PLoS ONE: Dual-Energy Micro-CT Funktionel Billeddannelse af Primary lungekræft i mus Brug Guld og Jod Nanopartikel kontrast befuldmægtigede: en valideringsundersøgelse

Abstrakt

Formål

For at give yderligere funktionel information til tumor karakterisering, undersøgte vi brug af dual-energi computertomografi til billeddannelse murine lunge tumorer. Tumor blodvolumen og vaskulær permeabilitet blev kvantificeret under anvendelse af guld og jod nanopartikler. Denne fremgangsmåde blev sammenlignet med en enkelt kontrastmiddel /single-energi CT-metoden.

Ex vivo

valideringsundersøgelser blev udført for at demonstrere nøjagtigheden af ​​

in vivo

kontrastmiddel kvantificering af CT.

Metoder

Primære lunge tumorer blev genereret i

LSL-Kras

G12D; p53

FL /FL

mus. Guld nanopartikler blev injiceret, efterfulgt af jod nanopartikler to dage senere. Guldet akkumuleret i tumorer, mens iod billede intravaskulær kontrast. Tre dual-energi CT-scanninger blev udført-to for enkelt kontrastmiddel fremgangsmåde og en til den dobbelte kontrastmiddel metode. Guld og jod koncentrationer i hver scanning blev beregnet under anvendelse af en dual-energi nedbrydning. For hver metode blev fraktioneret blodvolumen tumoren beregnet på baggrund af jod-koncentration, og tumor vaskulær permeabilitet blev anslået på grundlag af akkumulerede guld koncentration. For validering blev CT-afledte målinger sammenlignet med histologi og induktivt koblet plasma optisk emission spektroskopi målinger af guld koncentrationer i væv.

Resultater

Dual-energi CT aktiveret

in vivo

separation af guld og iod kontrastmidler og viste optagelse af guld nanopartikler i milten, leveren og tumorer. De fraktioneret blodvolumen målinger tumor bestemt fra de to billeddiagnostiske metoder var enige, og en høj korrelation (R

2 = 0,81) blev fundet mellem målt fraktioneret blodvolumen og histologi-afledt mikrovaskulære tæthed. Vaskulær permeabilitet målinger opnået fra de to billeddiagnostiske metoder aftalt godt med

ex vivo

målinger.

Konklusioner

Dual-energi CT ved hjælp af to typer af nanopartikler svarer til det indre nanopartikel metode, men tillader måling af fraktioneret blodvolumen og permeabilitet med en enkelt scanning. Som bekræftet af

ex vivo

metoder, CT-afledte nanopartikler koncentrationer er nøjagtige. Denne metode kunne spille en vigtig rolle i lunge tumor karakterisering af CT

Henvisning:. Ashton JR, Clark DP, Moding EJ, Ghaghada K, GD Kirsch, West JL, et al. (2014) Dual-Energy Micro-CT Funktionel Billeddannelse af Primary lungekræft i mus Brug Guld og Jod Nanopartikel kontrast befuldmægtigede: en valideringsundersøgelse. PLoS ONE 9 (2): e88129. doi: 10,1371 /journal.pone.0088129

Redaktør: Tanya V. Kalin, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: September 5, 2013; Accepteret: 6 jan 2014; Publiceret: 10. februar, 2014

Copyright: © 2014 Ashton et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra en National Institutes of Health /National center for Research Resources National Biomedical Technology Resource center tilskud (P41 EB015897) (CTB), og fra National Cancer Institute U54 CA151668 (JLW). Andre støtte blev leveret af NIH /NCI R21 CA175839 og NIH /National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme K02 AI093866 (DGK). JRA er understøttet af en medicinsk Scientist Training Program Training Grant (T32 GM007171) og en hertug Institutional Fellowship. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. KG besidder aktieoptioner i Marval Biosciences, en start-up virksomhed forfølger udviklingen af en liposomal ioderet CT kontrastmiddel. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Lungekræft er stadig den hyppigste årsag til kræft død på verdensplan, og antallet af dødsfald som følge til lunge forventes kræft at stige 50% i 2020 [1]. Computertomografi (CT) er den standard billeddannelse test til vurdering af patienter med formodet lungekræft. Desværre, maligne og benigne lunge knuder viser ofte lignende radiografiske funktioner i CT [2], så malignitet kan ikke altid være korrekt identificeret og behandlet. I National Lung Cancer Screening Trial (NLCST), CT screening i højrisiko patienter reducerede lungekræft dødelighed [3], og USA Forebyggende Services Task Force har for nylig anbefalet rutinemæssig CT lungekræft screening for højrisikopatienter; men denne screening uundgåeligt fører til detektering af små lungeknuder ( 1 cm), som ikke velkarakteriseret ved aktuelt tilgængelige billedmodaliteter (PET, CT, eller MRI) [4]. Den NLCST bevist, at de fleste af disse knuder er ikke klinisk signifikant. Derfor er der et behov for at udvide de oplysninger, som CT billeddannelse til knuder karakterisering-både til karakterisering kendte tumorer og for differentiering nyligt registrerede maligne tumorer fra benigne knuder.

En mulig metode til yderligere tumor karakterisering er at studere lunge tumorvaskulatur. Angiogenese er en afgørende faktor for vækst cancer og metastaser. Især angiogenese fremmer tumorvækst ved at levere tumorer med nødvendige næringsstoffer og tilvejebringer en ledning for metastatisk spredning. Tumor kar dannet af hurtig angiogenese tendens til at være mindre velorganiseret og mere gennemtrængelige end normalt kar [5]. Densiteten af ​​tumorvaskulatur, som ofte korreleret med omfanget af angiogenese, er relateret til tumor aggressivitet og kan korrelere med overlevelse [6]. Der er også tegn på, at omfanget af vaskularisering og vaskulær permeabilitet varierer mellem benigne og maligne lungeknuder [7]; dog mere omfattende undersøgelser, som er bedst udføres på den prækliniske niveau, er der behov for at belyse betydningen af ​​disse vaskulære biomarkører i lungekræft.

Brug prækliniske undersøgelser i mus, vi har tidligere vist, at indolent og aggressiv lunge tumorer kan differentieres ved anvendelse af enkelt energi mikro-CT og en iodholdig liposomal (Lip-I) kontrastmiddel [8]. Øget akkumulering af nanopartikler (større vaskulær permeabilitet) blev påvist i mere aggressive tumorer sammenlignet med indolent dem, mens vaskulær densitet var ens i de to tumortyper. eksperimenter de enkelt kontrastmiddel kræves to CT-scanninger adskilt af flere dage for at muliggøre fuldstændig blodclearance af kontrastmidlet for at kvantificere og differentiere vaskulær signal fra tumorakkumulering signal. Forsinkelsen mellem tidlig og forsinket fase billeddiagnostik kan ikke være nødvendig, hvis vi vedtager en mere elegant løsning, der involverer to forskellige typer af nanopartikler og CT billeddiagnostiske metoder såsom spektral eller dual-energi (DE) CT.

DE billedbehandling er en avanceret teknik, der for nylig steget til forkant med CT-teknologi [9]. Absorption af røntgenstråler ved kontrastmidler er stærkt afhængig af både kontrastmidlet s atomvægt og energien af ​​den indfaldende røntgen. Således kan to materialer med forskellig atomvægt differentieres fra hinanden baseret på deres unikke attenuationkoefficienter ved to forskellige røntgenenergier. DE-CT tillader selektiv visualisering og kvantificering af multiple kontrastmidler i en enkelt scanning. DE-CT har gjort betydelige fremskridt i klinisk cancer billeddannelse. For lungetumorer, er det blevet vist, at iod forbedring i kliniske DE-CT-scanninger kan korreleres med SUV

max

18FDG- PET [10], [11], der viser, at DE-CT har potentiale at forlænge CT billeddannelse end rent anatomisk billeddannelse til funktionel og molekylær billeddannelse. Mens DE-CT viser høj løfte i klinikken for kræft billedbehandling, det har ikke været stort set vedtaget i prækliniske domæne på grund af de udfordringer, der er forbundet med højere rumlig opløsning, tidsmæssig opløsning, og støjniveauet i mikro-CT. Vi har dog været i stand adresse nogle af disse udfordringer og har vist, at DE mikro-CT ved hjælp af nanopartikler som kontrastmidler kan spille en vigtig rolle i præklinisk billeddannelse til hjertestop [12], lunge [13], og kræft applikationer [14] , [15].

nanopartikler kontrastmidler er afgørende for prækliniske CT studier, fordi konventionelle kontrastmidler er elimineret fra blodbanen for hurtigt for effektiv billeddannelse. De fleste prækliniske dyremodeller, især mus, er i stand til renalt klare lavmolekylære kliniske kontrastmidler fra deres blod inden sekunder (normalt blod halveringstid hos mennesker er 2-3 timer [16]), på grund af deres ekstremt høje minutvolumen. Nanopartikler anvendes som CT kontrastmidler har typisk en lang ( 2 timer) halveringstid og også en tendens til at ophobe sig i tumorer på grund af den forbedrede permeabilitet og fastholdelse (EPR) effekt [17]. Nytten af ​​disse midler i præklinisk CT scanning er blevet veletableret [14], [18] – [24]

Vi har for nylig udviklet en DE mikro-CT metode til at adskille guld og jod-baserede nanopartikler for. vaskulær billeddannelse i bløddelssarkomer [14]. Ved denne fremgangsmåde er nanopartikler af guld injiceres og fik lov til at akkumulere i tumorvæv i to dage. Liposomal iod injiceres derefter og umiddelbart efterfulgt af en DE-CT-scanning, medens iod forbliver intravaskulære. Vaskulær permeabilitet (hastighed af tumor nanopartikel optagelse) beregnes ved hjælp af den målte koncentration guld i vævene, mens blodvolumen beregnes fra væv iodkoncentrationer. Den nuværende arbejde har til formål at anvende DE mikro-CT-metoden til den udfordrende opgave at imaging lungetumorer til kvantificering af tumor blodvolumen og vaskulær permeabilitet. I denne undersøgelse viser vi, at de to kontrastmidlet (to-materiale) metoden, som kun kræver et enkelt CT-scanning, tåler sammenligning med vores tidligere offentliggjorte enkelt kontrastmiddel (single-materiale) metoden, som kræves to CT-scanninger afstand anbragte adskillige dage bortset [8]. Vigtigt er det, vi sigter også at validere vores

in vivo

dual-energi resultater med

ex vivo

guld standard målinger. Så vidt vi ved, har der ikke været publicerede kliniske eller prækliniske DE-CT studier med streng validering af beregnede

in vivo

materielle koncentrationer. DE-målinger er normalt kalibreret ved hjælp

in vitro

fantomer, som omtrentlige, men ikke fuldt ud repræsentere,

in vivo

betingelser. Derfor er der potentiale for betydelig fejl i DE målinger, når stoler kun på in vitro-fantom kalibreringer. I dette manuskript, vi forpligter

in vivo

validering, som er afgørende for at videreudvikle DE-CT for prækliniske modeller.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyr blev behandlet i overensstemmelse med god dyr praksis som defineret af de relevante nationale og /eller lokale dyrevelfærd organer, og alle dyr arbejde blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC protokol A283-11-11) af Duke University Medical center. The Duke University Medical Center dyr management program er akkrediteret af American Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC) og opfylder National Institutes of Health standarder som beskrevet i “Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr” (DHHS publikation nr (NIH) 85-23, Revideret 1985). Institutionen accepterer også som obligatoriske PHS “Politik for Humane Pleje og anvendelse af forsøgsdyr ved tilbudsgiveren institutioner” og “NIH principper for udnyttelse og pleje af hvirveldyr, der anvendes i Testing, forskning og uddannelse.”.

liposomalt jod Fabrication

liposomal jod blev produceret som tidligere [25] beskrevet. En lipidblanding (200 mmol /l), der består af 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC), cholesterol og 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N- [methoxy ( polyethylenglycol) -2000] (DSPE-MPEG 2000) i et 55:40: 5 molært forhold blev opløst i ethanol og hydreret med en koncentreret iodixanol opløsning (550 mg i /ml). Den resulterende lipid opløsning blev sekventielt ekstruderet på en Lipex Thermoline ekstruder (Northern Lipids, Vancouver, British Columbia, Canada) til størrelse liposomerne til ~ 100 nm. Liposomet opløsningen diafiltreres ved hjælp af en MicroKros® modul (Spectrum Laboratories, Milpitas, CA) til at fjerne un-indkapslet iodixanol.

liposomalt Jod Karakterisering

Størrelsesfordelingen af ​​liposomer i den endelige formulering var bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS) under anvendelse af en Malvern Zetasizer Nanoseries (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) ved 25 ° C. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) blev udført for yderligere størrelsesanalyse og kontrastmiddel karakterisering. Liposomer var perfekte tørret på en carbon film gitter og filmede med et FEI Tecnai G

2 Twin TEM (FEI, Hillsboro, OR) på en driftsspænding på 120 mV. Partikeldiameter blev målt for 200 liposomer under anvendelse ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/, NIH). Koncentrationen af ​​jod i den endelige liposomale opløsning blev kvantificeret ved måling af UV-absorbans ved 245 nm under anvendelse af et Cary 50 spektrofotometer (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA).

In vitro

stabilitet af liposomerne blev verificeret ved måling frigivelse af iodixanol fra liposomerne efter inkubation i phosphatpufret saltvand (PBS) ved 37 ° C i 72 timer. Koncentrationen af ​​iodixanol frigivet efter inkubation blev bestemt ved dialyse liposomerne mod 500 ml PBS og måle UV-absorbans af dialysat i en kvarts cuvette.

Guld Nanopartikel Fabrication

Guld nanopartikler (AuNPs) blev fremstillet ved anvendelse af Frens metoden [26]. 500 ml af en 1 mM opløsning af HAuCl

4 i ultrarent vand blev bragt til kogning. En forvarmet opløsning af 540 mg natriumcitrat opløst i 3 ml vand blev hurtigt injiceret i guld opløsningen og den resulterende blanding blev omrørt kraftigt. Farven ændredes fra gul til farveløs til mørkerød i løbet af 30 sekunder. Reaktionen blev fortsat ved kogning i 15 minutter, hvorefter reaktionsbeholderen blev fjernet fra varmekilden og afkøledes under fortsat omrøring i 1 time. Efter afkøling blev de nanopartikler filtreret ved anvendelse af et 0,45 um polyethersulfon-filter. At passivere de producerede nanopartikler, et stort overskud af 5 kDa thiol-termineret polyethylenglycol (PEG; Laysan Bio, Arab, AL) blev tilsat til de filtrerede nanopartikler, som derpå blev rystet ved stuetemperatur i 4 timer. Ubundne PEG-molekyler blev fjernet og partiklerne koncentreres under anvendelse af en 100 kDa centrifugal filter.

Guld Nanopartikel Karakterisering

Størrelsesfordelingen og overfladeladning af nanopartiklerne af guld blev karakteriseret ved DLS og zetapotentialet bruger Malvern Zetasizer Nanoseries ved 25 ° C. DLS fordeling størrelse blev bekræftet ved TEM hjælp af en FEI Tecnai G

2 Twin TEM arbejder ved 200 mV. Partikel diameter og skærmformat blev målt til 200 AuNPs hjælp ImageJ. Absorbansspektre af AuNPs suspenderet i ultrarent vand blev opsamlet fra 400 til 650 nm ved anvendelse af et UV-Vis spektrofotometer. Stabilitet af PEGylerede nanopartikler mod aggregering blev bekræftet ved at overvåge UV-Vis-spektret i 6 timer efter tilsætning af fysiologiske saltopløsninger 0,9% NaCl eller Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) dyrkningsmedium med 10% føtalt bovint serum (FBS) til opløsninger af nøgne eller PEGyleret AuNPs. Den endelige koncentration af guld i koncentreret AUNP opløsningen blev bestemt ved UV-Vis-absorbans anvendelse af den publicerede ekstinktionskoefficient på 12 nm AuNPs ved 450 nm [27] og blev efterfølgende korreleret med målinger fra induktivt koblet plasma optisk emission spektroskopi (ICP-OES ), som beskrevet nedenfor.

In vivo

Tumor Imaging

lungetumorer blev dannet ved intranasal injektion af adenovirus, der udtrykker Cre-rekombinase (Gene Transfer Vector Core, University of Iowa) i

LSL-Kras

G12D; p53

FL /FL

Forbindelse mutant mus som beskrevet tidligere [28] – [30]. Mus med primære lungetumorer blev anvendt til billeddannelse undersøgelse på 12 uger efter Adeno-Cre-infektion, på hvilket tidspunkt flere aggressive lunge adenocarcinomer (~0.5-1.5 mm i diameter) var til stede i hver mus. Alle dyr blev afbildet ved 24-30 ugers alderen. I alt fem dyr blev anvendt til det billeddannende undersøgelse. På grund af den langsgående arten af ​​denne undersøgelse, hver mus tjente som sin egen kontrol.

Langsgående DE micro-CT-billeddannelse blev udført i alle dyr som vist i figur 1. Tre DE mikro-CT-scanninger blev udført for hver mus for at kunne sammenligne single-materiale metode (CT-scanninger 1 og 2) med vores nye to-materiale metode (CT-scanning 3). Vi bemærker, at i modsætning til vores tidligere undersøgelse [14], DE-mikro-CT blev udført selv når der anvendes en enkelt kontrastmiddel, hvilket tillod os at måle guld koncentration uden behov for en sammenligning pre-kontrast scanning. På dag 1 blev AUNP kontrastmiddel injiceret intravenøst ​​ved halevenen i en dosis på 0,32 ml /25 g kropsvægt og efter injektion scanninger (CT scanning 1) volumen blev straks erhvervet. Vi ventede derefter 48 timer til at give tilstrækkelig tid til guld ophobning at forekomme i de tumorer. Efter denne forsinkelse (dag 3) en anden dobbelt-energi CT-scanning (CT-scanning 2) blev opnået. Umiddelbart efter den anden scanning, blev det liposomale iod kontrastmiddel injiceret ved halevenen i en dosis på 0,3 ml /25 g kropsvægt og en tredje dobbelt energi CT-scanning (CT-scanning 3) blev udført volumen. Efter den tredje scanning blev musene aflivet og væv blev høstet for valideringsstudier, som beskrevet nedenfor.

AuNPs blev injiceret på dag 1, umiddelbart efterfulgt af CT-scanning 1. To dage senere, CT-scanning 2 blev gjort , umiddelbart efterfulgt af Lip-I injektion og CT-scanning 3. Alle scanninger var dual-energi mikro-CT opkøb.

Dual-Energy Micro-CT System

En specialbygget dual-source mikro-CT imaging system blev anvendt til undersøgelse [31]. Dyrene blev scannet, mens fri vejrtrækning under anæstesi ved hjælp 2-3% isofluran leveret af næse-kegle. Kropstemperaturen blev opretholdt med varmelamper, en rektal sonde og en feedback-styreenhed (Digi-Sense®, Cole Parmer, Chicago, IL). Prospektiv respiratorisk gating blev anvendt til at minimere effekten af ​​animalsk respiratorisk bevægelse under scanninger [32]. En pneumatisk pude placeret på dyrenes thorax forbundet til en tryktransducer blev anvendt til at overvåge vejrtrækning. En LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) Ansøgningen blev anvendt til at overvåge det respiratoriske signal og udløse røntgenrør ultimo udløb ved at beregne en fast tidsforsinkelse fra toppen respiratoriske signal. Opkøb blev udført for både billeddannende kæder ved hver vinkel rotation med en 10 ms forsinkelse mellem de to røntgenrør eksponeringer for at minimere cross-scatter. Da dette er en meget kort forsinkelse i forhold til længden af ​​den flade ende eksspiratorisk fase, betyder det ikke påvirker udførelsen af ​​respiratorisk gating. I alt 360 visninger blev erhvervet for hver imaging kæde over 360 ° rotation. Hver prospektivt-gated scanning tog ca. 7 minutter at fuldføre. De scanning parametre for dual-energi scanninger var: 80 kVp, 160 mA, 10 ms /eksponering for første billedbehandling kæde og 40 kVp, 250 mA, 16 ms /eksponering for anden billeddannelse kæden. Den totale stråledosis forbundet med de tre CT-scanninger var 0,39 Gy.

Efterbehandling og Dual-Energi Nedbrydning

DE mikro-CT databehandling fulgte flowdiagrammet i figur 2. Raw 40 kVp og 80 KVP datasæt blev rekonstrueret under anvendelse af Feldkamp algoritmen [33] i en matrix af 512 × 512 × 512 ved 88-um isotrope voxelstørrelsen. Affine registrering blev udført for at forbedre registreringen mellem tilsvarende 40 og 80 kVp rekonstrueret mængder ved hjælp af myrer, en open-source, ITK-baserede registrering Toolkit (Advanced Normalisering Værktøj, https://picsl.upenn.edu/ANTS/, svn 1409; [ ,,,0],34], [35]). For at forbedre nedbrydning blev hver datasæt denoised hjælp fælles bilaterale filtrering (BF). Fælles BF er en spektral forlængelse af den velkarakteriserede kant-bevare udjævning filter, der betragter fordelingen af ​​tilstødende voxel i både plads og intensitet. Fælles BF blev gennemført ved hjælp af MATLAB (MathWorks, Natick MA), og generelt afsluttet inden for 15 til 20 minutter pr sæt energier. Nærmere oplysninger om anvendelsen af ​​fælles BF murine mikro-CT-data [36] og en kvantitativ vurdering af anvendelsen af ​​BF til DE mikro-CT [13] er blevet beskrevet tidligere.

Raw 40 kVp og 80 KVP datasæt blev erhvervet, og så gennemgik affine registrering og fælles bilaterale filtrering til at producere filtrerede datasæt. Dual-energi nedbrydning blev udført på disse filtrerede billeder, hvilket resulterede i to uafhængige billeder (kort), der repræsenterer den jod og guld koncentration i hver voxel. Efter opnåelse af de to kort, blev billederne belagte samt knoglerne blev segmenteret ud (hvid) til dannelse af den endelige koncentration Kortoverlejring. Disse billeder blev taget fra CT-scanning 3, hvor både jod og guld var til stede i blodet. Skalaen søjle repræsenterer 1 cm i alle billeder. De 40 og 80 KVP billeder er windowed fra -300 til 1200 HU er de jod kort windowed fra 0,25 til 15 mg /ml, og guld kort er windowed fra 0,25 til 6 mg /ml.

DE nedbrydning af guld og iod blev udført efter registrering og filtrering, anvendelse af tilsvarende 80 og 40 kVp-filtrerede data, som tidligere beskrevet [14], [37]. For hver voxel, nedbrydningen involveret løse et system af to ligninger med to ubekendte, C

I og C

Au, som repræsenterer koncentrationerne af jod og guld, henholdsvis inden for den givne voxel. Den målte CT dæmpningsværdi i hver voxel repræsenterer en lineær kombination af de ukendte guld og iod koncentrationer i mg /ml multipliceret med koefficienterne af CT følsomhed matrix som vist i de følgende ligninger:

Her C

i og C

Au er de ukendte koncentrationer af iod og guld henholdsvis i en given voxel, CT

40 og CT

80 er de målte dæmpninger i voxel ved 40 og 80 kVp og CT

i, 40, CT

i, 80, CT

Au, 40 og CT

Au, 80 er empirisk bestemt koefficienter af den konstante følsomhed matrix for iod og guld på 40 og 80 kVp i målte dæmpning (HU-enheder) pr kontrastmiddel koncentration (mg /ml). De ukendte koncentrationer af jod og guld i hver voxel blev bestemt ved at invertere denne følsomhed matrix og finde den mindste kvadraters løsning af følgende system af ligninger i MATLAB:

Scanning energier for optimal guld og jod nedbrydning blev udvalgt efter resultaterne af vores tidligere simuleringer og

in vitro

undersøgelser [37]. Disse undersøgelser viste, at den maksimale spektrale forskel mellem guld og iod for polykromatiske røntgen kilder forekom ved driftsspændinger på 40 og 80 kVp. Værdier for koefficienter følsomhed matrix ved hver energi (CT

I, 40, CT

I, 80, CT

Au, 40, og CT

Au, 80) blev bestemt empirisk ved hjælp af en kalibrering phantom som tidligere beskrevet [14]. For fantom kalibrering, blev CT dæmpning af hætteglas med kendt guld og iod-koncentration, målt ved 40 og 80 kVp, og koefficienterne for følsomhed matrix blev bestemt ved tilpasning af kendte guld og iodkoncentrationer til den målte CT dæmpning ved anvendelse af en lineær mindste kvadrater regression på hvert energiniveau. De afledte værdier for CT

I, 40, CT

I, 80, CT

Au, 40 og CT

Au, 80 anvendt i denne undersøgelse var 28,7, 42,6, 88,5, og 58,8 HU /mg /ml. Efter nedbrydning blev voxel med negative koncentrationer af begge materialer sat til nul. Voxel med negativ koncentration af et materiale, og en positiv koncentration af det andet materiale blev projiceret på underrum af positive koncentration.

In vitro

validering af denne nedbrydning metode ved hjælp af både digitale og fysiske fantomer er blevet vist i vores tidligere arbejde [14]. Disse valideringsstudier demonstreret evne af denne nedbrydning metode til nøjagtigt at måle guld og iodkoncentrationer både når de er uafhængige af hinanden, og når de er til stede i den samme voxel.

Image Analysis

CT billeder blev analyseret under anvendelse Avizo (FEI Visualisering Sciences Group, Burlington, MA). Regioner svarende til blodet (ventrikulære lumen og store fartøjer) og milt blev automatisk segmenteret ved anvendelse af 80 kVp datasæt, mens regioner svarende til leveren og nyrerne var semi-automatisk segmenteret ved anvendelse af samme datasæt. Hver segmenteret region omfattede hele organet, men udelukket store blodkar i orglet. Tumorer blev segmenteret semi-automatisk ved hjælp af guld kortet fra dual-energi nedbrydning. Rough regioner blev manuelt trukket uden grænser tumoren, og de regioner blev tærsklingsbehandles at vælge kun de voxel, der indeholdt en guld koncentration mellem 0,25 mg /ml og 3 mg /ml. Disse tærskelværdier blev valgt for at udelukke normal lungeparenkym, store blodkar, og knogler fra de segmenterede tumorer. I alt 27 lungetumorer i de 5 mus blev identificeret og segmenteret i hver af de 3 DE mikro-CT-scanninger.

Efter segmentering, blev guld og jod-koncentrationer målt i hver segmenteret område af interesse ved at beregne den gennemsnitlige værdien af ​​det guld og jod kort over hele området af interesse. Fordi begge nanopartikler er lang halveringstid kontrastmidler, de forbliver næsten udelukkende i vaskulaturen umiddelbart efter injektion. Den fraktionelle blodvolumen (FBV) i hvert organ kan derfor anslås ved at måle guld eller iod koncentration inden organet umiddelbart efter nanopartikel injektion. Vi beregnede FBV på dag 1 ved hjælp af de AuNPs og igen på dag 3 ved hjælp af Lip-I. FBV blev beregnet ved følgende ligninger: hvor C

Au, day1 er den gennemsnitlige koncentration guld i et væv umiddelbart efter guld injektion på dag 1, C

Au, blod, day1 er den gennemsnitlige koncentration guld i segmenterede blod på dag 1, C

i, Day3 er gennemsnitlige koncentration af iod i et væv umiddelbart efter Lip-i injektion, og C

i, blod, Day3 er den gennemsnitlige iodkoncentration målt i den segmenterede blod på dag 3. FBV blev beregnet for hver segmenteret tumor, milt, lever, nyre og ved begge tidspunkter. Denne beregnede FBV er et estimat af den vaskulære tæthed i vævet, og var korreleret med mikrovaskulære massefylde, der beregnes ved at analysere billeder af histologiske vævssnit, som beskrevet nedenfor.

Efter bestemmelse af FBV i hvert væv, koncentrationen af guld akkumuleret inden hvert væv blev beregnet. På grund af sin lange halveringstid i blodet, over halvdelen af ​​den injicerede kontrastmiddel forblev i blodet på dag 3. Derfor vævet guld-koncentrationen målt i CT guld kortet indeholder både guld, der ekstravaseret i vævet og guld, der forbliver intravaskulær i vævet. Den FBV beregnet ovenfor kan anvendes til at subtrahere det intravaskulære guld koncentrationen i henhold til følgende ligninger: hvor C

Au, accum den akkumulerede (ekstravaskulære) koncentration guld i et væv, C

Au, tot er den samlede guld koncentration i et væv beregnet ud fra CT guld kortet på dag 3, C

Au, iv er koncentrationen af ​​guld i et væv, der forbliver intravaskulær, og C

Au, blod er koncentrationen af ​​guld i bulk blod beregnet ud fra CT guld på kort dag 3. Disse ligninger blev anvendt til at beregne den akkumulerede guld i hver tumor og organ. For enkelt kontrastmiddel metode, den FBV fra CT scanning 1 og guld koncentrationer fra CT-scanning 2, blev anvendt i disse beregninger. For de to kontrastmiddel metode, fbv og guld koncentrationer var begge fra CT-scanning 3. validering blev disse akkumulerede guld koncentrationer sammenlignet med koncentrationer af guld i hvert organ målt ved ICP-OES.

Validation Studies

Tissue forarbejdning.

prøver af blod, lungetumorer, og andre organer (nyre, lever, milt) blev ekstraheret fra alle mus til analyse. Blod blev udtaget fra musene efter den første CT-scanning fra ansigtet vene. En terminal blodprøve og organhøst blev udført efter den tredje CT-scanning. Hver mus blev sat under dyb anæstesi ved en intraperitoneal injektion af pentobarbital. Anæstesi blev bekræftet ved tå knivspids. Den abdominale kavitet blev åbnet, og blod blev trukket langsomt fra vena cava inferior, mens hjertet stadig slår. 0,5-1,0 ml blod blev opsamlet fra hver mus, hvorefter nedre vena cava og aorta blev afbrudt, og det resterende blod blev tilladt at løbe ned i bughulen. Trachea blev derefter kanyleret med en 20-gauge nål, gennem hvilken en 01:01 blanding af cryoembedding medium (OCT) og 30% sucrose blev injiceret i lungerne for at fylde luftrum til senere vævssektionering. Efter inflation med indlejring medium, blev lungerne fjernet fra musen og enten umiddelbart dissekeret for lungetumorer eller indlejret i OCT og frosset på tøris. Lungetumorer ekstraheret fra dissekerede lunger blev gennemvædet i PBS i 5 minutter for at skylle væk overskydende blod og derefter nedfrosset ved -80 ° C i ICP-OES analyse. Efter lunge ekstraktion, blev lever, milt og nyrer i hver mus høstet og skåret i halve. Den første halvdel af hvert organ blev straks indlejret i OCT på tøris til sektionering. Den anden halvdel blev gennemblødt i PBS i 5 minutter og nedfrosset ved -80 ° C i ICP-OES analyse. Alle væv blev holdt nedfrosset ved -80 ° C indtil klar til videre behandling.

Histologi.

8 um frosne tumorsnit blev immunfarvet for endotelcelle markør CD31. Før farvning blev snit fikseret med 4% paraformaldehyd, skyllet med PBS, og blokeret med 10% FBS i PBS i en time. Snittene blev derefter inkuberet med det primære antistof (rotte-anti-muse CD31, BD Pharmingen) fortyndet 1:250 i blokerende buffer i 2 timer ved stuetemperatur. Objektglassene blev skyllet tre gange med PBS i 10 minutter for at fjerne ubundet primært antistof, hvorefter det sekundære antistof (Alexa Fluor488-konjugeret æsel-anti-rotte IgG, Invitrogen) fortyndet 1:500 i blokerende buffer blev tilsat og inkuberet i 1 time i mørket. Kerner blev modfarvet med DAPI. Et par 8 um snit blev også anvendt til hematoxylin og eosin (H & E) -farvning. For H & E-farvning, prøver blev farvet med hematoxylin, skyllet med vand og ethanol, farvet med eosin Y, derefter skyllet med ethanol og xylen og monteret til mikroskopi

Immunofarvede snit blev afbildet under anvendelse af et Zeiss Axiovert 135 inverteret.