Peter MacCallum Cancer Centre, Australien

Modtaget: Juli 1, 2014 Accepteret: 11. november 2014 Udgivet: December 10, 2014

Copyright: © 2014 Ming et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health Tilskud P01 CA163200, P30 DK4130, R01 DK100405, Institut for Veterans Affair Grant 1I01BX001473 og midler fra begavet Ronald S. Hirschberg formand for kræft i bugspytkirtlen Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er en ødelæggende sygdom, med samlet 5-års overlevelse på kun 6% [1]. Forekomsten af ​​denne sygdom i USA skønnes at stige til mere end 44.000 nye tilfælde i 2014 og er nu den fjerde hyppigste dødsårsag kræft hos både mænd og kvinder [2]. Total dødsfald som følge af PDAC forventes at stige dramatisk at blive den næststørste årsag til kræft-dødsfald før 2030 [1] Som de nuværende behandlinger tilbyder meget begrænsede overlevelsesrater fordele, nye strategier at behandle og forebygge denne aggressive sygdom er et presserende behov [3 ].

G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er) og deres beslægtede agonister i stigende impliceret som autokrine /parakrine vækstfaktorer for flere faste tumorer, herunder småcellet lungecancer, colon, prostata, bryst og pancreas [4] – [8]. Vi viste, at kræft i bugspytkirtlen cellelinjer udtrykker flere GPCRs [9] og en række GPCR agonister, herunder neurotensin, angiotensin II og bradykinin, stimulerede DNA-syntese i bugspytkirtelkræft cellelinjer, herunder PANC-1 og MiaPaCa-2 [9] – [ ,,,0],12]. Desuden er en bredspektret GPCR antagonist [13], [14], hæmmede væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller enten

in vitro

eller xenotransplanteret i nu /nu mus [15]. Andre undersøgelser viste forøget ekspression af GPCR’er i bugspytkirtelkræft væv [16] – [19]. Efterfølgende identificerede vi positive krydstale mellem insulin /IGFI receptorer og GPCR signalsystemer i bugspytkirtelkræftceller, hvilket fører til mTORC1 signalering og ERK-aktivering, og synergistisk stimulering af DNA-syntese og celledeling [20] – [22]. Disse resultater får en særlig betydning i betragtning af det store antal epidemiologiske undersøgelser forbinder langvarige type-2 diabetes mellitus (T2DM), fedme og metabolisk syndrom, kendetegnet ved perifer insulinresistens og kompensatorisk overproduktion af insulin, med øget risiko for at udvikle kræft i bugspytkirtlen [23] – [32]

biguanid metformin (1,1-dimethylbiguanide hydrochlorid) afledt af galegine, en fytokemiske fra

Galega officinalis,

er den mest udbredte foreskrevne lægemiddel til behandling af. T2DM,

verdensomspændende

[33], [34]. Systemisk, metformin sænker blodsukkeret gennem reduceret hepatisk glukoneogenese, øger glukoseoptagelse i skeletmuskulatur og fedtvæv [34], [35] og reducerer de cirkulerende niveauer af insulin og IGF-1 [36], [37]. På celleniveau, metformin indirekte stimulerer AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) aktivering [38] via inhibering af mitokondrisk funktion, selv om andre mekanismer metformin handling er også foreslået i høje doser [39]. Større nedstrøms mål for AMPK omfatter TSC2 og Raptor [40] – [43]. AMPK-medieret phosphorylering af disse mål inhiberer mTOR kompleks 1 (mTORC1) aktivitet i en række celletyper, herunder PDAC celler [44], [45] og forstyrrer positiv krydstale mellem insulin /IGFI-receptorer og GPCR signalsystemer [21], [46]. Interessant, en række observationsstudier tyder på, at metformin reducerer forekomsten og forbedret prognose af en række forskellige cancere hos patienter med T2DM [47], [48], selv om dette denne konklusion er under kontrol [49]. I indstillingen af ​​PDAC, diabetespatienter, der havde modtaget metformin synes at have lavere justerede forekomst og bedre overlevelse sammenlignet med dem, der ikke havde taget metformin eller anvendes andre antidiabetiske midler [47], [50] – [52]. Vi antager, at strukturelt ubeslægtede naturlige eller syntetiske forbindelser, der interfererer med mitokondrie-medieret ATP syntese og målrette mTORC1 og ERK veje, kunne give nye anti-PDAC agenter.

Naturprodukter repræsenterer en rig reservoir af potentielle små kemiske molekyler udstiller forskellige farmakologiske egenskaber. Den isoquinolin alkaloid Berberin [53] – [55], en fytokemiske udvundet fra en række medicinske planter, herunder planter af

Berberis

arter inducerer flere biologiske virkninger, herunder anti-fedme, anti-diabetisk, anti kræft og kalorie-begrænsning effekter [55] – [62]. Den cellulære mekanisme (r) involverede imidlertid forbliver ufuldstændigt forstået. Berberine er blevet rapporteret at inhibere mitokondrisk funktion og inducerer AMPK aktivering [63], men andre virkningsmekanismer af denne alkaloid er blevet foreslået, når det tilsættes ved høje koncentrationer [64], [65]. Trods de potentielle kliniske implikationer, er der ingen forståelse for den præcise mekanisme (r), hvorved Berberin hæmmer spredning af kræftceller, og det vides ikke, om denne agent har nogen direkte effekt på signalering og proliferation af PDAC celler huser

KRAS

mutationer, karakteristisk for . 90% af duktale bugspytkirtelcarcinomer

i denne undersøgelse viser vi, at Berberin hæmmer DNA-syntese, cellecyklusprogression og proliferation i PANC-1 og MiaPaCa-2 bugspytkirtelkræftceller . Endvidere berberinchlorid administration hæmmer væksten af ​​PDAC tumorxenografter

in vivo

så effektivt som metformin. I mekanistiske undersøgelser, demonstrerer vi, at Berberin, ligesom metformin nedsætter mitochondriemembran potentiale og ATP niveauer, og samtidig fremkalder AMPK aktivering. Baseret på resultater under anvendelse af siRNA-medieret knockdown af AMPK, foreslår vi, at de inhiberende virkninger af berberin og metformin medieres via AMPK-afhængige og AMPK-uafhængige veje afhængig af dosis af hvert middel. Denne konklusion giver en plausibel forklaring på tilsyneladende modstridende rapporter om rolle AMPK i virkningsmekanismen af ​​Berberin og metformin i andre modelsystemer.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) blev opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Neurotensin, insulin, berberin og metformin blev opnået fra Sigma Chemical (St. Louis, MO). Alle antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin-IgG og anti-mus IgG var fra GE Healthcare Bio-Sciences Corp (Piscataway, NJ). Alle andre reagenser var af den højeste tilgængelige kvalitet.

Celler og dyrkningsbetingelser Salg

De humane pancreascancer cellelinier Panc-1 og MiaPaCa-2 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Disse cellelinier blev valgt, fordi de harbor mutationer er typiske for human pancreascancer [66], herunder aktiverende mutationer i KRAS, TP53 (der koder for p53-proteinet) og CDKN2A (også kendt som p16 eller p16INK4a). Faktisk er der en fremragende korrelation mellem punkt mutationsfrekvenser i PDAC cellelinjer og primære tumorer [67]. Celler blev dyrket i DMEM suppleret med 2 mM glutamin, 1 mM Na-pyruvat, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 10% CO2 . I eksperimenterne blev glucosekoncentrationen i DMEM indstillet til 5 mM, et fysiologisk niveau i humant serum.

[

3H] -thymidin inkorporering i DNA

PANC-1 og MiaPaCa -2 celler (1 x 10

5) blev udpladet og dyrket i 3,5 cm vævsdyrkningsskåle i 5 dage i DMEM suppleret med 10% FBS. Cellerne blev vasket to gange og inkuberet i 24 timer med DMEM indeholdende 5 mM glucose og 1% FBS. For at starte forsøget blev frisk medium indeholdende den angivne koncentration af agonist og /eller inhibitor tilsættes efter vask to gange med DMEM (4 kulturer anvendt til hver betingelse), og derefter blev cellerne inkuberet i 17 timer og derefter pulsmærket i 6 timer med [

3H] -thymidin (0,25 uCi /ml). Cellerne blev fikseret med 5% trichloreddikesyre og vasket to gange med ethanol. Syre-uopløselige puljer blev opløst i 0,1 N NaOH med 1% SDS, og radioaktiviteten inkorporeret blev talt i en væskescintillationstæller.

mitochondriemembran Potentiel

celle-permeable JC-1 farvestof ( Invitrogen), som udviser potentiel-afhængig akkumulering i mitokondrierne, blev anvendt som en indikator for mitochondriemembranpotential. Efter behandling uden eller med berberine eller metformin, blev JC-1 tilsat til kulturer af PANC-1 eller MIA PaCa-2-celler ved 1 pg /ml i 30 min. Derefter blev medierne udskiftet med Hanks Buffered Saline Solution indeholdende 5 mM glucose og celler blev straks filmede med rhodamin og fluorescein optik. Billeder blev lagret fra flere synsfelter. Histogrammet analyse træk ved Photoshop (Adobe) blev anvendt til at måle den gennemsnitlige røde og normal grønne fluorescensintensitet fra ca. 50 celler i et synsfelt. Mindst 5 uafhængige felter blev målt i hver tilstand. Resultaterne er udtrykt som et gennemsnit forhold af rød /grøn fluorescerende intensitet i et enkelt synsfelt (gennemsnit ± SEM). Forholdet mellem rød /grøn fluorescens intensitet indikerer mitrokondriemembranen med en nedsat forhold indikerer et tab af potentiale.

ATP Bestemmelse

Panc-1 og MiaPaCa-2-celler (5 x 10

4) blev udpladet og dyrket i 24-brønds dyrkningsplader i 5 dage i DMEM og 10% FBS. Cellerne blev derefter inkuberet i 24 timer med DMEM indeholdende 5 mM glucose og 1% FBS. Cellerne blev vasket to gange med DMEM indeholdende 5 mM glucose og inkuberet i serumfrit medium i 17 timer i fravær eller nærvær af Berberin eller metformin. ATP-niveauer blev bestemt under anvendelse af ildflueluciferase /D-luciferin ATP bestemmelse Kit ifølge producentens protokol (Life Technologies Grand Island, NY).

Knockdown af AMPK niveauer via siRNA transfektion

Lyddæmper Select siRNA’er blev købt fra Life Technologies (Grand Island, NY), og designet til at målrette enten human AMPK

α1 eller human AMPK

α2. Celler blev transficeret under anvendelse af revers-transfektion. Enten Lyddæmper Select non-targeting negativ kontrol eller en blanding af 10 nM AMPK

α1 og 10 nM AMPK

α2 siRNA (AMPKa1, α2 siRNA) blev blandet med Lipofectamine RNAi MAX (Life Technologies Grand Island, NY) ifølge producentens protokol og tilsat til plader med 24 brønde. PANC-1 celler blev derefter udpladet på toppen af ​​siRNA /Lipofectamine RNAiMAX komplekset ved en densitet på 10

5 celler /well.in DMEM indeholdende 5 mM glucose og 10% FBS. Tre dage efter transfektion blev cellerne inkuberet i 24 timer med DMEM indeholdende 5 mM glucose og 1% FBS. Cellerne blev vasket to gange med DMEM indeholdende 5 mM glucose og inkuberet i serumfrit medium i 17 timer i fravær eller nærvær af berberin eller metformin og derefter behandlet som beskrevet i de tilsvarende figurteksterne.

Flowcytometrisk /cellecyklusanalyse

andelen af ​​celler i G

0 /G

1, S, G

2, og M-faser af cellecyklus blev bestemt ved flow-cytometrisk analyse. PANC-1-celler (2 x 10

4 celler) blev podet i DMEM indeholdende 2,5% FBS. Efter 24 timer blev kulturerne behandlet uden eller med Berberin i medium indeholdende 2,5% FBS i 3 dage. Celler blev derefter høstet ved trypsinering, centrifugeret ved 1.000

g

i 5 minutter og resuspenderet i en endelig koncentration på 10

6 celler /ml i hypotonisk propidiumiodid (PI) opløsning indeholdende 0,1% natriumcitrat, 0,3 % Trixon-X 100, 0,01% PI og 0,002% ribonuclease A. Celler blev inkuberet i 4 ° C i 30 minutter og analyseret på en FACScan (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ved hjælp af softwaren CELLQuest. Et hundrede tusinde celler blev opsamlet for hver prøve. Excitation forekom ved 488 nm og data blev indsamlet ved brug af FL2 kanalen og analyseret ved hjælp af FCS ExpressV3.

Western blot analyse

Konfluente kulturer af PANC-1 eller Mia Paca-2-celler dyrket på 3,5 cm Skålene blev vasket og derefter inkuberet i 24 timer med DMEM indeholdende 5 mM glucose og 1% FBS. Cellerne blev derefter vasket to gange med DMEM indeholdende 5 mM glucose og inkuberet i serumfrit medium i fravær eller nærvær af Berberin, metformin eller A-769.662, som beskrevet i de individuelle eksperimenter. Kulturerne blev derefter direkte lyseret i 2 × SDS-PAGE-prøvebuffer [200 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2 mM EDTA, 0,1 M Na

3VO

4, 6% SDS, 10% glycerol, og 4% 2-mercaptoethanol], efterfulgt af SDS-PAGE på 10% geler og overførsel til Immobilon-P-membraner (Millipore, Billerica, MA). Western blots blev derefter udført på membraner inkuberet natten over med de angivne antistoffer i phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,1% Tween-20. De immunreaktive bånd blev påvist med ECL (forøget kemiluminescens) reagenser (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ). De anvendte antistoffer detekteret det phosphorylerede tilstand S6K på Thr

389, S6 hos Ser

240/244 og ERK1 /2 ved Thr

202 og Tyr

204, AMPKα på Thr

172, ACC ved Ser

79 og Raptor ved Ser

792. Desuden blev det samlede niveau af disse proteiner også bedømt. Rutinemæssigt blev membranerne anvendt med phospho-specifikke antistoffer strippet og re-blottet med antistofferne, der registrerer den samlede niveau af det tilsvarende protein. Lejlighedsvis, stripning og re-blotting af den samme membran var ikke tilfredsstillende for at opnå både lastning og udtryk kontrol. I disse tilfælde, brugte vi en separat blot for at vurdere den samlede protein-ekspression og immunoblottedes den oprindelige membran til andre proteiner (f.eks actin, S6K, S6, ERK), der migrerer i en anden position i den oprindelige gel til kontrol lige belastning.

Cell Proliferation

kulturer af PANC-1 og MiaPaCa-2-celler, 3-5 dage efter passage, blev vasket og suspenderet i DMEM indeholdende 5 mM glucose. Celler blev derefter opdelt efter to passager gennem en 19-gauge nål i en i det væsentlige enkelt-cellesuspension som bedømt ved mikroskopi. Celle blev bestemt under anvendelse af en Coulter Counter, og 2 × 10

4-celler blev podet i 35 mm vævskulturplader i DMEM indeholdende 5 mM glucose og 10% FBS. Efter 24 timers inkubation blev mediet fjernet, og kulturerne skiftet til DMEM indeholdende 5 mM glucose uden eller med 3% FBS. Kulturerne blev derefter inkuberet i en fugtig atmosfære indeholdende 10% CO

2 ved 37 ° C i 4 dage, og det samlede celletal blev bestemt ud fra mindst fire retter pr tilstand under anvendelse af en Coulter-tæller, efter celleklumper blev opdelt efter passerer cellesuspensionen ti gange gennem en 19- og efterfølgende en 21-gauge kanyle.

Mus implanteret

Tidlig-passage MiaPaCa-2 celler blev høstet, og 2 × 10

6 celler blev implanteret i de rigtige flanker af mandlige

nu /nu

mus. Den mandlige

nu /nu

mus blev opretholdt i SPF-facilitet på University of California i Los Angeles (UCLA). Den UCLA kansler Forskningsudvalget Animal godkendt alle de dyreforsøg. Dyrene blev randomiseret i kontrol- og behandlede grupper (10 mus per gruppe) og fik stansede øremærker kan identificeres. Behandling blev påbegyndt, når tumorerne nåede en middeldiameter på 2 mm, og den 1. behandlingsdag i begge tilfælde blev betegnet som dag 0. Til injektion i dyr, metformin (250 mg /kg), berberine (5 mg /kg) eller køretøj (kontrol) blev givet intraperitonealt en gang dagligt intraperitonealt (50 pi /mus). Tumor volumen (

V

) blev målt ved ekstern skydelære hver 4 dage, og det blev beregnet som

V

= 0,52 (længde × bredde

2). Ved slutningen af ​​forsøget blev tumorerne dissekeres vægtet og målt. Mængden af ​​de udskårne tumorer blev beregnet som

V

= 0,52 (længde × bredde × dybde).

Statistisk analyse

Værdier er middel ± SE. Forskelle mellem grupper blev analyseret med den uparrede Students

t

-test.

Resultater

Berberin hæmmer DNA-syntesen, cellecyklusprogression og celledeling i PDAC celler

i første omgang vi bestemt effekten af ​​isoquinolin alkaloid Berberin på DNA-syntese i PANC-1 og MiaPaCa-2-celler, som er blevet anvendt i udstrakt grad som modeller for PDAC celler. Kulturer af disse celler dyrket i medium indeholdende 10% føtalt bovint serum blev vasket og overført til serumfrit medium i 24 timer. Derefter blev cellerne skiftet til medium indeholdende en fysiologisk koncentration af glucose (5 mM), stigende doser af berberin og en kombination af insulin (10 ng /ml), og GPCR-agonist neurotensin (5 nM) til at fremkalde potente mitogene krydstale signalering [ ,,,0],20], [21], [46]. Behandling med berberine inhiberede stimuleringen af ​​DNA-syntese på en dosis-afhængig måde i begge PANC-1 og MiaPaCa-2-celler. Ved en koncentration på 3 uM, berberine inhiberede DNA-syntese med 82% i MiaPaCa-2-celler og med 76% i PANC-1-celler. Inkorporeringen af ​​[

3H] -thymidin blev blokeret med 97% i MiaPaCa-2-celler og med 94% i Panc-1-celler som respons på 6 uM Berberin (fig. 1 A).

A blev Mia PaCa-2 eller PANC-1 celler inkuberet uden (

åbne søjler

) eller med 5 nM neurotensin og 10 ng /ml insulin (

lukkede barer

) i nærværelse af stigende koncentration af berberine i 17 timer ved 37 ° C før tilsætning af [

3H] -thymidin i 6 timer. Radioaktiviteten inkorporeret i syre-uopløselige puljer blev målt i en scintillationstæller som beskrevet i “Materialer og Metoder. De viste værdier er middelværdien ± SEM opnået i 3 uafhængige forsøg; B, blev PANC-1-celler behandlet uden (kontrol) eller med berberine 1.5 uM eller 3 um i medium indeholdende 2,5% FBS i 3 dage (angivet med cont., FBS, FBS +1,5 Ber og FBS +3 Ber). Celle cyklus blev analyseret ved PI-farvning og flowcytometri. Lignende resultater blev opnået i 3 uafhængige eksperimenter. C, Single-cellesuspension af Mia PaCa-2 eller PANC-1-celler blev udpladet på vævskulturskåle med en densitet på 2 x 10

4 celler pr skål. Efter 24 timers inkubation blev mediet fjernet og kulturerne skiftet til medium uden eller med 3% FBS i fravær (åbne søjler) eller nærvær (lukkede søjler) 3 pM berberine. Kulturerne blev inkuberet i 4 dage, som beskrevet i “Materialer og metoder”. Celletal blev bestemt ud fra 4 til 6 gentagne plader pr tilstand under anvendelse af en Coulter Counter. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM af 3 biologiske replikater.

assays af [

3H] -thymidin inkorporering blev suppleret med flowcytometrisk analyse for at bestemme den andel af PDAC celler i de forskellige faser af cellecyklussen. Som vist i fig. 1B, eksponering af Panc-1-celler til berberine (1,5-3 uM) inducerede en markant stigning i andelen af ​​celler i G

1 (fra 61 ± 0,2% i celler med FBS til 79 ± 2% i celler med FBS og berberine) og et tilsvarende fald i andelen af ​​celler, der var i S og G

2 /M-fasen af ​​cellens cyklus (fra 36 ± 0,1% til 19 ± 0,7%). Disse resultater indikerer, at berberin forsinker progression af PDAC cellecyklus ved G

1.

Vi undersøgte dernæst virkningen af ​​berberin på proliferationen af ​​pankreatiske cancerceller. Enkeltcellesuspensioner af enten PANC-1 eller MiaPaCa-2-celler blev udpladet og inkuberet i medium suppleret med eller uden 3% FBS i fravær eller nærvær af 3 uM berberine. Behandling med berberine markant inhiberede proliferation i både PDAC celler (Fig. 1C) uden at påvirke cellernes levedygtighed ved de testede doser (resultater ikke vist). Tilsammen resultaterne i fig. 1 viser, at Berberin hæmmer DNA-syntese, cellecyklus progression og spredning i bugspytkirtelkræftceller.

Berberin og metformin hæmmer væksten af ​​en PDAC xenograft i nøgne mus

Da vores resultater viser hæmmende effekter af berberine på PDAC celledeling

in vitro

, vi efterfølgende afgøres, om dette stof hæmmer bugspytkirtlen vækst kræft

in vivo

hjælp MiaPaCa-2 tumorxenoplantater i nøgne mus. De xenotransplantater blev afledt ved implantation af 2 × 10

6 celler i de rigtige flanker af mandlige

nu /nu

mus. Dyrene blev randomiseret i kontrol- og Berberin-behandlede grupper (10 mus pr gruppe). Berberine blev givet en gang dagligt intraperitonealt med 5 mg /kg for varigheden af ​​eksperimentet. Som vist i fig. 2, administration af berberinchlorid faldt væksten af ​​MiaPaCa-2-celler xenotransplanterede i nøgne mus med 70%. Tumorvolumenerne i slutningen af ​​forsøget (dag 29) var 781 mm

3 i kontrolgruppen og 240 mm

3 i berberin behandlede gruppe (p 0,001). Dosis af Berberin anvendte (5 mg /kg) er 12 gange lavere end LD

50, baseret på foreløbige range finding studier og tidligere arbejde udgivet af andre [53], [68], [69]. Berberine var veltolereret og påvirkede ikke signifikant vægten af ​​mus under behandlingen (fig. 2, B). Den inhibitoriske virkning af Berberin var sammenlignelig med induceret af metformin givet ved 250 mg /kg (Fig. 2), en dosis, der inducerer maksimal inhiberende virkning på PDAC tumorvækst [70]. Faktisk kurverne svarer til væksten af ​​MiaPaCa-2 xenotransplantater i mus behandlet med berberine eller metformin var næsten overlejres i de første 24 dage (fig. 2, A). På dag 29, metformin var lidt mere effektiv end Berberin vurderet ved tumor volumen (p 0,05), men effekten ikke nåede statistisk signifikans (p 0,07), når scoret af tumor vægt (figur 2, B.). Disse resultater indikerer, at Berberin hæmmer væksten af ​​humane bugspytkirtelkræftceller xenotransplanteret til nøgne mus med virkningsfuldhed sammenlignes med den, der opnås ved en maksimal dosis metformin.

xenotransplantater af MiaPaCa-2 blev genereret ved implantation af 2 × 10

6 celler i de rigtige flanker af mandlige

nu /nu

mus. Når tumorerne nåede en middeldiameter på 2 mm blev dyrene randomiseret i kontrol- og behandlede grupper (10 mus per gruppe). Berberine blev givet en gang dagligt intraperitonealt med 5 mg /kg for varigheden af ​​eksperimentet. Til sammenligning blev metformin givet intraperitonealt til en anden gruppe mus ved 250 mg /kg. Den 1

st behandlingsdag blev betegnet som dag 0. Kontroldyr fik en tilsvarende mængde saltvand. A blev Tumorvoluminer målt hver 4. dag som beskrevet i “Materialer og metoder”. Ved slutningen af ​​forsøget (dag 29, blev tumorerne fjernet, vejet og målt, og tumorvolumener anslået som

V

= 0,52 (længde x bredde x dybde). Resultaterne er vist i panel B (middelværdi ± . SEM) Behandling af mus med Berberin reducerede signifikant volumen og vægt af tumorerne sammenlignet med tumorerne fra kontrolgruppen (p. 0,001), som indikeret En lignende inhibering af tumorvækst blev opnået ved administration af metformin (p .. 0,001) kurverne svarende til væksten af ​​MiaPaCa-2 xenotransplantater i mus behandlet med berberine eller metformin blev overlejres i de første 24 dage på dag 29, metformin var lidt mere effektivt end berberine som vurderet ved tumorvolumen (p 0,05) men forskellen af ​​virkningerne mellem disse stoffer ikke nåede statistisk signifikans (p 0,07). når scoret af tumor vægt (. figur 2, B) ved de anvendte koncentrationer, Berberin og metformin var veltolereret uden nogen tilsyneladende toksicitet baseret på kroppen vægtændringer.

Berberin inducerer mitokondrie membran depolarisering, reducerer niveauet af ATP og stimulerer AMPK i bugspytkirtelkræftceller

Efter at have fastslået, at Berberin hæmmer PDAC celledeling

in vitro

og

in vivo

, vi næste udforsket de involverede mekanismer. I andre celletyper, er berberinchlorid menes at inhibere kompleks I i den mitokondriske respiratoriske kæde [71], [72], hvilket resulterer i reduceret ATP-syntese og ledsagende stigning i cellulær AMP og ADP, som er kraftige allosteriske aktivatorer af AMPK [73] – [ ,,,0],75]. Fordi det ikke vides, om berberine har nogen effekt på mitokondrisk funktion i bugspytkirtelkræftceller, vi oprindeligt undersøgt, om dette fytokemiske forstyrrer mitokondrielle membranpotentiale i disse celler. Kulturer af MiaPaCa-2 og PANC-1-celler blev inkuberet i fravær eller nærvær af 3 uM berberin eller 1 mM metformin, medtaget til sammenligning. Derefter mitokondrielle membran potentiale, et centralt element kørsel ATP-syntese, blev vurderet ved hjælp af mitokondrie-specifikke fluorescerende probe JC-1 [76]. Som vist i fig. 3 A, Berberin forårsagede et markant fald i mitochondriemembranpotential i MiaPaCa-2 og PANC-1 celler. Virkningen var sammenlignelig med induceret af metformin (fig. 3 A). Disse resultater indikerer, at berberine, ligesom metformin målretter mitokondriefunktion i PDAC celler. Følgelig eksponering for stigende koncentrationer af berberin eller metformin resulteret i en markant dosisafhængigt fald i de intracellulære ATP-niveauer i både PANC-1 og MiaPaCa- 2-celler (fig. 3 B). Salg

A, kulturer af PANC -1 og MiaPaCa-2-celler blev inkuberet i fravær eller i nærvær af 3 uM Berberin (Berb) eller 1 mM metformin (Met) i 17 timer i DMEM indeholdende 5 mM glucose. Ændringen i mitochondriemembranpotential blev målt ved anvendelse af mitokondrielle membranpotentiale indikator JC-1. Resultaterne er udtrykt som et gennemsnit forhold af rød /grøn fluorescerende intensitet i et enkelt synsfelt (gennemsnit ± SEM). Mindst 5 felter blev undersøgt i hver tilstand. P-værdier blev bestemt under anvendelse af t-test (SigmaPlot 12.); * P 0,002. B blev kulturer af PANC-1 og MiaPaCa-2-celler inkuberet i fravær eller i nærvær af berberin eller metformin i de angivne koncentrationer i 17 timer i DMEM indeholdende 5 mM glucose og 2,5% FBS. C, Kulturer af PANC-1 (øvre paneler) og MiaPaCa-2 (nedre paneler) inkuberet i fravær eller i nærvær af berberin i de angivne doser i 17 timer. Derefter blev cellerne stimuleret i 1 time med 5 nM neurotensin og 10 ng /ml insulin og lyseret med 2 x SDS-PAGE-prøvebuffer. Prøverne blev analyseret ved SDS-PAGE og immunoblotting med antistoffer, der registrerer den phosphorylerede tilstand af acetyl-CoA-carboxylase (ACC) ved Ser

79. Western blotting for actin blev anvendt til at verificere lige belastning i den samme membran og en separat gel bekræftede, at ekspression af total ACC-protein ikke blev ændret af nogen af ​​behandlingerne. D, Kvantificering blev udført ved hjælp af Multi Gauge V3.0. Værdierne repræsenterer middelværdien ± SEM; n = 3, fold stigning i ACC fosforylering ved Ser

79. Indpresningsdybde, phosphoryleret tilstand af AMPK på Thr

172 ved de angivne koncentrationer af Berberin (uM).

Derefter bestemte vi, om berberine stimulerer AMPK aktivitet i intakt MiaPaCa-2 og PANC-1-celler. Lysater af disse celler blev analyseret ved immunoblotting under anvendelse af antistoffer, der registrerer den phosphorylerede tilstand af acetyl-CoA-carboxylase (ACC) ved Ser

79, en rest direkte phosphoryleret af AMPK og anvendes som en biomarkør for AMPK aktivitet i intakte celler [75] . Behandling med berberine inducerede en markant stigning i phosphorylering af ACC ved Ser

79 på en dosis-afhængig måde i begge PANC-1 og MiaPaCa-2-celler (figur 3, C,.. Kvantificering i figur 3 D). Maksimal virkning blev fremkaldt ved doser 2 uM i begge PDAC celler (figur 3 D.). Endvidere behandling af MiaPaCa-2 eller PANC-1 celler med berberine inducerede en slående stigning i phosphorylering af AMPK på Thr

172, remanensen i kinasedomænet af den katalytiske underenhed (α) af AMPK kritisk for aktivering (Inserts i fig. 3 D). Kollektivt Resultaterne viser, at berberine nedsætter mitokondrielle membranpotentiale og sænker intracellulære niveauer af ATP så den stimulerer AMPK aktivitet i PDAC celler dyrket i medium indeholdende en fysiologisk koncentration af glucose (5 mM).

Berberin hæmmer mTORC1 og ERK-aktivering i PDAC celler

aktiveringen af ​​PI3K /Akt /mTORC1 og MEK /ERK veje spiller en central rolle i at stimulere DNA-syntese, cellecyklus progression og spredning af PDAC celler og er negativt reguleret af AMPK [21]. Derfor bestemte vi, om Berberin hæmmer mTORC1 og ERK-aktivering i PDAC celler. Kulturer af MiaPaCa-2-celler blev behandlet med stigende doser af berberin og derefter stimuleret med en kombination af insulin og neurotensin at fremkalde positiv krydstale (fig. 4).