PLoS ONE: Regulatory B-celle funktion undertrykkes af rygning og fedme i H. pylori-inficerede patienter og er korreleret med øget risiko for gastrisk Cancer

Abstrakt

Helicobacter pylori

infektion forekommer i mere end halvdelen af ​​verdens befolkning og er den vigtigste årsag til gastrisk cancer. En række livsstil og ernæringsmæssige faktorer, såsom tobaksrygning og fedme, har vist sig at hæve risikoen for udvikling af kræft. I denne undersøgelse, vi søgte at bestemme de immunologiske aspekter under

H

.

pylori

infektion og mavekræft udvikling. Vi fandt, at B-celler fra

H

.

pylori

inficerede patienter præsenterede ændret sammensætning og funktion i forhold til ikke-inficerede patienter. IL-10-udtrykkende CD24

+ CD38

+ B celler blev opreguleret i

H

.

pylori

inficerede patienter, indeholdt potent regulatorisk aktivitet i hæmme T-celle pro-inflammatorisk cytokin sekretion, og reagerede direkte til

H

.

pylori

antigen stimulation. Interessant nok i

H

.

pylori

inficerede ryger fag og overvægtige personer, antallet af IL-10

+ B celler og CD24

+ CD38

+ B-celler blev reduceret i forhold til

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske forsøgspersoner. Regulatoriske funktioner medieret af CD24

+ CD38

+ B-celler blev også svækket. Desuden havde gastrisk cancer positive patienter reducerede IL-10-producerende B-celle frekvenser efter

H

.

pylori

-stimulation. Tilsammen antyder disse data at i

H

.

pylori

-Infektion, CD24

+ CD38

+ B-celle opreguleres og spiller en rolle i at undertrykke pro-inflammatoriske reaktioner, eventuelt gennem IL-10 produktion, en funktion, der ikke blev observeret i rygning og overvægtige patienter

Henvisning:. Li G, Wulan H, Song Z, Paik PA, Tsao ML, Goodman GM, et al. (2015) om regulering B-celle funktion undertrykkes af rygning og fedme i

H

.

pylori

inficerede Fag og er korreleret med øget risiko for mavekræft. PLoS ONE 10 (7): e0134591. doi: 10,1371 /journal.pone.0134591

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN

Modtaget: Februar 3, 2015; Accepteret: 13 Juli 2015; Udgivet: 30 Juli 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Helicobacter pylori (H

.

pylori)

er en slags gramnegative patogene bakterier fundet i mere end halvdelen af ​​verdens befolkning og fortrinsvis hæmmer den øvre mavetarmkanal, herunder maven epitel og duodenum tarmkanalen [1,2]. Selv om langt størstedelen ( 80%) af infektioner er asymptomatiske, vil 10-20% smittede forsøgspersoner udvikle mavesår, mens 1-2% vil få mavekræft [3]. Den præcise mekanisme for udvikling af kræft som følge af

H

.

pylori

infektion er ikke veldefineret, men kronisk ubehandlet betændelse i den øvre mavetarmkanal antages at bidrage til fortsat beskadigelse af maven epitel [4,5]. Specifikt inflammationsassocieret signalmolekyler, såsom tumornekrosefaktor-alfa (TNF-a), har vist sig at fremme gastrisk tumorgenese og opreguleres i

H

.

pylori

infektion [6]. Andre pro-inflammatoriske cytokiner, der udskilles af T-celler, inklusiv IL-2, IL-17 og interferon gamma (IFN-g), er også opreguleret i

H

.

pylori

infektion og er forbundet med øget risiko for gastrisk tumorigenese [7-10]. En række andre faktorer, såsom vedvarende udsættelse for tobaksrygning og fedme, er positivt korreleret med øget gastrisk kræftrisiko, selvom den underliggende mekanisme er uklar [3,11].

For nylig rolle tolerance- inducerende B-celler er blevet karakteriseret i en række infektionssygdomme og autoimmune sygdomme [12]. Hos mus, CD1d

hiCD5 er fundet

+ B celler til at hjælpe med at etablere toleranceudviklende miljø i væv og har en rolle i forebyggelsen af ​​autoimmune induktion [13]. Hos mennesker, CD19

+ CD24

hiCD38

hi B-celler har lignende tolerance-fremkaldende rolle i raske samt HBV-inficerede individer [14]; indtræden af ​​autoimmun sygdom er korreleret med tab af regulatorisk funktion i denne B-celle delmængde [15]. IL-10 er et pleiotropisk immunregulerende cytokin der er i stand til at inhibere en række pro-inflammatoriske cytokiner, herunder IL-2, IL-17, IFN-g og TNF-a, og er vist at kraftigt undertrykke antigenpræsenterende kapacitet antigenpræsenterende celler [16]. Centralt for alle tolerancekrav-inducerende B-celle delmængder, IL-10-produktion er afgørende til B cellemedieret regulering til undertrykkelse T-cellemedieret inflammation [12,17]. Rolle B-celle-medieret regulering i

H

.

pylori

infektion og efterfølgende induktion af mavekræft, blev dog ikke tidligere undersøgt.

I denne undersøgelse analyserede vi profil B-celle sammensætning og cytokin udtryk i

H

.

pylori

inficerede fag. Øget procentdele af CD24

+ CD38

+ B-celler og reducerede procentdele af naive B-celler og hvilende memory B-celler blev fundet i

H

.

pylor

i-smittede forsøgspersoner. Den CD24

+ CD38

+ B-celler i

H

.

pylori-inficerede forsøgspersoner havde

øget procentdel af IL-10 produktion, og havde undertrykt pro-inflammatorisk cytokin udtryk, når co-dyrket med autologe T-celler.

H

.

pylori-s

timulated CD24

+ CD38

+ B-celler fra

H

.

pylori

smittede forsøgspersoner potent udskilles IL-10. Interessant,

H

.

pylori-inficerede rygning

fag og overvægtige subects havde sænket niveauer af CD24

+ CD38

+ B-celler. Derudover CD24

+ CD38

+ regulatoriske B-celler i rygning og fede personer viste sig at udvise tab af undertrykkende funktion, når samdyrket med autologe T-celler og stimulerede reducerede niveauer af IL-10 efter direkte

H

.

pylori

stimulation. Endvidere i rygning og fede patienter, som senere udviklede mavecancer, hyppighederne af IL-10-secernerende B-celler blev yderligere reduceret, sammenlignet med de emner, som ikke udviklede mavecancer. Tilsammen viste disse data, at CD24

+ CD38

+ B celler blev opreguleret i

H

.

pylori

inficerede og havde funktionelt undertrykt T-celle inflammatorisk cytokin produktion. Den CD24

+ CD38

+ B-celler i rygning fag og overvægtige personer, dog var refraktære over for

H

.

pylori

-stimulation, produceret mindre IL-10, og manglede undertrykkende kapacitet.

Materialer og metoder

Undersøgelse emner

Primære perifere blodprøver blev opnået fra 55

H

.

pylori

inficerede sår-fri patienter, heraf 15 primære forbrugere af tobaksrøg og 15 klasse I fede (30 kg /m

2 BMI 35 kg /m

2 ) fag, samt 15 raske

H

.

pylori

-uninfected ulcus-fri individer. Personer med kronisk udsættelse for passiv rygning, blev udelukket fra undersøgelsen. Ingen signifikante forskelle med hensyn alder, køn og tidligere infektion historie mellem studiegrupper blev fundet. Alle emner blev fulgt i 5 år for status kræft udvikling. Alle emner var ubeslægtede individer fra Henan provinsen og dens omgivende region. Patienterne blev rekrutteret mellem Jan 2008 og Dec 2013 fra Den 155. Central Hospital PLA i Kina. Controls var kræft-fri individer tilfældigt udvalgte fra et fællesskab kræft-screening program for tidlig påvisning af kræft udført i de samme områder i samme periode patienterne blev rekrutteret. Svarprocenten for både kontroller og sager var 95%. Kriterierne for raske kontrolpersoner udvælgelse inkluderet kræft-fri individer og frekvens matching til tilfælde efter køn og alder (± 5 år). Ved rekruttering blev skriftligt informeret samtykke opnået fra hver underlagt og personlige data såsom køn, alder, vægt, højde og tobaksrygning blev indsamlet via et spørgeskema. Ikke alle forsøgspersonernes prøver blev anvendt i alle forsøg på grund af ufuldstændig patient compliance og utilstrækkelige celler hos nogle patienter. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board af The 155. Central Hospital i PLA.

Prøveforberedelse

Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) blev isoleret fra perifere blodprøver med standard Ficoll-Hypaque procedure og straks nedfrosset ved -150 ° C indtil anvendelse eller anvendes til forsøg straks, hvis noteret. Regulært dyrkningsmedium er RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum, 5 ml 100 U penicillin /0,1 mg /ml streptomycin og 5 ml 2 mM L-glutamin. Celler blev dyrket i 5% CO

2 ved 37 ° C i den angivne periode.

Cell isolation

T og B-celler blev isoleret ved hjælp af human T-celle eller B-celle Negativ Selection Kit (StemCell, Vancouver, Canada), efter protokoller, som fabrikanten. De renheder på T- og B-celle isoleringer var større end 94% ved flowcytometri. For udtømning af CD24

+ CD38

+ B celler i nogle eksperimenter blev oprensede B-celler farvet med PE-anti-humant CD24 og APC anti-humant CD38 i 30 min. Cellerne blev derefter sendt til at leve cellesortering og CD24

+ CD38

+ celler blev depleteret. I B-celle-indstillingen helhed, blev de samlede B-celler sendt til at leve cellesortering uden antistofferne

Flowcytometri

Følgende anti-humane monoklonale antistoffer blev anvendt:. IL-10, TNF a (eBioscience, San Diego, CA, USA); CD3, CD4, CD19, CD20, CD21, CD24, CD27, CD38 (Biolegend, San Diego, CA, USA); IFN-g (BD Biosciences, San Jose, CA, USA); CD8 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Oprenset humant IgG (Biolegend, San Diego, CA, USA) blev anvendt til at blokere Fc-receptorer, når farvning populationer indeholdende B-celler. Til nogle eksperimenter, phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA, Sigma), ionomycin (Sigma, Munchen, Tyskland), eller varmedræbt

H

.

pylori

(Sigma, München, Tyskland) blev anvendt til at stimulere cellerne. GolgiStop og GolgiPlug sattes 6h før cellehøst til intracellulær farvning af IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a, og IL-10. FlowJo blev anvendt til flowcytometrianalyse.

Luminex-assay

IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a og IL-10 fra T-celler og B-celler blev kvantitativt målt ved multiplex Luminex assay efter protokoller, som producent med modifikationer (EMD Millipore, Etobicoke, Canada). I alt 2×10

5 T-celler og /eller B-celler blev udpladet i hver brønd af 96-brønds plade (Corning, Tewksbury, MA, USA). For B-celle stimulation, varme-dræbt

H

.

pylori

blev tilsat til B-cellerne, som blev udpladet i bunden af ​​en 96-brønds transwell plade (Corning, Tewksbury, MA). For T-celle stimulation, den nederste del af transwell pladen var præinkuberet med anti-human CD3 (klon OKT3) natten over og vasket, hvorefter renset T-celler blev overført til pladen. Humane cytokin indfangende antistof perler blev tilsat til det øvre kammer af 96-brønd Transwell plade. Tolv timer senere blev perlerne høstet, vasket og læses i overensstemmelse med producentens protokol.

Statistisk analyse

D’Agostino og Pearson omnibus normalitet test blev anvendt til at undersøge, om de data, der normalt blev uddelt. Envejs variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til sammenligninger mellem flere grupper efterfulgt af Dunns test. Students t-test blev anvendt til sammenligninger mellem to grupper. Hvis datasæt væsentligt afveg fra normalfordeling blev parametriske tests anvendt. Alle statistiske analyser blev udført under anvendelse af Prism (GraphPad Software). P 0,05 blev betragtet som signifikant. Resultaterne blev vist som gennemsnit ± standardfejl.

Resultater

H

.

pylori

inficerede forsøgspersoner havde ændret cirkulerende B-celle sammensætning

For at analysere de potentielle ændringer i rollen som B-celle responser i

H

.

pylori

infektion, og hvordan det kan være påvirket af rygning og fedme, 15 raske

H

.

pylori

-uninfected (

H

.

pylori

-uninfected) frivillige, 20

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske røgfri ikke-overvægtige (asymptomatisk) fag, 15

H

.

pylori

inficerede rygning ikke-overvægtige (rygning) emner, og 15

H

.

pylori

inficerede røgfri overvægtige (fede) forsøgspersoner blev rekrutteret til denne undersøgelse. De demografiske og kliniske data blev opsummeret i tabel 1.

Cirkulerende B-celler i det perifere blod hos raske forsøgspersoner er sammensat af primært IgD

+ CD27

– naive B-celler og CD21

+ CD27

+ hvilende B-hukommelsesceller, mens i kroniske infektioner, er der ofte et fald i naive B-celler og hvilende B-hukommelsesceller, og en stigning i CD21

lo aktiverede B-celler og CD24

+ CD38

+ B-celler [15,18]. Vi undersøgte først sammensætningen af ​​cirkulerende B-celler i

H

.

pylori

inficerede fag. Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) blev farvet for overflademarkør ekspression direkte

ex vivo

(Fig 1A). Vi fandt, at sammenligne med

H

.

pylori

-uninfected raske forsøgspersoner, alle

H

.

pylori

inficerede grupper indeholdt lavere procentdele af IgD

+ CD27

– naive B-celler (P 0,001 for alle, Fig 1B og 1C). De procentdele af CD21

+ CD27

+ hvilende B-celler hukommelse blev reduceret i

H

.

pylori

inficerede ryger fag og overvægtige sammenlignet med raske forsøgspersoner (P 0,001 for begge), og procentdelen af ​​CD21

+ CD27

+ B-celler i overvægtige personer blev reduceret i forhold til

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske forsøgspersoner (P 0,01). Interessant, de procentdele af CD24

+ CD38

+ B celler blev varieret mellem forskellige grupper af

H

.

pylori

inficerede fag.

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske forsøgspersoner indeholdt meget højere procentdele af CD24

+ CD38

+ B celler end raske kontroller (P 0,001). Procentdelen af ​​CD24

+ CD38

+ B celler blev reduceret i rygere sammenlignet med i asymptomatiske forsøgspersoner (P 0,05), men stadig højere end hos raske forsøgspersoner (P 0,001). Hos overvægtige forsøgspersoner, procentdelen af ​​CD24

+ CD38

+ B celler ikke var signifikant forskellig fra den hos raske forsøgspersoner, men blev reduceret fra at i asymptomatiske forsøgspersoner (P 0,001).

(A ) gating strategi for B-celler i PBMC. Alle efterfølgende populationer viste blev gated overensstemmelse hermed på CD3

-CD19

+ levende singlet lymfocytter. (B) Repræsentative dot plots skildrer IgD vs. CD27, CD27 vs. CD21, og CD38 vs. CD24 ekspression på B-celler i raske

H

.

pylori

-uninfected fag (

H

.

pylori

-uninfected, N = 20),

H

.

pylori

inficerede røgfri ikke-overvægtige asymptomatisk (Asymptomatisk, N = 15),

H

.

pylori

inficerede rygning ikke-obsese (rygning, N = 15), og

H

.

pylori

inficerede overvægtige ikke-ryger (fede, N = 15) emner. (C) Procentdelen af ​​IgD

+ CD27

– naive B-celler, CD21

+ CD27

+ klassisk hukommelses B celler, og CD24

+ CD38

+ regulatoriske B celler i undersøgelsen grupper. *: P 0,05. **: P 0,01. ***: P 0,001. (Kruskal-Wallis envejs ANOVA og Dunns test). For flowcytometri analyse blev større end 10

6 arrangementer i lymfocyt gate indsamlet.

H

.

pylori

inficerede forsøgspersoner havde ændret B-celle cytokin udtryk profil

Tidligere blev B-celler sig at forstærke eller undertrykke immunreaktioner gennem produktion af en række cytokiner med forskellige funktioner, herunder for- inflammatoriske cytokiner såsom IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IFN-g og TNF-a, samt IL-10 og transformerende vækstfaktor beta (TGF-b) som regulatoriske cytokiner [19] . Her undersøgte vi cytokin udtryk for B-celler i forsøgspersoner. Vi fandt, at

ex vivo

ekspression af IL-2 blev IFN-g og TNF-a ved B-celler forøget i

H

.

pylori

-inficerede ryger fag og overvægtige end hos raske forsøgspersoner (Fig 2A). Ingen signifikante forskelle blev fundet i TGF-b ekspression.

(A) I pct B-celler der udtrykker IL-2, IFN-g, TNF-a, og TGF-b i

H

.

pylori

inficerede (N = 7),

H

.

pylori

smittet asymptomatisk (N = 8),

H

.

pylori

inficerede rygning (N = 6), og

H

.

pylori

inficerede overvægtige (N = 6) emner under ustimuleret (uden PMA /ionomycin) tilstand. (B) Repræsentative dot plots af B-celle intracellulær cytokin farvning uden eller med PMA /ionomycin stimulation, fra en ikke-inficerede emne. De cytokin udtryk for den samlede B-celler minus CD24

+ CD38

+ B-celler (ikke-CD24

+ CD38

+ B-celler), og at af CD24

+ CD38

+ B celler blev vist separat. (C) Procentdelen af ​​IL-10-udtrykkende, ikke-CD24

+ CD38

+ B-celler og CD24

+ CD38

+ B-celler i alle studiegrupper, under både ustimulerede og PMA /ionomycin stimulerede betingelser. (D) Antal IL-10

+ B-celler i studiegrupper, beregnet af den procentdel af IL-10-udtrykkende celler i CD24

+ CD38

+ B-celler ganget med den procentdel af CD24

+ CD38

+ i alt B-celler (som vist i figur 1C). *: P 0,05. **: P 0,01. ***: P 0,001. (Kruskal-Wallis envejs ANOVA og Dunns test). For dot plots blev 5000 begivenheder i hver port vist.

CD24

+ CD38

+ B-celler har regulatoriske funktioner i andre undersøgelser og havde interessante ekspressionsniveauerne i forskellige

H

.

pylori

inficerede grupper (Fig 1C). Vi undersøgte den intracellulære cytokin udtryk af CD24

+ CD38

+ B-celler. Som vist i fig 2B, cytokin ekspression af CD24

+ CD38

+ B celler var forskellige fra ikke-CD24

+ CD38

+ B-celler (total B-celler minus CD24

+ CD38

+ B-celler) ved, at de ikke producere høje niveauer af IFN-g og TNF-a, når de stimuleres med PMA /ionomycin, men udtrykte meget høje niveauer af IL-10, både under ikke-stimulerede og stimulerede betingelser. Vi sammenlignede produktionen af ​​IL-10 fra forskellige B-celle delmængder og fundet, at CD24

+ CD38

+ B-celler i alle studiegrupper secerneres meget højere IL-10 end ikke-CD24

+ CD38

+ B-celler, både under stimulerede forhold samt PMA /ionomycin stimulerede forhold (fig 2C). Vi betragter således den CD24

+ CD38

+ fraktion som den vigtigste IL-10-producerende B-celle delmængde. Inden for

H

.

pylori

inficerede gruppe, asymptomatiske forsøgspersoner havde højere procentdel af IL-10-udtrykkende celler i CD24

+ CD38

+ B-celler end raske forsøgspersoner, mens

H

.

pylori

inficerede overvægtige patienter havde lavere IL-10-udtrykkende celler i CD24

+ CD38

+ B celler end asymptomatiske patienter (Fig 2C). Vi multipliceret derefter frekvensen af ​​IL-10

+ -celler i CD24

+ CD38

+ B-celler med procentdelen af ​​CD24

+ CD38

+ -celler i den samlede B-celler til opnåelse af den “nummer” af IL-10-udtrykkende celler i B-celler, og konstateret, at både

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske forsøgspersoner og rygning fag havde højere niveauer af IL-10

+ B-celler end raske forsøgspersoner (P 0,001 og P 0,01, henholdsvis). Inden for

H

.

pylori

inficerede gruppe, rygning og fedme markant sænket frekvenserne af IL-10

+ B-celler (P 0,001 for begge). fra asymptomatiske forsøgspersoner

Alle sammen, disse data viste, at lovgivningsmæssige cytokin IL-10 primært er produceret af CD24

+ CD38

+ B-celler og forøges i

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske forsøgspersoner. Rygning og fedme reducerede IL-10-ekspression i CD24

+ CD38

+ B celler.

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske forsøgspersoner havde mere tolerogenisk aktivitet medieret af CD24

+ CD38

+ B-celler end rygning og overvægtige

Regulatory B-celler var kendt for at hæmme T-celle responser i kroniske infektioner, såsom hepatitis B-infektion og human immundefekt virus-infektion [14,20], ved at etablere tolerogenisk miljø gennem IL-10 forud for induktion af inflammation [15,21]. Vi undersøgte, om IL-10-producerende CD24

+ CD38

+ B celler havde lignende regulerende virkninger i

H

.

pylori

-Infektion. CD4

+ T-celler co-dyrket med autologe CD24

+ CD38

+ – fjerner B-celler havde signifikant forhøjede produktionen af ​​IL-2, IL-17, IFN-g og TNF-a, end CD4

+ T-celler dyrket sammen med hele B-celler, i

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske patienter (Fig 3A). Hos rygere og overvægtige forsøgspersoner blev sådan virkning ikke observeret. Tilsvarende CD8

+ T-celler fra

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske forsøgspersoner co-dyrket med autologe CD24

+ CD38

+ – udtømte B-celler væsentligt forbedret IFN-g og TNF-a sekretion end co-dyrket med hele B-celler ( fig 3B). Igen blev sådan virkning ikke observeret i rygning fag og overvægtige patienter. Undertrykkelsen af ​​T-celle cytokin-ekspression synes at være medieret af CD24

+ CD38

+ B-celler, idet der blev observeret laveste cytokinproduktion i CD4

+ og CD8

+ T-celler co-dyrket med CD24

+ CD38

+ B-celler alene. Tilsammen viste disse data, at CD24

+ CD38

+ B-celler i

H

.

pylori

inficerede emner undertrykt CD4

+ og CD8

+ T-celle pro-inflammatorisk cytokin produktion i

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske forsøgspersoner. Rygning og fedme hæmmede reguleringsindgreb af CD24

+ CD38

+ B celler.

Pure B-celler og T-celler blev isoleret fra hele PBMC’er gennem magnetisk negativ selektion. Oprensede B-celler blev farvet med anti-humant CD24 og anti-humane CD38-antistoffer og sendes til levende cellesortering. Hele B-celler, CD24

+ CD38

+ – fjerner B-celler eller oprenset CD24

+ CD38

+ B-celler blev derefter co-dyrket med autologe T-celler in vitro ved 1-til- 1 forhold i 72 timer, hvorefter T-celler blev yderligere separeret gennem magnetisk selektion i CD4

+ og CD8

+ brøker og dyrket i nærvær af plade-bundet anti-CD3-antistof og cytokin capture perler i 6 dage. N = 8 for hver gruppe. De cytokin produktioner fra (A) CD4

+ T-celler og (B) CD8

+ T-celler blev derefter målt ved følsom luminex assay. *: P 0,05. **: P 0,01. ***: P 0,001. (Kruskal-Wallis envejs ANOVA og Dunns test).

IL-10-sekretion af CD24 + CD38 + B-celler efter

H

.

pylori

stimulering i forskellige fag

Vi næste søgte at undersøge mekanismen af ​​IL-10 opregulering i B-celler i

H

.

pylori

inficerede fag. IL-10 produktion er afgørende for regulatorisk B-celle funktion [12,13]. Toll-like receptor signalering er en større IL-10-opregulering mekanisme i B-celler, og blev vist at modulere cytokin-ekspression i

H

.

pylori

infektion [22,23]. Vi testede, om tilstedeværelsen af ​​

H

.

pylori

kan direkte opregulere IL-10-sekretion i CD24

+ CD38

+ B-celler. Oprensede B-celler fra PBMC’er blev dyrket i fravær eller nærvær af varmedræbt

H

.

pylori

bakterie. Efter 72 timer inkubation blev sekretion af IL-10 i supernatanten målt ved Luminex. B-celler blev også høstet til intracellulær IL-10-farvning. Som vist i fig 4A, er IL-10-sekretion i supernatanten steg i både

H

.

pylori

-uninfected raske forsøgspersoner og

H

.

pylori

inficerede røgfri ikke-overvægtige asymptomatiske forsøgspersoner efter

H

.

pylori

-stimulation (P 0,01 og P 0,05, henholdsvis). Fig 4B viser, at procentdelen af ​​IL-10-secernerende B-celler blev opreguleret i CD24

+ CD38

+ B-celler efter

H

.

pylori

stimulation hos raske og asymptomatiske forsøgspersoner (P 0,001 og P 0,05, henholdsvis). I modsætning hertil er koncentrationen af ​​IL-10 i supernatanten og procentdelen af ​​IL-10-producerende CD24

+ CD38

+ B celler fra

H

.

pylori

inficerede ryger fag og overvægtige forsøgspersoner blev ikke væsentligt forøget efter

H

.

pylori

-Infektion. Disse data viste, at rygning og fedme havde svækket induktion af IL-10 fra B-celler efter

H

.

pylori

stimulering, og foreslog, at delvis tab af regulerende funktion CD24

+ CD38

+ B-celler fra rygere og overvægtige forsøgspersoner var muligvis på grund af en manglende evne til at opregulere IL-10 sekretion som respons på bakterielle antigen stimulation (se diskussionen).

Total B-celler blev isoleret fra PBMC’er ved negativ selektion og derefter dyrket i fravær eller nærvær af varmedræbt

H

.

pylori

bakterie, sammen med IL-10 capture perler. Efter 72 timer inkubation blev sekretion af IL-10 i supernatanten opsamlet ved capture perler og målt ved Luminex-assay. B-celler blev også høstet til intracellulær IL-10-farvning. N = 8 for hver gruppe. (A) secerneret koncentration IL-10 i supernatanten. (B) Procentdel af IL-10

+ -celler i CD24

+ CD38

+ B-celler i slutningen af ​​72 h inkubation. *: P 0,05. **: P 0,01. ***: P 0,001. (Students

t

test).

mavekræft-positive patienter i

H

.

pylori

-inficerede rygning og

H

.

pylori

inficerede fede grupper havde lavere frekvenser af IL-10

+ B-celler

Rygning og fedme var kendt for at øge risikoen for gastrisk udvikling af kræft i

H

.

pylori

inficerede fag. Da rygning og fedme også undertrykt normale regulatoriske B cellefunktioner, vi undersøgte, om disse to fænomener var forbundet. Vi fandt, at i rygere og overvægtige personer, dem, der blev positiv for mavekræft status havde betydeligt lavere frekvenser af IL-10

+ celler i CD24

+ CD38

+ B-celler efter

H

.

pylori

stimulation end dem, der forblev negative for gastrisk udvikling af kræft (Fig 5A P. 0,05 for begge). På den anden side, fandt vi ikke, at kræft positive og kræft negative patienter var signifikant forskellige med hensyn til deres frekvenser af CD24

+ CD38

+ B-celler i alt B-celler (Fig 5B). Nej

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske patienter i denne undersøgelse blev mavekræft positiv.

Patienternes mavekræft status blev sporet i 5 år efter den første samling prøve. (A) Hyppigheden af ​​IL-10

+ celler i CD24

+ CD38

+ B celler efter direkte

H

.

pylori

stimulation i

H

.

pylori

inficerede ryger fag og overvægtige forsøgspersoner (B) De procentdele af CD24

+ CD38

+ B-celler i alt B-celler i

H

.

pylori

-inficerede ryger fag og overvægtige patienter. N = 8 for hver gruppe. *: P 0,05. (Students

t

test).

Diskussion

H

.

pylori

infektion er den væsentligste årsag til udviklingen af ​​mavekræft. Selv om de fleste af infektioner var asymptomatiske og behandles, en undergruppe af forsøgspersoner mislykkes behandling og fremskridt til mavekræft. Desuden rygning og fedme øger risikoen for udvikling af kræft, mens de mekanismer er ikke helt klare. I denne undersøgelse, vi først observeret en ændring i cirkulerende B-celle komposition i

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske forsøgspersoner sammenlignet med ikke-inficerede raske forsøgspersoner med en reduktion af IgD

+ CD27

– naive B-celler og en opregulering af CD24

+ CD38

+ B-celler . CD24

+ CD38

+ B celler blev også fundet at være den vigtigste IL-10-secernerende B-celle delmængde. Vi derefter udført T-celle-B-celle cokultur eksperimenter og fundet, at T-celler i CD24

+ CD38

+ B-celle-depleteret co-kulturer secernerede højere niveauer af proinflammatoriske cytokiner end T-celler co-dyrket med hele B-celler, mens T-celler dyrket sammen med CD24

+ CD38

+ B-celler kun havde den laveste pro-inflammatorisk cytokin produktion. Desuden opdagede vi, at tilstedeværelsen af ​​

H

.

pylori

kunne direkte øge IL-10-udtryk fra CD24

+ CD38

+ B-celler. Sammen disse data viste, at

H

.

pylori

inficerede forsøgspersoner havde opreguleret frekvenser af cirkulerende CD24

+ CD38

+ B celler, som udtrykte høje niveauer af IL-10 og udstillet regulerende funktion. Interessant nok i

H

.

pylori

inficerede ryger fag og overvægtige personer, det cirkulerende CD24

+ CD38

+ B celler blev reduceret i hyppighed i forhold til

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske forsøgspersoner, var ude af stand til at undertrykke T-celle pro-inflammatorisk cytokin produktion i co-kultur eksperimenter, og ikke signifikant opregulere IL-10-ekspression efter

H

.

pylori

stimulation. Desuden har vi fulgt de emner i fem år, og efterfølgende konstateres, at i forhold til mavecancerpatienter-positive, mavekræft-negative patienter havde mere IL-10 produktion efter

H

.

pylori

stimulation. Kroniske celle ødelæggelse og væv læsioner i vedvarende

H

.

pylori

infektion var store medvirkende faktorer til gastrisk udvikling af kræft [24]. Fra resultaterne i dette papir, er det muligt, at øget IL-10-ekspression af B-celler kan beskytte

H

.

pylori

inficerede emner ved at reducere T-celle-medieret inflammation og begrænse væv læsioner, men i rygere og overvægtige personer, B cellemedieret beskyttelse væv ikke var til stede. Der er behov for flere undersøgelser i fremtiden at undersøge, om tilstedeværelsen af ​​IL-10

+ B-celler er korreleret med reducerede væv læsioner i

H

.

pylori

infektion. Dette var imidlertid ikke muligt i denne undersøgelse, da det kræver gastriske vævsprøver.

Det er blevet rapporteret, at tobaksrygning er forbundet med øget oxidativt stress og proinflammatorisk cytokinfrigørelse, muligvis på grund af rygning-induceret væv beskadigelse [25,26]. Fedme er også forbundet med forøget lav kvalitet, kronisk inflammation [27]. I denne undersøgelse fandt vi, at

H

.

pylori

inficerede ryger fag og overvægtige forsøgspersoner havde mindre IL-10

+ B-celler end

H

.

pylori

inficerede asymptomatiske forsøgspersoner. Efterfølgende modsætning hos asymptomatiske forsøgspersoner, tilstedeværelse af CD24

+ CD38

+ B celler fra rygende personer og overvægtige patienter i T-celle-B-celle co-kultur reducerede ikke T-celle pro-inflammatoriske cytokin produktion. Reduktionen i IL-10 produktion og manglen på regulerende funktion i B-celler kan skyldes den samlede øget inflammatorisk tilstand i rygning og fedme. Faktisk viste vores data, at B-celler fra

H

.

pylori

-inficerede rygning og fede fag, men ikke dem fra asymptomatiske forsøgspersoner, havde højere IL-2, IFN-g, og TNF-en produktion end B-celler fra inficerede raske forsøgspersoner, hvilket tyder på en skævvridning i retning af en mere proinflammatoriske fænotype. Samtidig bliver udsat for kronisk rygning og fedme kendt for at associere med øget gastrisk risiko kræft.