PLoS ONE: KLC1-ALK: A Novel Fusion i lungekræft Identificeret Ved hjælp af en formalin-paraffinindlejret Tissue Only

Abstrakt

De lovende resultater af anaplastisk lymfom kinase (ALK) hæmmere har ændret betydningen af ALK fusioner i flere typer af kræft. Disse fusioner ikke længere blot forskningsmål eller diagnostiske markører, men de er nu direkte forbundet med den terapeutiske gavn for patienterne. Men de fleste tilgængelige tumorvæv i kliniske indstillinger er formalin-fikseret og paraffin-indstøbt (FFPE), og dette begrænser detaljerede genetiske undersøgelser betydeligt i mange kliniske tilfælde. Selv om de seneste tekniske forbedringer har tilladt analysen af ​​nogle kendte mutationer i FFPE væv, identificere ukendte fusionsgener ved kun FFPE væv fortsat vanskelig. Vi udviklede en 5′-hurtig opformering af cDNA ender-baseret system optimeret til FFPE væv og evalueret dette system på en lungekræft væv med

ALK

omordning og uden de 2 kendte ALK fusioner EML4-ALK og KIF5B-ALK . Med dette system, vi med succes identificeret en roman ALK fusion, KLC1-ALK. Resultatet blev bekræftet ved revers transkription-polymerasekædereaktion og fluorescens

in situ

hybridisering. Derefter syntetiserede vi den formodede fuldlængde-cDNA af

KLC1-ALK

og demonstrerede det transformerende potentiale af fusions-kinase med assays under anvendelse muse 3T3-celler. Så vidt vi ved, KLC1-ALK er den første roman onkogene fusion identificeres ved hjælp af kun FFPE væv. Dette fund vil udvide den potentielle værdi af arkivering FFPE væv og give yderligere biologiske og kliniske indsigt i ALK-positive lungekræft

Henvisning:. Togashi Y, Soda M, Sakata S, Sugawara E Hatano S, Asaka R et al. (2012) KLC1-ALK: A Novel Fusion i lungekræft Identificeret Ved hjælp af en formalin-paraffinindlejret Tissue Only. PLoS ONE 7 (2): e31323. doi: 10,1371 /journal.pone.0031323

Redaktør: Anthony W.I. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Oktober 17, 2011; Accepteret: 5 januar 2012; Publiceret: 8 februar 2012

Copyright: © 2012 Togashi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan samt af tilskud fra Japan Society for fremme af videnskab; Sundhedsministeriet, Labor, og dyrevelfærd Japan; Vehicle Racing Mindestue Foundation of Japan; Prinsesse Takamatsu Fund Cancer Research; og Uehara Mindefond. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

anaplastisk lymfom kinase (ALK) er en receptortyrosinkinase, der blev opdaget i anaplastisk storcellet-celle lymfom (ALCL) i form af et fusionsprotein, NPM-ALK [1], [2]. Dannelsen af ​​et fusionsprotein med en partner gennem kromosomale translokationer er den mest almindelige mekanisme af ALK overekspression og ALK kinasedomæne aktivering. Nylige lovende resultater af kliniske forsøg med en ALK-inhibitor, crizotinib, har ændret betydningen af ​​ALK fusioner i lungekræft [3], [4], [5], [6], inflammatoriske myofibroblastisk tumorer (IMTS) [7], og ALCL [8]. ALK fusioner ikke længere blot forskningsmål eller diagnostiske markører og er nu direkte forbundet med den terapeutiske gavn for patienterne.

I lungekræft, 3 fusionspartnere af ALK har været rapporteret-EML4, TFG, og KIF5B-selv tilstedeværelsen af ​​TFG-ALK i lungekræft er endnu ikke blevet bevist med histopatologisk beviser [9], [10], [11]. Ud over lungekræft har ALK endvidere vist sig at generere fusioner i ALCL (fusionerede til NPM, TPM3, TPM4, ATIC, TFG, CLTC, MSN, MYH9 eller ALO17) [1], [2], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], IMT (TPM3, TPM4, CLTC, CARS, RANBP2, ATIC eller SEC31A) [19], [ ,,,0],20], [21], [22], [23], [24], ALK-positive storcellet B-celle lymfom (CLTC, NPM, SEC31A eller SQSTM1) [25], [26], [27], [ ,,,0],28], og renal cancer (VCL, TPM3 eller EML4) (tabel 1) [29], [30]. Udover TFG-ALK i lungekræft, er blevet rapporteret nogle ALK fusioner uden histopatologisk beviser:. TPM4-ALK i esophageal planocellulært karcinom [31], [32] og EML4-ALK i Colon og bryst karcinomer [33]

Anti-ALK immunhistokemi spillede en vigtig rolle i at identificere disse ALK fusionspartnere. Adskillige ALK-fusioner udviser en karakteristisk farvning mønster i anti-ALK immunhistokemi fordi den subcellulære lokalisering af ALK-fusionsproteiner afhænger fusionspartneren. For eksempel NPM-ALK, som er den mest almindelige fusion i ALK-positive ALCL (85%), udviser en nuklear og cytoplasmatisk mønster farvning fordi heterodimeren af ​​NPM og NPM-ALK lokaliseres i kernen og homodimer af NPM-ALK i cytoplasmaet; CLTC-ALK udviser en cytoplasmisk granulært mønster, fordi det lokaliseres i de små vesikler. Hvis en tumor udviser en ukendt anti-ALK farvningsmønster, kan patienten have en hidtil ukendt fusionspartner. Ud over forskellen i subcellulære lokalisering, forskellen i farvningsintensitet er nøglen til identifikation af hidtil ukendte partnere. EML4-ALK er næppe farvet ved konventionelle anti-ALK immunhistokemi [11], [34]. For at overvinde denne begrænsning, vi udviklede den indskudte antistof-forstærket polymer (iAEP) metoden, som moderat øger følsomheden i immunhistokemisk påvisning systemet, og EML4-ALK konsekvent farves med denne metode [11]. Dette indikerede, at en tumor, der er positivt immunfarvet for ALK kun ved en følsom immunhistokemi metode, men ikke ved konventionelle metoder kan være bærere af en hidtil ukendt ALK-fusion. Baseret på denne hypotese, vi med succes identificeret PPFIBP1-ALK i 2 IMT sager, der var positive i anti-ALK immunhistokemi kun når farvet ved iAEP metoden [35].

Anti-ALK immunhistokemi kan således være nyttig til at detektere kandidat tumorer for en hidtil ukendt ALK-fusion. Men for at identificere fusionspartneren, andre molekylære teknikker er normalt kræves, såsom 5′-hurtig amplifikation af cDNA-ender (5′-RACE) eller invers revers-transkription-polymerase-kædereaktion (RT-PCR). Så vidt vi ved, er der ikke nye onkogene fusioner blevet opdaget ved hjælp af formalin-fikseret paraffinindlejrede (FFPE) væv kun fordi nukleinsyrer ekstraheret fra FFPE væv er alvorligt nedbrydes under fiksering processen. I den foreliggende undersøgelse, udviklede vi en 5′-RACE metode optimeret til

ALK

fusionspartner, afsløring, der var gældende for FFPE væv og identificeret en ny fusion, kinesin let kæde 1 (KLC1) Alk, i lungekræft ved hjælp af kun en FFPE væv.

Metoder

Materialer

en FFPE væv blok af pulmonal adenokarcinom in situ, nonmucinous (tidligere kaldet bronchioloalveolar karcinom) [36], som var udskåret fra en 47-årig kvindelig patient blev anvendt [37]. Denne carcinoma var negativ for EML4-ALK og KIF5B-ALK, selvom tilstedeværelsen af ​​

ALK

omlejring blev bekræftet ved anti-ALK iAEP immunhistokemi og en split fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse for ALK (herefter som den ukendte ALK fusion-positive tilfælde) (figur 1) [37]. To FFPE væv blokke af ALK-positive tumor sager blev også ansat, for hvilke forekomsten af ​​EML4-ALK eller KIF5B-ALK allerede var blevet bekræftet. Totalt RNA blev ekstraheret fra hver FFPE væv med anvendelsen af ​​RECOVERALL ™ samlede Nucleic Acid Isolation Kit til FFPE (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan). Alderen af ​​de 3 FFPE blokke anvendes (tid fra FFPE væv produktion til RNA ekstraktion) var 65, 40, og 51 måneder for den ukendte ALK fusion-positive tilfælde, EML4-ALK, og KIF5B-ALK hhv. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient. Undersøgelsen blev godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelsen for Shizuoka Cancer Center (godkendelse ID 22-J132-22-1) og den japanske Foundation for Cancer Research (godkendelse ID 2010-1011).

Panel A viser resultaterne af anti-ALK immunhistokemi med iAEP metoden på pulmonal adenocarcinoma in situ, nonmucinous. Farvningsmønstret var diffust cytoplasmisk. Det basale side af tumorceller blev stærkere farvet, hvilket indikerer en ujævn subcellulære lokalisering af KLC1-ALK-protein. FISH analyser afslørede, at denne sag var positiv i split analysen for

ALK Hotel (panel B: individuelle 5′- og 3′-signaler bliver observeret) og negativ i

EML4-ALK

KIF5B-ALK

fusion assays (Panel C:

EML4

, rød,

ALK

, grøn, Panel D:

KIF5B

, grøn,

ALK

, rød).

Modificeret 5′-RACE for ALKs fusioner, der gælder for FFPE væv

5′-RACE blev udført med smartere RACE cDNA Amplification Kit (Clontech ) ifølge producentens instruktion med mindre modifikationer. Kort fortalt, i stedet for primerne i sættet, ALK-3242R (5′-CTCAGCTTGTACTCAGGGC-3 ‘) blev anvendt til cDNA-syntese. CDNA’et blev underkastet 5′-RACE PCR under anvendelse primestar HS DNA Polymerase (Takara) og de følgende primere: Universal Primer A Mix af kittet og ALK-3206R (5’-ATGGCTTGCAGCTCCTGGTGCTT-3 ‘). PCR betingelse bestod af 5 cyklusser ved 94 ° C i 30 s og 72 ° C i 3 min; 5 cyklusser ved 94 ° C i 30 s, 70 ° C i 30 s og 72 ° C i 3 min; og 30 cyklusser ved 94 ° C i 30 s, 68 ° C i 30 s og 72 ° C i 3 min.

FISH

FISH-analyse af fusionsgener blev udført med DNA-prober til KLC1 ​​og ALK. Ufarvede snit (4 um tykke) blev underkastet hybridisering med en ALK-split probe sæt (Dako, Tokyo, Japan) eller med bakterielle kunstige kromosom (BAC) clone-afledte prober til ALK (RP11-984I21 og RP11-62B19) og KLC1 ​​(RP11-186F6). Hybridiseret slides blev derefter farvet med DAPI og undersøges med BX51 fluorescens mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).

Syntese af den formodede cDNA af

KLC1-ALK

To uafhængige PCR’er blev udført under anvendelse af cDNA syntetiseret ud fra en tumorvæv udtrykkende KIF5B-ALK med følgende primersæt: KLC1-Nhel-M (5′-GCGCTAGCGAATGTATGACAACATGTCCAC-3 ‘) og KLC1-BPR (5′-GTGCTTCCGGCGGTACACATCTACAGAACCAAACTC-3′), og ALK-BPF (5’-GGGAGTTTGGTTCTGTAGATGTGTACCGCCGGAAGC-3 ‘) og ALK-EcoRI (5′-GATAGAATTCTCAGGGCCCAGGCT-3’). Derefter blev den anden PCR udført under anvendelse af en 1/100 fortynding af en blanding af den første PCR produkter som en template med KLC1-Nhel-M og ALK-EcoRI-primere (figur 2).

To første- runde PCR’er blev udført separat anvendelse af cDNA syntetiseret ud fra en tumorvæv udtrykkende KIF5B-ALK med følgende primersæt: KLC1-Nhel-M og KLC1-BPR, og ALK-BPF og ALK-EcoRI. KLC1-BPR og ALK-BPF havde sekvenser nedstrøms for ALK break point (exon 20) og opstrøms for KLC1 break point (exon 9) som adoptant sekvenser henholdsvis. Derefter blev den anden PCR udført under anvendelse af en 1/100 fortynding af blandingen af ​​den første PCR-produkter som en template med primer KLC1-Nhel-M og ALK-EcoRI. De første PCR-produkter blev udglødet, udvidet med hinanden, og derefter forstærket med primerne.

Transformation assay for

KLC1-ALK

Analyse af den transformerende aktivitet af kinase-fusioner blev udført som tidligere beskrevet [9], [38], [39]. En pMXS-baserede ekspressionsplasmid for hver fusion blev anvendt til at generere rekombinante økotropiske retrovira [40], som derefter blev anvendt individuelt til at inficere muse-3T3-fibroblaster. Dannelsen af ​​transformerede foci blev evalueret efter dyrkning af cellerne i 4 dage. Det samme sæt af 3T3-celler blev injiceret subkutant i nu /nu mus, og tumordannelse blev undersøgt efter 14 dage. Forsøgene dyr blev godkendt af dyreetik udvalg Jichi Medical University (godkendelse ID 1135).

Resultater

Identifikation af

KLC1-ALK

som en ny

ALK

fusion gen

Vores modificerede 5′-RACE trofast isolerede cDNA fragmenter til

EML4-ALK

eller

KIF5B-ALK

fra kendte ALK positive tumorer (supplerende Figur S1A og B). Vi forsøgte derefter at isolere cDNA-fragmenter, der omfatter fusionspunkterne fra den ukendte ALK fusion-positive tilfælde. Nukleotidsekventering af sådanne 5′-RACE-produkter viste, at 2 ud af 10 kloner indeholdt 3′-terminalen af ​​exon 9 i

KLC1

(ENST00000348520) fusioneret til det første nukleotid i exon 20 i

ALK

(ENST00000389048), hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​en ny fusion mellem

KLC1

ALK

. Da denne omlejring udgjorde en fusion i ramme mellem de 2-gener, fuldlængde

KLC1-ALK

cDNA sandsynligvis producerer et protein af 984 aminosyrer indeholdende en aminoterminal to tredjedele af KLC1 og en intracellulær region ALK (figur 3A). RT-PCR-medieret isolering af en fusion punkt held bekræftede fusion i ramme mellem de 2 meddelelser (figur 3A og B). Endvidere at bekræfte den genomiske omlejring ansvarlig for fusion, blev en fusion FISH assay udført (figur 3C). Disse resultater var i overensstemmelse med tilstedeværelsen af ​​t (2; 14) (p23; q32.3), hvilket fører til dannelsen af ​​

KLC1-ALK

Panel A viser den skematiske struktur. KLC1, ALK, og KLC1-ALK proteiner og cDNA sekvensen omkring fusion punkt. Mørk blå, orange og rød dele repræsenterer coiled-coil, transmembrane og kinasedomæner hhv. Knækpunktet exoner og antallet af aminosyrer er vist. KLC1-ALK-specifikke RT-PCR under anvendelse af RNA ekstraheret fra FFPE væv af den ukendte ALK fusion-positive tilfælde amplificeret et fragment af det forventede produkt størrelse (140 bp, panel B) med den konsekvente fusion sekvens (panel A). En fusion FISH analyse til

KLC1-ALK

afslørede en fusion signal (gul) i flere tumorceller (Panel C). M, markør (100 bp stige); S, prøve (den ukendte ALK fusion-positive tilfælde); N, ingen skabelon kontrol.

Transforming potentiale

KLC1-ALK

formodede fuld længde cDNA af

KLC1-ALK

var syntetiseret fra det frosne væv med KIF5B-ALK-fusion-ekspression (figur 2, Supplerende fig S2), og blev anvendt til at generere en rekombinant retrovirus, der udtrykker fusionsproteinet med en amino-terminalt FLAG-epitopmærke. Infektion af 3T3-celler med virus, der udtrykker KLC1-ALK let fremstilles multiple transformerede foci i kultur og subkutane tumorer i en nøgen mus tumorgenicitet assay (figur 4), hvilket bekræfter den potente transformerende evne KLC1-ALK.

Øvre paneler : mus 3T3 fibroblaster blev inficeret med retrovirus koder KLC1-ALK eller EML4-ALK eller med den tilsvarende tomme virus (Mock). Cellerne blev fotograferet efter 4 dages dyrkning. Scale bar, 1 mm. Lavere paneler: Nøgne mus blev injiceret subkutant med de tilsvarende 3T3-celler, og tumordannelse blev undersøgt efter 14 dage. Antallet af tumorer dannet pr injektioner er angivet i bunden.

Diskussion

Her ved kun at analysere de FFPE væv, vi med succes opdaget en roman ALK fusion, KLC1-ALK. Mens lynfrosset materialer i stikprøven fra biopsi eller kirurgisk fjernede prøver kan anvendes til forskellige typer af molekylære analyser, er de ikke rutinemæssigt udtages prøver i de fleste kliniske indstillinger. I modsætning hertil er FFPE prøver normalt produceres, og histopatologi diagnostiske arkiver er en meget stor ressource af FFPE væv i almindelige diagnostiske patologi laboratorier. Men DNA og RNA ekstraheret fra FFPE væv er alvorligt forringet under formalin fiksering og er sædvanligvis ikke egnet til assays, der kræver lange DNA /RNA af høj kvalitet. Nylige tekniske fremskridt har tilladt nogle analyser for kendte punktmutationer og kendte fusionsgener, men det er stadig vanskeligt at identificere et ukendt gen aberration ved hjælp af kun en FFPE væv.

I de fleste

ALK

fusioner, knækpunktet af

ALK

ligger inden intron 19, og smeltepunktet i mRNA er typisk det første nukleotid i exon 20. Derfor, hvis primerne til 5′-RACE anbringes umiddelbart nedstrøms for det første nukleotid af

ALK

exon 20, såsom 5′-RACE kan med held isolere PCR-produkter, der indeholder partner gensekvens selv bruger FFPE væv. Baseret på denne hypotese, vi etableret en 5′-RACE system til

ALK

fusioner optimeret til FFPE væv. Med dette system, vi identificeret en roman

ALK

fusion,

KLC1-ALK

. Så vidt vi ved, er dette den første roman onkogene fusion identificeres ved hjælp af kun en FFPE væv.

Forsigtig, dog er der behov for. I sjældne tilfælde med

ALK

fusion, pausen punkt

ALK

fusion mRNA kan ikke være i 5′-enden af ​​exon 20. For eksempel i variant 4 af

EML4-ALK

, exon 14 i

EML4

fusioneres en ukendt sekvens af 11 bp, som igen er forbundet til nukleotid 50 i

ALK

exon 20 (E14; ins11; del49A20) [38]. Vores 5′-RACE-systemet ville ikke arbejde på et sådant tilfælde, fordi den omvendte primer ALK-3206R svarer til nukleotider 12-34 af

ALK

exon 20. Derfor, hvis vores modificeret 5′-RACE undlader at isolere fusion cDNA fra sager med et bekræftet ALK omlejring, kan andre primer indstillinger forsøges.

kinesin er en heterotetramer på 2 kinesin tunge kæder og 2 kinesin lette kæder, og det bevæger sig på mikrotubuli mod deres plus ender bærer forskellige ladninger . De tunge kæder havnen i motorisk aktivitet, mens de lette kæder spiller roller i lasten binding og modulering af aktiviteten og subcellulære lokalisering af de tunge kæder. KLC1 ​​binder til kinesin tunge kæder med et N-terminalt domæne og til forskellige ladninger via tetratricopeptide gentagne domæner [41], [42]. Af de tre histopatologisk bekræftede ALK fusionspartnere i lungekræft, EML4 colocalizes med mikrotubuli og kan bidrage til en stabilisering af mikrotubuli [43], KIF5B bevæger sig på mikrotubuli som kinesin tung kæde [44], og KLC1 bindes til kinesin tunge kæder som en kinesin let kæde. Derfor er det interessant, at alle 3 ALK fusioner i lungekræft vil sandsynligvis colocalize med mikrotubuli.

Den hyppigste ALK fusion i lungekræft er EML4-ALK (4-7%) [9], [ ,,,0],38], og den anden er KIF5B-ALK (0,5%) [11]. Et tilfælde med TFG-ALK er rapporteret [10]. KLC1-ALK kan være sjældne, men eksisterer i lunge adenocarcinom, og patienter med denne fusion er meget sandsynligt, at drage fordel af ALK-hæmmer, som gør patienter med andre ALK fusioner. Forekomsten kan være lav, men betydningen af ​​denne fusion er meget høj fra perspektivet af en skræddersyet behandlingsmulighed for patienten. Et andet vigtigt punkt er, at KLC1-ALK blev fundet i adenocarcinoma in situ, nonmucinous (tidligere kaldet bronchioloalveolar karcinom, BAC). BAC er anerkendt til sjældent havnen ALK fusioner, selv om et lille antal BAC sager er blevet undersøgt for ALK fusion i forhold til invasiv adenokarcinom. Det ville være interessant fra et patobiologiske perspektiv at undersøge en storstilet kohorte af BAC og andre præmaligne betingelser for ALK fusion

Der er 3 metoder til påvisning af ALK fusioner:. RT-PCR, ALK split FISH, og høj følsomhed anti-ALK immunhistokemi. For RT-PCR, skal 5’partner gen være kendt. Vores resultater i denne undersøgelse identificeret endnu en partner gen, bør målrettes i ALK-fusion påvisning ved RT-PCR i lungekræft. De andre 2 metoder kan registrere alle ALK-fusioner uanset fusionspartner, og derfor er egnede til ALK-fusion screening. Med andre ord, kan disse 2 metoder ikke identificere fusion partner og har brug for at blive afløst af partner-specifikke RT-PCR og /eller fusion FISH til dette formål. Hvis det er afsløret, at partneren genet i den testede tilfælde er ukendt, en hidtil ukendt partner gen er meget sandsynligt at blive opdaget, som blev vist i den foreliggende undersøgelse. Faktisk ved hjælp af høj-følsomhed anti-ALK immunhistokemi (iAEP metoden) som screening, har vi identificeret en række nye ALK fusioner i forskellige typer af kræft, herunder lunge adenocarcinom [11], lymfom [28], sarkom [35], og renal celle karcinom [30].

der er etableret mange effektive redskaber til påvisning af ALK fusion-positive tilfælde bruger FFPE væv, herunder anti-ALK immunhistokemi og FISH. Vores resultater vil yderligere udvide den potentielle værdi af arkivering FFPE væv og give yderligere biologiske og kliniske indsigt i ALK-positive kræftformer i den kommende tid med ALK-hæmmer.

Støtte Information

Figur S1.

5′-RACE-produkter ved hjælp af FFPE væv. Vores modificeret 5′-RACE trofast isoleret cDNA fragmenter for

EML4-ALK Hotel (A) eller

KIF5B-ALK Hotel (B) fra kendte ALK positive tumorer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0031323.s001

(TIF)

Figur S2.

Putativ cDNA sekvens af KLC1-ALK. Den formodede cDNA af

KLC1-ALK

fuld længde blev syntetiseret fra det frosne væv med KIF5B-ALK fusion udtryk

doi:. 10,1371 /journal.pone.0031323.s002

(PDF)

tak

Vi takker Mr. Motoyoshi Iwakoshi, Ms Keiko Shiozawa, Ms Tomoyo Kakita, og Ms. Kimie Nomura for deres tekniske bistand, og Ms. Sayuri Sengoku for at yde administrativ bistand.