PLoS ONE: Expression af Beclin Family Proteiner er forbundet med Tumor Progression i Oral Cancer

Abstrakt

Baggrund

Beclin 1 og Beclin 2 er autofagi-relaterede proteiner, der viser lignende aminosyresekvenser og områdestrukturer. Beclin 1 etablerede den første forbindelse mellem autophagy og kræft. Imidlertid rolle Beclin 2 i cancer er uklar. Formålet med denne undersøgelse var at analysere Beclin 1 og Beclin 2 udtryk i orale cancer væv og cellelinjer, og vurdere deres mulige roller i kræft progression.

Metoder

Vi undersøgte Beclin 1 og Beclin 2 udtryk ved immunhistokemi i 195 tilfælde af oral cancer. De prognostiske roller Beclin 1 og Beclin 2 blev analyseret statistisk.

In vitro

, overekspression og knockdown af Beclin proteiner blev udført på en oral cancer cellelinje, SAS. Immunofluorescens og autophagy flux analyser bekræftede, at Beclin proteiner involveret i autophagy. Virkningerne af Beclin 1 og Beclin 2 på autofagi og tumorvækst blev vurderet ved konvertering af LC3-I til LC3-II og ved klonogene assays henholdsvis.

Resultater

Oral cancer væv udstillet afvigende udtryk for Beclin 1 og Beclin 2. cytoplasmatiske Beclin 1 og Beclin 2 udtryk var relateret i orale kræft væv. I overlevelse analyser, blev høj cytoplasmatisk Beclin 1-ekspression forbundet med lav sygdomsspecifikke overlevelse, og negativ nukleare Beclin 1-ekspression blev forbundet med høj tilbagevendende overlevelse. Patienter med enten høj eller lav cytoplasmatisk Beclin 2 udtryk havde signifikant lavere samlede overlevelse og sygdomsspecifikke overlevelsesrater end dem med moderat udtryk. I orale kræftceller, overekspression af enten Beclin en eller Beclin 2 førte til autophagy aktivering og øget klonogene overlevelse; knockdown af Beclin 2 forringet autofagi og øget klonogene overlevelse.

Konklusioner

Vores resultater viste, at forskellige mønstre af Beclin 1 og Beclin 2 blev forbundet med aggressive kliniske resultater. Beclin en overekspression, samt Beclin 2 overekspression og udtynding, bidrog til tumorvækst. Disse resultater tyder Beclin proteiner er forbundet med tumorigenese

Henvisning:. Liu J-L, Chen F-F, Chang S-F, Chen C-N, Lung J, Lo C-H, et al. (2015) Ekspression af Beclin Family Proteiner er forbundet med Tumor Progression i Oral Cancer. PLoS ONE 10 (10): e0141308. doi: 10,1371 /journal.pone.0141308

Redaktør: Spencer B. Gibson, University of Manitoba, Canada

Modtaget: Juni 24, 2014, Accepteret: 7 okt 2015; Udgivet: 27 oktober 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Taiwan (mEST 103-2320-B-182A-018, NMRPG6D0071) (mEST 104-2320-B -182A-012-, NMRPG6E0041), Chang Gung Memorial Hospital Chiayi Branch (CMRPG6E0071), og Chang Gung Medical Research center (CMRPD6C0013). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Oral cancer er en af ​​de mest almindelige kræftformer og et voksende problem i hele verden. Høje incidensrater forekommer i Syd- og Sydøstasien, dele af Europa, dele af Latinamerika og Stillehavsområdet [1]. For nylig, er forekomsten af ​​oral cancer forøges, især i økonomisk udviklede lande [2]. Langt størstedelen af ​​oral cancer er pladecellecarcinom, der skyldes de skællede mucosa af oral overflade. Trods den tilsvarende histologisk udseende, den molekylære basis for oral cancer er meget kompleks, som udviser multiple genetiske og epigenetiske mutationer [3, 4]. Identificering af nye biomarkører for kræft i mundhulen kan anvendes til at udvikle nye terapeutiske indgreb.

Autophagy er en evolutionært bevaret kataboliske proces, der involverer nedbrydningen af ​​unødvendige intracellulære metabolitter og beskadigede organeller ved lysosomale enzymer. Processen involverer dannelsen af ​​autophagosomes, der opsluger de uønskede cytoplasmatiske indhold og derefter levere dem til lysosomer. Den primære funktion af autofagi er at opretholde cellulær homeostase, især i næringsstof-berøvet betingelser. Blandt de autophagy gener,

beclin 1

etablerede den første forbindelse mellem autofagi og kræft [5], og betragtes som en haploinsufficient tumorsuppressorgen [6, 7]. Beclin 1 deltager i autophagosome kimdannelse ved tidlige trin af autofagi. Desuden Beclin 1 interagerer med mange positive og negative regulatorer, der påvirker autophagic aktivitet og tumorigenese [8-12]. Det fungerer som en afgørende mediator i autophagy regulering.

Beclin 2

, engang kaldte

BECN1P1

, blev oprindeligt betragtet som et pseudogen. I 2013 He et al udsat, at genet koder for et protein, der viser høje ligheder med Beclin 1 i aminosyresekvens og domæne strukturer, og de kaldte det hidtil ukendte protein Beclin 2 [13]. Denne nye identificerede protein viste sig at være fungerede i autophagy, endolysosomal nedbrydning og metabolisme. Det interagerer også med flere bindende partnere Beclin 1, herunder ATG14, AMBRA1, VPS34, og Bcl-2. Disse data foreslog sin rolle i reguleringen af ​​autofagi [13].

Foreningen af ​​Beclin 2 og kræft er ikke blevet behandlet, og forholdet mellem Beclin 2 og Beclin 1-ekspression og resultaterne af kræftpatienter er aldrig blevet undersøgt . I denne undersøgelse, vi undersøgte udtryk for Beclin 1 og Beclin 2 i orale kræft væv, og undersøgte foreninger blandt udtryk for Beclin 1 og Beclin 2, clinicopathologic funktioner og overlevelse. Vi inspicerede også virkningerne af ændring af Beclin proteiner på autofagi og kræft celleproliferation.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

Denne retrospektiv undersøgelse blev godkendt af Institutional review Board of St. Martin De Porres Hospital (Chiayi City, Taiwan) og Chang Gung Memorial Hospital Chiayi Branch (Chiayi County, Taiwan). Patientinformation blev anonymiseret og de-identificeret før analyse. Formalin-fikseret, paraffinindlejrede vævsprøver fra orale kræftpatienter, der får kirurgisk resektion blev opnået fra arkiverne af St. Martin De Porres Hospital i perioden fra januar 2003 til december 2008. Alle sager blev først diagnosticeret, histologisk bekræftet pladecellekræft. Patienter, der fik præoperativ neoadjuverende terapi eller haft en tumor størrelse på mindre end 5 mm blev udelukket fra denne undersøgelse. Klinisk oplysninger, herunder patientens alder, køn, tumorstørrelse, lymfeknude status, metastaser, og opfølgende data blev indhentet fra medicinske journaler. Tumoren-node-metastaser (TNM) fase blev defineret i henhold til den syvende udgave af amerikanske Blandede kræft iscenesættelse systemet [14]. Samlet overlevelse (OS) blev defineret som tiden mellem kirurgi og død alle årsager. Sygdomsspecifikke overlevelse (DSS) blev defineret som tiden mellem kirurgi og død forårsaget af oral cancer. Gentagelse overlevelse (RFS) blev defineret som tiden mellem kirurgi og den første lokal eller systemisk recidiv.

I alt 198 tilfælde af oral cancer blev indledningsvis inkluderet. Tre sager, der begrænset eller ingen væv i afsnittene om væv mikroarrays blev udelukket. Undersøgelsen endelig bestod af 195 tilfælde for immunhistokemiske pletter og statistisk analyse.

Patologisk undersøgelse

hæmatoxylin og eosin-farvede slides af hvert tilfælde blev revurderet af en patolog at bekræfte histologiske type , klasse, status af nekrose og lymphovascular invasion. Den histologiske klasse blev klassificeret som grad 1 (godt differentieret), grad 2 (moderat differentieret), og grad 3 (dårligt differentieret). Tilfælde med nekrotiske områder, der udgør mere end 10% af de tumor områder blev betragtet som “omfattende nekrose”, og de andre sager blev registreret som “begrænset eller ingen nekrose.” Lymphovascular invasion blev defineret som tilstedeværelsen af ​​kræftceller inden lymphovascular kanaler.

Tissue microarray konstruktion

Tissue microarray konstruktion blev udført som tidligere beskrevet [15]. Kort sagt, en patolog analyserede hæmatoxylin og eosin-farvede slides, og derefter markerede de repræsentative områder, der skal udtages prøver på dias og de tilsvarende væv blokke. Prøven kerne markering fra væv blokke omfattede to 1,5-mm-diameter kerner for hvert tilfælde af kræft væv, og et 1,5 mm diameter kerne for hvert enkelt tilfælde af de normale orale slimhinder. De udvalgte kerner blev hullede og overført til paraffin-modtagende blokke. Hinanden følgende 4-um-tykke snit blev fremstillet, og hematoxylin og eosin-farvning blev udført på hver modtagerblokken for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​de udvalgte zoner.

Immunhistokemi

Immunohistokemiske pletter blev udført på 4 -μm-tykke sektioner fra vævet mikroarrays ved Leica Bond-Max autostaineren (Leica Microsystems, Bondbiotech, Taichung, Taiwan) i henhold til producentens anvisninger med mindre modifikationer. Sektionerne blev deparaffineret af Bond afvoksning Solution (Leica Microsystems) og rehydreret med gradueret alkohol. Varmeinduceret antigen hentning blev opnået ved Bond epitop Retrieval Solution 1 (Leica Microsystems) i 20 minutter ved 100 ° C. Objektglassene blev inkuberet i hydrogenperoxid i 5 minutter for at reducere endogen peroxidaseaktivitet. Objektglassene blev derefter inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med monoklonale museantistoffer mod Beclin 1 (1: 400, kanin polyklonale, Abcam, Cambridge, UK) og Beclin 2 (1: 400, kanin polyklonale, Novus Biologicals Littleton, CO, USA). En post-primær IgG koblingsreagens blev påført i 8 minutter, og objektglassene blev inkuberet med et polymert peberrodsperoxidase-IgG reagens i 8 minutter at lokalisere det primære antistof. Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) blev anvendt som substratet til påvisning antigen-antistof-binding. Endelig hæmatoxylin blev anvendt i 5 minutter til modfarve kerner.

Vurdering af immunhistokemi

Intensiteten, procent, og subcellulær lokalisering af immunhistokemisk farvning af hvert tilfælde blev registreret. Normal tonsillar væv blev anvendt som positiv kontrol. Farvning udelade det primære antistof blev udført som den negative kontrol. Cytoplasmatisk og nukleare udtryk blev vurderet separat. Intensiteten og procentdelen af ​​positivt farvede celler i hver kerne blev scannet i en laveffekt felt (100 X) og derefter vurderet i høj effekt felter (400 X). Intensiteten af ​​farvningen blev registreret som 0, 1, 2, og 3, der omhandler negativ, svag, moderat og stærk farvning, henholdsvis. Procentdelen af ​​positive celler blev registreret fra 0% til 100%. Resultaterne af farvning blev scoret med hurtig (Q) score, der blev opnået ved at gange procentdelen af ​​positive celler (P) af intensiteten (I) (Q = P × I; maksimum = 300) [16]. To patologer uafhængigt evalueret resultaterne af immunhistokemisk farvning uden kendskab til clinicopathologic data. Modstridende resultater blev løst ved en multihead mikroskop.

Cutoff punkt valg for immunhistokemi

For cytoplasmatiske udtryk for Beclin 1 og Beclin 2, den optimale cutoff-punkter i Q scoringer blev bestemt ved X-Tile software 3.6.1, som tidligere beskrevet [17]. Programmet beregnede chi-square værdier på alle mulige divisioner baseret på log-rank test for Kaplan-Meier-estimater. For cytoplasmatisk udtryk for Beclin 1, en optimal punkt med den højeste værdi blev bestemt. Det cutoff punkt Q scoringer med højeste chi-square værdier var 55, 110 og 25 til OS, DSS, og RFS hhv. Vi valgte 63 som cutoff Q score for Beclin en cytoplasmatisk udtryk. For cytoplasmatisk udtryk for Beclin 2, chi-square værdier bestemt ved 2 optimale cutoff punkter var højere end dem, som en optimal point. Således valgte vi 2 cutoff point for at klassificere sit udtryk i 3 grupper: lav, mellem og høj. Cutoff punkter i Q score med de højeste chi-square værdier var (35, 125), (35, 145), og (25, 85) til OS, DSS, og RFS hhv. Vi valgte (32, 118) som cutoff Q scorer for Beclin 2 cytoplasmatisk udtryk.

Kun et mindretal af tilfældene viste nukleare udtryk for Beclin 1 eller Beclin 2. Således sager med mere end 10% områderne nuklear farvning blev klassificeret som positive; de andre var klassificeret som negative.

Cellekulturer og reagenser

Den menneskelige orale planocellulært karcinom cellelinje SAS, etableret fra en dårligt differentieret planocellulært karcinom i tungen, blev dyrket i 10% FBS suppleret DMEM. Plasmider der udtrykker flag-mærket Beclin 1 og Beclin 2 blev opnået fra Addgene og en gave fra Levine laboratorium, hhv. For at generere en lentiviral vektor, der udtrykker Beclin 2, PCR fragment af flag-mærket

beclin 2

blev klonet i pLX301 lentivirale vektor (Addgene). Lentivira blev genereret ved co-transfektion HEK293 celler med plasmider pLX301-Beclin 2, pCMVDR8.2 og pMD.G ved Lipofectamine 2000. lentivira frigivet til dyrkningsmedium blev indsamlet ved 48 h og 72 h efter transfektion. SAS celler stabilt overeksprimerer Beclin 2 blev oprettet ved at inficere lentivirus udtrykker Beclin

2

og puromycinselektion. Bafilomycin, en autophagy inhibitor forhindrer fusion mellem autophagosomes og lysosomer, var køb fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

siRNA knockdown

Dobbelt-strenget lille interfererende RNA (siRNA) mod

Atg5

beclin 2

var køb fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) og Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Californien, USA), hhv. SAS-celler blev podet i plader med 6 brønde, og transficeret med 100 pmol siRNA ved RNAiMax (Invitrogen) ved den følgende dag.

Immunblotanalyse

Celler blev lyseret i PBS, der indeholdt 1% Triton X -100 og protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich). Lysaterne blev derefter centrifugeret ved 12,000x g ved 4 ° C i 15 min. Proteinerne i lysatet blev adskilt ved SDS-PAGE, overført til en polyvinylidendifluoridmembran og påvist ved immunblotting. Anti-Flag og Anti-ATG

5

blev købt fra Sigma-Aldrich. Anti-LC3 blev opnået fra Nanotool (Teningen, Tyskland). Anti-Beclin 1 og Anti-Beclin 2 blev købt fra Santa Cruz Biotechnology og Novus Biologicals hhv. Anti-P62 blev købt fra Abcam.

Immunfluorescensfarvning

Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd, og forarbejdet til immunfluorescensfarvning med primært antistof mod anti-Flag (M2) og inkubation med fluorescence- mærket sekundært antistof (Invitrogen). Endelig blev celler observeret, og billeder blev fanget under Leica SP5 fluorescensmikroskop.

klongenicitetsassayet

SAS-celler transficeret med plasmider eller siRNA blev udpladet med ca. 200 celler per brønd i 6-brønds plader og dyrket i 10 dage. Celler blev vasket med PBS og farvet med 1% krystalviolet i methanol i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter udvaskning af farvestof blev kolonier talt.

Statistisk analyse

De chi-square test blev anvendt til at evaluere foreningen af ​​ekspressionen af ​​Beclin proteiner og clinicopathologic funktioner. De korrelationer af Q scoringer blev vurderet af Spearman rank korrelation tests, og Spearman Rho koefficienter blev illustreret som zonekort. Kurver for OS, DSS, og RFS blev trukket ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden, og forskellene i overlevelsesrater blev sammenlignet ved log-rank test. De univariate og multivariate Cox andel regressionsmodeller blev brugt til at estimere hazard ratio og 95% konfidensintervaller for patienternes resultater. Alle

P

værdier var to-sidet. En

P Drømmeholdet værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Kolonien numre i klonogene assays var repræsenteret forhold mellem kontrol +/- standard fejl. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS-version 19.0 software (SPSS, Inc., Armonk, NY, USA) og Excel 2013 (Microsoft Excel, Microsoft, Redmond, WA, USA) i Windows.

Resultater

Aberrant Beclin 1 og Beclin 2 udtryk i orale kræft væv

for at evaluere Beclin 1 og Beclin 2 udtryk og deres subcellulære lokalisering, vi udførte immunhistokemi på 195 tilfælde af orale kræft væv og normale orale slimhinder. Beclin 1 og Beclin 2 udtryk blev primært lokaliseret i cytoplasmaet, og lejlighedsvis i kerner. De normale orale slimhinder viste svag til moderat cytoplasmatisk udtryk og fokal nukleare udtryk for Beclin 1 og Beclin 2 (fig 1A og 1E). De orale kræft væv udstillet variable cytoplasmatiske udtryk for Beclin 1 og Beclin 2, lige fra samlede tab til diffus stærkt udtryk (Fig 1B-1D og 1F-1H). De gennemsnitlige Q scoringer af cytoplasmatisk Beclin 1 og Beclin 2 var 67.46 ± 55,19 og 75,26 ± 62,16, hhv. Cutoff point for Beclin 1 og Beclin 2 blev beskrevet i materialer og fremgangsmåder. For cytoplasmatisk Beclin 1, 111 tilfælde (56,92%) blev klassificeret som lav udtryk, og 84 tilfælde (43,08%) blev klassificeret som høj ekspression. For cytoplasmatisk Beclin 2, 65 patienter (33,33%) blev klassificeret som lav udtryk; 83 patienter (42,56%) blev klassificeret som moderat udtryk; 47 patienter (24,10%) blev klassificeret som høj ekspression. Kun en lille delmængde af orale cancer væv udtrykker nukleare farvning af Beclin 1 (33/195, 16,92%) og Beclin 2 (29/195, 14,87%) (fig 1C, 1D og 1I).

(A ) Svag til moderat cytoplasmisk og nuklear ekspression af Beclin 1 i normale orale skællede mucosa. (B) Lav cytoplasmatisk udtryk for Beclin 1 i en mundtlig kræftvæv. (C) Høj cytoplasmatisk og positiv nukleare udtryk for Beclin 1 i en mundtlig kræftvæv. (D) cytoplasmatisk og positiv Lav nukleare udtryk for Beclin 1 i en mundtlig kræftvæv. (E) Svag til moderat cytoplasmisk ekspression af Beclin 2 i normal oral squamous slimhinde. (F) Lav cytoplasmatisk udtryk for Beclin 2 i en mundtlig kræftvæv. (G) Moderat cytoplasmatisk udtryk for Beclin 2 i en mundtlig kræftvæv. (H) Høj cytoplasmatisk udtryk for Beclin 2 i en mundtlig kræftvæv. (I) Moderat cytoplasmatisk og positiv nukleare udtryk for Beclin 2 i en mundtlig kræftvæv.

Sammenslutninger af Beclin 1 og Beclin 2 udtryk med clinicopathologic egenskaber og autophagosomal markør i orale kræft væv

Vi sammenlignede Beclin 1 og Beclin 2 udtryk med alder, køn, tumorstørrelse, lymfeknude-status, metastase, stadium, klasse, lymphovascular invasion, og nekrose (tabel 1). Beclin 1-ekspression var relateret til clinicopathologic funktioner. Lav cytoplasmatisk udtryk for Beclin 2 blev forbundet med højere histologisk bedømmelse (en dårlig prognostisk faktor) i forhold til moderate og høje udtryk. Positiv nukleare udtryk for Beclin 2 blev forbundet til fattige prognostiske faktorer, herunder lymfeknude metastaser og lymphovascular invasion.

De nukleare og cytoplasmatiske udtryk for Beclin 1 viste svag sammenhæng (Spearman Rho = 0,287,

P

0,001). De nukleare og cytoplasmatiske udtryk for Beclin 2 blev også svagt korreleret (Spearman Rho = 0,212,

P

= 0,003). Den cytoplasmatiske udtryk for Beclin 1 og Beclin 2 var relateret (Spearman Rho = -0,072,

P

= 0,318). Relationerne af Beclin proteiner og den autophagosomal markør, LC3B, blev også evalueret. De autophagosomes repræsenteret ved LC3B punctae blev evalueret i vores tidligere undersøgelse [18]. Kun cytoplasmatisk Beclin en korreleret til niveauet for LC3B punctae (Spearman Rho = 0,305,

P

0,001). (Fig 2)

Farve skala for Spearman s koefficient rho er givet i den nedre højre, med grønne repræsenterer en negativ korrelation og rød positiv. *

P

0.05.

Tydelige ekspressionsmønstre af Beclin proteiner er forbundet med dårlig prognose

Kaplan-Meier kurver af kumulativ OS, DSS, og RFS sandsynligheder for Beclin 1 og Beclin 2 vises i Fig 3. Patienter med højt cytoplasmatisk Beclin 1-ekspression viste lavt DSS (

P

= 0,008), og dem med negativ nukleare Beclin 1-ekspression viste høje RFS (

P

= 0,036). Patienter med enten høj eller lav cytoplasmatisk Beclin 2 udtryk havde betydeligt lavere OS og DSS satser sammenlignet med patienter med moderat cytoplasmatisk Beclin 2 udtryk. De overlevelsessandsynligheder mellem patienter med lav og høj cytoplasmatiske udtryk var ikke statistisk signifikante. Den nukleare Beclin 2 udtryk var uassocieret med overlevelse status.

Resultatet af univariate og multivariate overlevelse analyser ved hjælp af Cox proportional hazard regressionsmetoder er vist i tabel 2, 3 og 4. Høj cytoplasmatisk Beclin 1 og negativ af nukleare Beclin 1 blev forbundet med dårlig DSS og RFS under univariate og multivariate analyser, hhv. Derudover cytoplasmatisk Beclin 2-ekspression var en uafhængig prognostisk faktor for OS og DSS. Lave og høje cytoplasmatiske Beclin 2 udtryk var forbundet med aggressive kliniske resultater. Vejviser

Enten Beclin 1 eller Beclin 2 overekspression inducerer autophagy og fremmer oral cancer cellevækst

at undersøge virkningerne af Beclin 1 og Beclin 2 overekspression i oral cancer, vi anvendte SAS-celler transficeret med plasmid, der udtrykker flag-tagged Beclin 1 og Beclin 2. Overekspression af Beclin en eller Beclin 2 førte til stige af konverteringen af ​​LC3-I til LC3-II under normale forhold. Imidlertid var dette fænomen inevident under sult tilstand (Fig 4A). Forholdet mellem LC3-II /LC3-I og P62-niveau blev både forøget i celler, der overudtrykker Beclin 1 eller Beclin 2 sammenlignet med kontrol efter bafilomycin behandling i sult (S1 Fig). Disse resultater bekræfter rollen af ​​Beclin 2 i autophagy pathway.

(A) SAS-celler blev transficeret med kontrol plasmid, plasmider, der udtrykker flag-tagged Beclin 1 (B1) eller Beclin 2 (B2). Ved 24 timer efter transfektion blev celler behandlet med Earles balancerede saltopløsning (EBSS) i 1 time sult. Lysat blev fremstillet og analyseret ved immunblot under anvendelse af de viste antistoffer. Intensiteten af ​​LC3-I og LC3-II blev målt ved anvendelse ImageJ og forholdet mellem LC3-II /LC3-I er vist nedenfor. (B) HEK293-celler, der stabilt udtrykker GFP-LC3 blev transficeret med plasmid, der udtrykker flag-tagged Beclin 1 eller Beclin 2 og dyrkes i enten normal dyrkningsmedium (DMEM) eller sult tilstand (EBSS) som angivet. Celler blev fastsat til 48 timer efter transfektion. Indirekte immunfluorescensfarvning blev udført ved anvendelse af anti-Flag M2. 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning afslørede kernen. Boksen region er forstørret (a). (C) SAS-celler blev transficeret med kontrol eller flag-tagged Beclin 1 og Beclin 2 i 24 timer. Transficerede celler blev genudpladet på 200 celler per brønd i pladen med 6 brønde. Efter 14 dage blev kolonier visualiseret under anvendelse af 1% krystalviolet i methanol. blev gennemført tre gange uafhængigt Forsøgene.

For at evaluere den subcellulære lokalisering af Beclin proteiner blev HEK293-celler transficeret med plasmid udtrykker flag-mærket Beclin 1 og Beclin 2. Under normale forhold, at antallet af GFP-LC3 puncta var lav, og Beclin 1 og Beclin 2 meste lokaliseret i cytoplasmaet (fig 4B, venstre panel). Efter autophagy induktion af næringsstof sult og bafilomycin behandling, viste celler øget LC3 punctae; Beclin 1 og Beclin 2 viste partiel colokalisering med LC3 punctae (Fig 4B, højre panel). Desuden har vi observeret, at LC3 punctae blev udvidet i Beclin 2 overekspression celler sammenlignet med kontrol og Beclin en overekspression celler. Endvidere celler med enten Beclin 1 eller Beclin 2 overekspression medført øget klonogene overlevelse evne sammenlign styre transficerede celler (Fig 4C). Disse resultater tyder på, at overekspression af Beclin en eller Beclin 2 aktiverer autofagi og fremmer kræft cellevækst, og virkningerne af overekspression af Beclin 1 og Beclin 2 var uafhængige af hinanden.

Beclin 2 udtømning svækker autofagi og fremmer oral kræft cellevækst

for at inspicere effekten af ​​beclin 2 udtømning og dets forhold til autophagy i oral cancer, vi transficeret siRNAs rettet enten

beclin 2

eller

Atg5

i SAS celler . Fordi det endogene Beclin 2 var lavt i SAS celler, blev effektiviteten af ​​

beclin 2

knockdown af siRNA først bestemt i celler stabilt udtrykte flag-mærket Beclin 2. Celler stabilt udtrykker Beclin 2 viste større andel af LC3- II /LC3-I (fig 5A, venstre panel). Efter transfektion siRNA målretning

beclin 2

eller

Atg5

, udtryk for Beclin 2 eller Atg5 blev reduceret betydeligt, og forholdene mellem LC3-II /LC3-I blev reduceret samtidig (Fig 5A, højre panel). Selvom den endogene Beclin 2 ikke var i stand til at opdage efter transfektion siRNA målretning

beclin 2

, den Beclin 1 og Atg5 niveauer var upåvirket, og forholdet mellem LC3-II /LC3-I blev reduceret (figur 5B). Disse data indebærer, at Beclin 2 udtømning forårsager autofagi værdiforringelse. Celler med enten Beclin 2 eller Atg5 udtømning viste klonogen overlevelse evne sammenligne med de celler behandlet med kontrol siRNA (Fig 5C). Disse resultater tyder Beclin 2 udtømning svækker del af autophagy aktivitet og fremmer kræft cellevækst.

(A) De SAS celler eller celler stabilt udtrykker flag-mærket Beclin 2 eller (B) SAS-celler transficeret med kontrol siRNA ( scr), Atg5 siRNA (siAtg5) eller Berlin 2 siRNA (siB2). Cellelysat blev fremstillet efter 48 timers transfektion og analyseret ved immunblot under anvendelse af de viste antistoffer. (C) SAS-celler blev transficeret med kontrol siRNA (scr), Atg5 siRNA (siAtg5) eller Berlin 2 siRNA (siB2) i 24 timer. Transficerede celler blev genudpladet på 200 celler per brønd i pladen med 6 brønde. Efter 14 dage blev kolonier visualiseret under anvendelse af 1% krystalviolet i methanol. Forsøgene blev udført tre gange uafhængigt af hinanden.

Diskussion

Beclin familien har 2 identificerede medlemmer, Beclin 1 og Beclin 2. prognostiske rolle Beclin 1 er blevet bredt undersøgt i forskellige typer af humane cancere og patienternes resultater bestemt ved cytoplasmatisk Beclin 1 ekspression kan være specifikke for cancer type. For eksempel lav ekspression af Beclin 1 associeret med dårlig prognose ved brystcancer [19, 20], ovariecancer [21], lungecancer [22], hepatocellulært carcinom [23], cholangiocarcinom [24], pancreascancer [25], hypopharyngeal cancer [26], larynx cancer [27], esophageal cancer [28], duodenal cancer [29], gastrisk cancer [30], lymfomer [31-33], etc. høj ekspression af Beclin 1 forbundet til tumor aggressivitet i nasopharyngeal carcinom [34], endometriecancer [35], og kolorektal cancer [36]. Undersøgelserne af Beclin 1 i orale kræft væv viste, at høj ekspression var relateret til fattige prognostiske faktorer og /eller aggressive kliniske resultater [37, 38]. Vores undersøgelse var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, og vi afslørede desuden, at overekspression af Beclin 1 i SAS induceret tumorvækst i klonogene assay, demonstrerer sin rolle som tumor progression i kræft i mundhulen.

I denne undersøgelse vi først vurderet ekspression og prognostiske rolle Beclin 2 i human cancer. Vi oplyses, at orale kræftpatienter med enten høj eller lav ekspression af Beclin 2 viste dårligere prognose end dem med moderat udtryk. Ekspressionen af ​​Beclin 2 var uafhængig af cancer fase (tabel 1). Enten høj eller lav Beclin 2 udtryk i kræft væv foreslog dysfunktion i autophagy og stofskifte. Beclin 2 funktionelle analyser viste desuden enten dens udtømning eller overekspression fremmet tumorvækst i SAS kræft oral celler. Disse resultater indebærer Beclin 2 er forbundet med tumorigenese i oral cancer. Manipulation af genekspression af

beclin 1

påvirkede ikke Beclin 2-protein, og vice versa. De cytoplasmatiske udtryk for de 2-proteiner var også relateret i orale cancervæv (fig 2). Resultaterne tyder den molekylære mekanisme er involveret i oral tumorgenese af disse 2 proteiner er uafhængig.

Autophagy har været impliceret i både tumor suppression og tumorprogression. Autophagy hæmmer malign transformation af normale celler ved at opretholde cellulær homeostase, normale stofskifte, og genomisk stabilitet [39]. På etablerede tumorer, autofagi fremmer ofte tumorcellevækst ved at opretholde stofskiftet i stressende tilstand [40, 41]. den faktiske indflydelse autophagy på tumorigenese kan imidlertid være kontekstafhængig. Autophagy kan regulere cellevækst forskelligt afhængigt vævstyper og specifikke genetiske indstillinger [42, 43]. Foreningerne mellem autofagi og Beclin proteiner er blevet veldokumenteret. Beclin proteiner interagerer med komponenter i klasse III phosphoinositid 3-kinase kompleks, som er nødvendig for initiering af autophagy [13, 44]. Beclin 1 er involveret i dannelsen af ​​phagophore (forløberen for autophagosome) i de tidlige trin af autophagy, og colocalized med LC3 punctae [45, 46]. Vores data først demonstreret colokalisering af Beclin 2 og LC3, bekræfter, at Beclin 2 er involveret i autophagy. Selvom vi fundet, at manipulationer af Beclin 1 eller Beclin 2-niveau førte til ændring i autophagy, deres virkninger på tumorvækst kan ikke helt direkte skyldes autofagi. Beclin 1 var oprindeligt findes at have tumorsuppressorfunktion [5]. Paradoksalt nok var høj ekspression af Beclin 1 forbundet med tumor progression i nogle kræftformer, som tidligere beskrevet [34-38]. Allel tab af

beclin 1

hæmmede tumor dannelse i visse genotyper af mus [47, 48]. Beclin 1 ikke kun interagerer med positive og negative regulatorer af autophagy, men også deltager i flere ikke-autophagic processer [49]. Virkningerne af Beclin 1 på tumor progression kan være mindst delvis uafhængig af autofagi. Desuden er vores undersøgelse først etableret forbindelsen af ​​Beclin 2 og tumorprogression. De relationer Beclin 2 og tumorigenese kan være mere kompliceret. Den tumorprogression forårsaget af Beclin 2 overekspression og udtømning kan skyldes forskellige mekanismer. Vore data og tidligere litteratur fundet, at knockdown af Beclin 2 forringet men ikke helt afskaffet autofagi [13]. Den tumorvækst forårsaget af Beclin 2 udtømning kan fremkaldt af autophagy og /eller autofagi-uafhængige mekanismer. Beclin 2 deler flere interagerende partnere af Beclin 1, og endvidere kræves for nedbrydning af GASP1-regulerede G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er) [13]. Mange GPCR’er er overudtrykt i cancere og bidrage til cancercelleproliferation [50]. Tab af Beclin 2 kan forårsage akkumulering af nogle GPCR’er og føre til tumorprogression.