PLoS ONE: Sarsaparilla (Smilax Glabra rhizom) Uddrag Forhindrer Migration og invasion af kræftceller ved at undertrykke TGF-β1 Pathway

Abstrakt

Sarsaparilla, også kendt som

Smilax Glabra

rhizom (SGR), viste sig at modulere immunitet, beskytter mod leverskade, lavere blodsukker og undertrykke kræft. Men dens virkninger på cancer celleadhæsion, migrering og invasion var uklare. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at supernatanten af ​​vandopløseligt ekstrakt fra SGR (SW) kunne fremme adhæsion, inhiberer migration og invasion af HepG2, MDA-MB-231 og T24 celler

in vitro

, samt som undertrykke metastase af MDA-MB-231 celler

in vivo

. Resultater af F-actin og vinculin dobbelt farvning viste forbedrede fokal adhæsion i SW-behandlede celler. Microarray analyse indikerede en undertrykkelse af TGF-β1 signalering ved SW behandling, som blev verificeret ved real-time RT-PCR af TGF-β1-relaterede gener og immunoblotting af TGFBR1 protein. SW blev også vist at antagonisere TGF-β1-fremmet cellemigrering. Kollektivt, vores undersøgelse afslørede en ny antitumor funktion af Sarsaparilla modvirke invasiv af en delmængde af kræftceller ved at hæmme TGF-β1 signalering

Henvisning:. Hun T, Zhao C, Feng J, Wang L, Qu L, Fang K, et al. (2015) Sarsaparilla (

Smilax Glabra

rhizom) Uddrag Forhindrer Migration og invasion af kræftceller ved at undertrykke TGF-β1 Pathway. PLoS ONE 10 (3): e0118287. doi: 10,1371 /journal.pone.0118287

Academic Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korea, Republik

Modtaget: Juni 28, 2014, Accepteret: 12 Januar 2015; Udgivet: 5 Marts 2015

Copyright: © 2015 Hun et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Microarray data har blevet deponeret i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (tiltrædelse nej. GSE58201), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE58201.

Finansiering : Finansiering blev leveret af National Basic Research Program Kina (2010CB529303, 2013CB910504), https://www.973.gov.cn/Default_3.aspx. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Sarsaparilla, også kendt som

Smilax Glabra

rhizom (SGR), er et naturligt kosttilskud meget udbredt i fødevarer-making og sundhedspleje, baseret på dens evne i afgiftende, clearing varme og lindre fugt [1,2]. Nogle SGR-holdige drikkevarer, fødevarer og kosttilskud er købes i Sydøstasien og Nordamerika. Patienter med dermatitis, syfilis eller podagra i Sydøstasien har nydt godt af behandlingen af ​​SGR-holdige krydderurteblandinger for en lang historie [3,4]. I øjeblikket er der også voksende videnskabelige beviser rapportering sit terapeutiske potentiale til behandling af leddegigt [5], inflammation [6], leverskade [1], hyperinsulinæmi [7] og kræft [8].

De funktioner af SGR er primært opdelt i fire aspekter, nemlig immunmodulerende, lever-beskyttende, tumordræbende og andre. På den immunmodulerende aspekt, den vandige ekstrakt fra SGR udøver en markant hæmning på picrylchlorid (PCL) – eller røde blodlegemer fra får (SRBC) -induceret forsinket hypersensitivitet (DTH) [6,9]. SGR virker primært på cellulært immunrespons (CIR), effektorfasen af ​​DTH snarere end humoral immunrespons (HIR) og således i SGR en overlegen fordel til andre immunsuppressorer til behandling CIR-medierede inflammatoriske sygdomme som hepatitis og rheumatoid arthritis [6,9 ]. Astilbin, en af ​​bioaktive forbindelser isoleret fra SGR, kan ændre

in vivo

cytokin profiler af lymfocytter og undertrykke migrering af aktiverede T-celler, hvilket lindre kontakt hypersensitivitet og DTH [10,11]. På hepato-beskyttende aspekt Astilbin letter apoptose af leveren-infiltrerende T-lymfocytter og inhiberer cellematrixkonstruktionen adhæsion af splenocytter at minimere leverskader [12,13]. Desuden kunne det forbedre leverfunktionen ved reversering forhøjet transaminase, sænke TNF-α produktion og reducere hepatotoksicitet af parenkymale celler [12,14]. Taxifolin, en anden forbindelse isoleret fra SGR, blev fundet at ændre lipidmetabolismen at lindre leveren byrde [15,16]. Funktionen af ​​SGR omfatter desuden andre biologiske funktioner, herunder at undertrykke Helicobacter pylori-aktivitet [17], sænke blodglucose [2] og mindske aktiviteten af ​​HIV-1 integrase [18]. Alle disse resultater peger på den multifunktionelle potentiale SGR.

På anticancer aspekt, blev oral indtagelse af et naturlægemiddel formel, der indeholder SGR sig at udvide smertestillende vedvarende tid, forbedre patienternes livskvalitet og forlænge lang overlevelse af patienter med hepatisk carcinoma [19] sigt. En anden SGR-holdige injektion blev opdaget at mindske tumorvækst ved relative høje doser i musemodeller [20]. Uddrag fra SGR viste sig at fremme apoptose i human colorectal cancer HT-29, human hepatisk kræft HepG2 og HepG3 celler [8,21]. Der er også flere hints angiver de mulige roller SGR i at kontrollere celleadhæsion og migration. Astilbin kan undertrykke vedhæftningen af ​​splenocytter til ekstracellulære matrix i lever-såret musemodeller [14], og blokere intercellulær vedhæftning mellem humane Jurkat T-celler og ECV-304 celler [13]. Desuden 5-O-caffeoylshikimic syre, taxifolin og astilbin fra SGR hæmmede migration og vedhæftning af makrofager [22]. Ikke desto mindre, den direkte rolle SGR ekstrakt på kræftcelle invasiv er uklar, og det mekanistiske grundlag mangler. I den foreliggende undersøgelse vurderede vi virkningerne af supernatanten af ​​vandopløselig ekstrakt af SGR (SW) på adhæsion, migrering og invasion af tre cancercellelinier, og udforskede mulig mekanisme. Salg

Materialer og metoder

Etik Statement

Animal undersøgelse blev godkendt af Biomedical Etisk Komité Peking University Cancer Hospital Institut og udføres sammen etablerede institutionelle dyrevelfærd retningslinjer samstemmende med de amerikanske retningslinjer (NIH publikation # 85-23, revideret i 1985).

Materialer

Matrigel blev købt fra BD Biosciences (San Jose, CA). Antistoffer mod vinculin og TGFBRI blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og Bioworld (Beijing, Kina) hhv. TGF-β1 var fra Sigma-Aldrich.

Udarbejdelse af SGR ekstrakt

SGR blev opnået fra Ben Cao Fang Yuan Pharmaceutical Co (Beijing, Kina). Procedurerne for udarbejdelse af supernatanten af ​​vandopløseligt ekstrakt fra SGR (SW) blev beskrevet tidligere [23]. Den procentvise udbytte for SW var 7,27% (g /g). Opløsningsmidlet til fremstilling af SW (stamopløsning) blev 3% DMSO i PBS, og DMSO i arbejdstiden opløsning af SW var lavere end 0,15% (v /v).

Cellekultur

HepG2, MDA-MB-231 og T24-celler blev opnået fra ATCC (Rockville, MD) og dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) plus 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Alle reagenser til kultur blev opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA).

celleadhæsionsassay

Celler blev podet i 6 cm-skåle og dyrket med RPMI 1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS ). Matrigel var 1: 100 fortyndet med serumfrit RPMI 1640-medium og tilsat til 96-brønds plade for at tillade at belægge natten over ved 4 ° C. Næste dag blev cellerne trypsiniseret og opsamlet i serumfrit medium suppleret med angivne doser af SW. Efter lægemiddel-forbehandling i 15 minutter (for T24-celler) eller 30 min (for MDA-MB-231 og HepG2-celler), blev cellesuspensionen derefter suppleret med 0,5% FBS før bliver podet i Matrigel pre-coated 96-brønds plader ved tætheden af ​​2 × 10

4 per brønd og fik lov at adhærere i 2 timer. Efter fjernelse af ikke-adhærente celler ved PBS blev adhærente celler fotograferet med CloneSelect Imager systemet (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Ni mikroskopiske områder af hver brønd blev tilfældigt taget til fange og celler blev talt under anvendelse af Image Pro Plus software.

Transwell migration /invasion assay

For migration assay blev celler podet i 10 cm skåle. Næste dag blev cellerne høstet i serum-frit medium og opdelt i tre lige store dele. Efter hver del blev suppleret med angivne doser af SW, var halvdelen af ​​cellesuspension tilsat til den øvre brønd i transwell indsats (Corning Inc, Corning, NY) med en densitet på 1 x 10

4 (for T24 og HepG2-celler ) eller 5 × 10

3 (for MDA-MB-231 celler) pr. Den nedre brønd blev tilsat med RPMI 1640 indeholdende 10% FBS medium som kemotaktiske attractors. Den resterende halvdel af cellesuspension blev derefter podet i plader med 96 brønde for levedygtighed assay. Efter 12 H’er inkubation blev celler, som er trængt ind i undersiden af ​​Transwell membran farves med krystalviolet og fotograferet under mikroskop. 14 mikroskopiske felter blev tilfældigt fanget og tælles. At evaluere virkningen af ​​TGF-β1 på cellemigration blev celler udsultet med RPMI 1640 indeholdende 0,5% FBS i 24 timer og derefter opsamlet ved trypsinbehandling. Cellesuspensionen blev delt i fire lige store dele, og hver del blev suppleret med opløsningsmiddel, 5 ng /ml TGF-β1, 1,5 pg /pl SW eller SW plus TGF-β1. Efter tilsætning halvdelen af ​​lægemiddelholdige cellesuspension ind i den øvre brønd i Transwell insert, blev den resterende cellesuspension tilsat til plader med 96 brønde. Begge plader blev inkuberet i 12 timer. Transwell-plader blev anvendt til migration assay og de 96-brønds plader for celleviabilitetstest. For invasion assay, et lag af matrigel (1: 4-fortynding i serumfrit medium) blev for-overtrukket på den øvre brønd i Transwell insert før tilsætning celler, og cellerne blev inkuberet i 36 timer før krystalviolet farvning. Resten procedurer var de samme som migration assay.

Cell sårheling assay

To parallelle linjer blev trukket på bagsiden af ​​de 12 brønde med en markør pen før celle såning. Næste dag blev dyrkningsmediet fjernet og erstattet med 0,5% FBS /RPMI 1640 medium. 24 timer senere blev en lige sår linje, der var vinkelret på disse parallelle linjer trukket tværs vedlagte cellelaget med pipettespidser. Derfor blev såret mellemrum mellem to parallelle linjer markeret. Efter fjernelse af flydende celler med PBS, angivet doser af SW blev tilsat i hver brønd. Billeder blev taget af den markerede mellemrum hver 6-8 timer, indtil såret lukket. De sår huller blev digitalt kvantificeres ved hjælp af Image Pro Plus software.

Animal model

7- til 8 uger gamle Balb /c nøgne mus (Vital River Laboratories, Beijing, Kina) var injiceret gennem halevenen med 1 x 10

6 MDA-MB-231-celler. Næste dag, mus (n = 8 for hver gruppe) blev oralt administreret med 72,7 mg SW (fremstillet i PBS, svarer til 1 g SGR) eller PBS per dag. Efter to uger blev musene holdt i yderligere 3 uger inden de ofret for lunge og lever samling. Hematoxylin og eosin (H 0.05 og Fold-Change tærskel 1.5 blev identificeret til at være statistisk signifikante ændringer. Kegg, GO og Gene Cards (https://www.genecards.org/) blev udnyttet til at vælge ud gener, der var relateret til celle adhæsion, migration og invasion. Derefter blev disse gener bringes i STRING database til signalvejen søgning. Real-time RT-PCR blev anvendt til at validere resultaterne af microarray og udføres i henhold til producentens anvisninger (SYBR, TOYOBO). Ekspressionsniveauer af alle gener blev normaliseret via

GAPDH

genet og 2

-ΔΔCT metode blev anvendt til at beregne relativ genekspression. De primere til real-time RT-PCR (

TGFBR1

, fremad, 5′-CCTGGGATTTATAGCAGCAGAC-3 ‘, omvendt, 5′-TGACACCAACCAGAGCTGAG-3’;

NTS

, fremad, 5 ‘ -ATTAGTAAAGCACATGTTCC-3 ‘, omvendt, 5′-CTCCCAGTGTTGAAAAGCCC-3’;

ID1

, fremad, 5′-GAGCTGAACTCGGAATCCGAAG-3 ‘, omvendt, 5′-GATCGTCCGCAGGAACGCATGC-3’;

ID2

, fremad, 5′-TCAGCCTGCATCACCAGAGA-3 ‘, omvendt, 5′-CTGCAAGGACAGGATGCTGATA-3’;

ID3

, fremad, 5′-CTGAGCTTGCTGGACGACA-3 ‘, omvendt, 5′-ATGTAGTCGATGACGCGCTGTA-3’) blev syntetiseret ved GenePharma (Shanghai, Kina).

Statistisk analyse

data analyse blev udført ved hjælp af SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL). To-tailed student t-test og ANOVA blev anvendt til at bestemme betydningen af ​​forskelle mellem forskellige forsøgsgrupper.

Resultater

SW øger celleadhæsion

For at teste effekten af ​​SW på cancerceller evne til at binde til ekstracellulær matrix, udførte vi celleadhæsionsassay hjælp hepatom HepG2 (fig. 1A), brystcancer-cellelinie MDA-MB-231 (fig. 1B) og blærecancer-cellelinie T24 (fig. 1C). Det blev konstateret, at vedhæftningen af ​​HepG2-celler til matrigel blev forøget med 0,7 ug /pi SW (fig. 1A), mens effekten af ​​samme koncentration af SW på adhæsionen af ​​MDA-MB-231-celler var marginal (fig. 1B) . Tværtimod stigningen i adhæsion var mere tydelig i T24-celler og den højeste adhæsion blev opnået ved så lav som 0,07 pg /pl af SW (Fig 1C.)

venstre paneler:. HepG2 (A), MDA-MB-231 (B) og T24-celler (C) blev forbehandlet med angivne doser af SW for 15 eller 30 minutter før podning i Matrigel-coatede brønde, og 2 timer senere blev klæbet celler talt efter fjernelse af flydende celler ved PBS. Repræsentative billeder blev vist. Scale bar, 200 pm. Højre paneler: kvantificering af data i det venstre panel, vist var sammensatte resultater af tre uafhængigt forsøg med tre eksemplarer. Kolonner, betyder; barer, SD.

SW hæmmer kræft celle migration

Dernæst udførte vi

in vitro

scratch assay. Celler blev præinkuberet i 0,5% FBS-medium i 24 timer før indførelsen af ​​bunden for at udelukke virkningerne af FBS på celleproliferation. Den sårheling blev overvåget med regelmæssige intervaller, indtil det lukket op. Vi observerede, at SW førte til en opbremsning af indvandringen i HepG2, MDA-MB-231 og T24-celler (fig. 2A, B og C), med MDA-MB-231 celler viser den mest oplagte hæmmende effekt (Fig. 2B ). Vi har bemærket, at det krævede forskellig for forskellige cellelinjer at hele sårene. Derudover samme koncentration af SW udviste distinkt inhibering på sårheling i forskellige cellelinier. Dette kunne forklares ved celle linage specificitet ved migration. I betragtning af ruhed og subjektivitet af scratch-analysen, vi brugte også transwell migration assay. Cellerne, lykkedes presse gennem de mikrohuller af basen membranen i SW-behandlede gruppe var markant mindre end kontrolgruppen (fig. 3A, B og C, til venstre og midterste paneler), med ringe indflydelse på cellelevedygtigheden (fig. 3A, B og C, højre paneler). Disse resultater pegede på den inhiberende virkning af SW på kræft cellemigration.

In vitro

scratch-assay blev anvendt til at vurdere virkningen af ​​SW for migration af HepG2 (A), MDA-MB -231 (B) og T24-celler (C). Repræsentative billeder blev vist i venstre panel; kvantificering af dataene i venstre panel blev vist i højre panel, vist var sammensatte resultater af tre uafhængigt forsøg med tredobbelte parallelle prøver. Migrationen indekset repræsenterer migration hastighed i forhold til kontrolgruppen. Kolonner, betyder; barer, SD.

HepG2 (A), T24 (B) og MDA-MB-231 (C) -celler blev podet i Transwell insert i nærvær af angivne doser af SW i 12 timer. Celler der strækker undersiden af ​​Transwell membran blev farvet og repræsentative billeder blev vist i det øverste panel. Scale bar, 200 pm. Dataene i venstre panel blev kvantificeret og vist i midten panelet, og cellen levedygtighed blev afspejlet ved celle sammenløbet sats i højre panel. Vist var sammensatte resultaterne af to uafhængigt eksperimenter. Kolonner, betyder; barer, SD; NS, ikke statistisk signifikant.

SW hæmmer invasion kræftcelle

in vitro

og metastase

in vivo

Vi testede også virkningen af SW på kræftcellen invasion. Alligevel brugte vi den samme transwell enhed plus indlæser et lag af matrigel over basen membran. Som forventet, SW behandling forhindret alle tre cellelinier fra invaderende tværs af matrigel at nå bunden side af bunden membran (fig. 4A, øvre panel og nederste venstre panel). Derudover 36 h udsættelse for angivne doser af SW udøvede ubetydelig inhibering på celleproliferation (fig. 4A, nedre højre panel). For yderligere at vurdere effekten af ​​SW på metastaser

in vivo

, MDA-MB-231 metastatiske mus model blev anvendt. Som vist i fig. 4B, oral indgivelse af SW i 2 uger markant nedsat antallet af lunge metastatiske foci. Ingen lever metastatiske foci blev observeret i begge grupper (S1 Fig.)

(A) Transwell kamre blev præ-coatet med 60 pi matrigel fortynding (1: 4 i serumfrit medium). Før såning celler. Celler blev inkuberet med angivne doser af SW i 36 timer før farvning. Repræsentative billeder blev vist i det øverste panel. Scale bar, 200 pm. Dataene for migration og cellelevedygtighed blev kvantificeret og vist i henholdsvis nedre panel, vist var sammensatte resultaterne af to uafhængigt eksperimenter med tre eksemplarer. Kolonner, betyder; barer, SD; NS, ikke statistisk signifikant. (B) Venstre panel: repræsentative billeder af H 10 MDA-MB-231 cancerceller blev identificeret som metastatiske foci. Forstørrelse, 4 × (øvre) og 20 × (lavere). Højre panel: kvantificering af lunge metastatiske foci i PBS og SW-behandlede mus (n = 8 for hver gruppe). Kolonner, betyder; barer, SD.

SW øger omdrejningspunkt vedhæftning

Det blev rapporteret, at antallet og størrelsen af ​​fokale sammenvoksninger var omvendt proportional med migration hastighed [24]. Til det udførte vi dobbelt fluorescerende farvning af F-actin og vinculin at vurdere effekten, hvis nogen, af SGR om fokal vedhæftning [20,24,25]. Efter eksponering for SW i 0,5 time, begyndte HepG2 og T24-celler til at udvise stærkere vinculin signal hovedsageligt omkring cellen periferien og viser en fascicle-lignende eller spot-lignende form (fig. 5A). Tilsvarende blev store stress fibre på tværs af cellen krop tabt, med F-actin fibre gradvis ved at flytte til celle periferien og co-lokalisere der med vinculin så godt. Vi kvantificeret de områder og fluorescerende intensiteter af vedhæftning sites. Som vist i fig. 5B, adhæsionen areal pr celle forhøjet ved 0,5 time og nåede plateau ved 1 time i SW-behandlede HepG2-celler, mens den allerede opnået top ved 0,5 timer efter SW behandling i T24-celler. Lignende resultater blev opnået i intensitet kvantificering (Fig. 5C).

(A) HepG2 og T24-celler blev behandlet med SW (3,5 pg /pl) for angivne gange og derefter immunofarvet med F-actin (FITC -phalloidin) og vinculin (rød). Kerner blev modfarvet ved DAPI (blå). Repræsentative billeder blev vist. Scale bar, 100 pm. (B) Det område af vedhæftning steder pr celle (hvor F-actin og vinculin fusionerede). Vist var sammensatte resultaterne af to uafhængigt eksperimenter (n = 50 celler). Kolonner, betyder; barer, SD. (C) Fluorescensintensiteten af ​​vinculin i adhæsions- patches per celle. Vist var sammensatte resultaterne af to uafhængigt eksperimenter (n = 50 celler). Kolonner, betyder; barer, SD.

SW modvirke TGF-β1-induceret opregulering af gener relateret til invasiv

For at få en dybere forståelse af mulig mekanisme for alle disse resultater, vi udførte en genekspression microarray analyse med SW-behandlede HepG2-celler. Vi fandt der var 118 gener med mere end 1,5 gange ekspression ændring i celler behandlet med SW, nogle af dem var relateret til cellemotilitet, metabolisme og oxidativt stress (fig. 6A). Dernæst analyserede vi en undergruppe af gener associeret med celle invasionsevne hjælp STRING database. Som vist i fig. 6B, de fleste af disse 12 gener blev direkte eller indirekte reguleret af TGF-β1 pathway, hvilket indikerer, at TGF-β1 pathway kan være involveret i SW-regulerede fænotyper. Real-time RT-PCR blev udført for at evaluerede ekspressionsniveauer af 5 gener, dvs.

TGFBR1

,

NTS

,

ID1

,

ID2

, og

ID3

i HepG2 og T24 celler behandlet med TGF-β1 med eller uden SW. SW alene nedsatte niveauer af

NTS

,

ID1

,

ID2

, og

ID3

i HepG2-celler og

TGFBR1

,

NTS

,

ID1

, og

ID2

i T24 celler. På den anden side, TGF-β1 signifikant forhøjet mRNA niveauer af disse gener i begge cellelinier (fig. 6C), hvilket bekræfter, at disse gener er nedstrøms for TGF-β1 signalering. Imidlertid flertal af TGF-β1-inducerede stigning i genekspression blev modvirket af samtidig behandling med SW, undtagen

ID1

i HepG2-celler (fig. 6C). Desuden har vi observeret opreguleret proteinniveauer af TGFBR1 i TGF-β1-behandlede HepG2 og T24-celler, der blev vendt ved SW (fig. 6D). For yderligere at bekræfte den inhiberende virkning af SW på TGF-β1 signalering, vi evaluerede effekten af ​​SW på TGF-β1-inducerede migration. Som vist i fig. 7, TGF-β1-fremmet migration blev markant ophævet af SW i HepG2, MDA-MB-231 og T24-celler, mens cellelevedygtigheden var upåvirket af SW (fig. 7A, B og C).

(A ) varmen kort over funktionelle berigelse af differentialy udtrykte gener fra HepG2 chip resultat. Klynge 3.0 og TreeView software blev brugt til at generere varme kort. Rød: opregulering versus betyde; grøn: nedregulering versus betyde. (B) Den regulerende netværk blandt gener relateret til adhæsion, migrering og invasion i (A) ved hjælp af STRING databasen. (C) Real-time RT-PCR verifikation af generne i HepG2 og T24 celler behandlet med TGF-β1 med eller uden SW. Vist var sammensatte resultater af tre uafhængigt eksperimenter med tredobbelt. Kolonner, betyder; barer, SD. (D) Effekt af SW på TGF-β1-inducerede opregulering af TGFBR1 blev vurderet ved immunblotting. Vist var repræsentative resultater fra 3 uafhængige eksperimenter.

HepG2 (A), MDA-MB-231 (B) og T24 (C) -celler blev podet i Transwell skær i nærvær af TGF-β1 plus SW. 12 timer senere blev celler farvet og afbildet. Repræsentative billeder blev vist i det venstre panel. Scale bar, 100 pm. Dataene for migration blev kvantificeret og vist i den midterste panel. Cellen levedygtighed blev afspejlet ved celle sammenløbet sats i højre panel. Vist var sammensatte resultaterne af to uafhængigt eksperimenter med tre eksemplarer. Kolonner, betyder; barer, SD; NS, ikke statistisk signifikant.

Diskussion

SGR, også kendt som Sarsaparilla, blev rapporteret at vise anticancer potentiale [8,21]. Adskillige SGR-holdige plantestoffer formler, der anvendes i Sydøstasien blev vist sig at hæmme kræft

in vitro

in vivo

[20,26]. Hovedparten af ​​tidligere undersøgelser fokuseret på den hæmmende virkning af SGR på cancercellevækst, og kun nogle få evalueret dets virkning på invasivitet af cancerceller. En SGR-holdige plantelægemidler formel blev vist at undertrykke lungecarcinom metastase [27]. Forbindelser isoleret fra SGR, dvs. 5-O-caffeoylshikimic syre, taxifolin og astilbin, viste sig at have inhiberende virkning på adhæsion eller /og migrering af immunceller [22]. I tidligere undersøgelse fandt vi cellevækst hæmning af SGR var en forholdsvis langsigtet effekt ( 24 h) under høje doser [21]. I den foreliggende undersøgelse, vi for første gang, rapporterede den inhiberende virkning af SGR ekstrakt på invasivitet af tre cancerceller, sandsynligvis gennem undertrykkelse af TGF-β1-vejen. Det skal nævnes, at alle de

in vitro

eksperimenter blev udført med lave doser af SW i kort sigt at minimere bias skyldtes SW-induceret væksthæmning.

Focal vedhæftning er den grundlæggende struktur modulenhed af celleadhæsion, kan eventuelle ændringer i struktur eller sammensætning påvirke adhæsionsstyrke af celler på hele [24,25]. Dannelsen af ​​fokal vedhæftning går gennem flere faser, herunder spirende vedhæftning, fokal kompleks og derefter omdrejningspunkt vedhæftning [25]. Størrelsen og modenhed af fokale sammenvoksninger blev rapporteret at være omvendt korreleret med cellemigration hastighed [24]. I den foreliggende undersøgelse, observerede vi en gradvis overgang af adhæsions- patches fra cellen organ til celle perimeter i SW-behandlede HepG2 og T24-celler, med stærkere vinculin signal og større vedhæftning størrelse på cellen cortex. Dette fænomen var, i det mindste delvist, på grund af en plads- og steddirigeret skift af friktion-relaterede proteiner, især i T24-celler. Interessant, SW-induceret store og faste perifere sammenvoksninger lignede omdrejningspunkt vedhæftning kinase (FAK) deficiente celler [25,28]. Derudover celler uden enten tyrosinphosphataser som SHP-2 eller Src kinaser også udviste en lignende vedhæftning mønster [24,29]. Derfor kan en forringelse af FAK-Src pathway mægle denne SW-inducerede effekt, der kræver yderligere undersøgelser.

Chippen Resultatet indikerede en undertrykkelse af TGF-β1 signalering i SW-behandlede celler. Gener herunder

HMOX1

[30,31],

PSAT1

[32],

TGFBR1

[33],

EDNRA

[34,35],

NTS

[36,37],

ID1

[38,39],

ID2

[40,41] og

ID3

[42,43 ], alle relateret til celleadhæsion, migrering og invasion, blev enten direkte eller indirekte reguleret af TGF-β1-signalvejen. Inaktivering af TGFBR1 s kinasedomænet kunne forhindre TGF-β1 signalering fra formeringsmateriale ned [33]. I mellemtiden kunne ophævelsen af ​​TGF-β1 signalering ved hjælp dominant negativ TGFBR blokere epitelial-mesenkymale overgang (EMT) switch

in vivo

[44], tyder på, at undertrykkelse af TGFBR kan give et brugbart middel til at undertrykke TGF-β1 signalering . I den foreliggende undersøgelse blev TGF-β1-inducerede TGFBR1 formindsket med SW. Derudover SW ophævet TGF-β1-inducerede stigning i migrering, hvilket bekræfter den inhiberende virkning af SW på TGF-β1-vejen.

Det skal nævnes, at TGF-β1 signalering fandtes at stige celleadhæsion og fremme fokal adhæsion [45], kan derfor SW-induceret celleadhæsion og fokal adhæsion afhængige distinkte mekanismer. Dette rejser muligheden for, at SW-hæmmede kræftcelle invasiv kunne være de integrerede effekter af flere signalering arrangementer. Andre veje blev også forudsagt at blive påvirket af SW i microarray analyse, såsom metabolisme og oxidativ stress. Nylige undersøgelser fremhæver bidrag dereguleret metabolisme og oxidativ stress til kræftcelle invasiv [46,47]. Hvorvidt SW kunne udnytte disse veje til at regulere cancercelle invasionsevne fortjener yderligere undersøgelse.

Sammen fandt vi SGR kunne fremme celleadhæsion eventuelt ved at forøge størrelsen og styrken af ​​fokale adhæsioner og inhiberer migration og invasion af HepG2, MDA -MB-231 og T24-celler. Undertrykkelse af TGF-β1 signalering delvist bidrager til SW-induceret migrationshæmning. Selv om disse resultater blev opnået fra en delmængde af kræft cellelinjer, kan romanen anticancer funktion af SGR give en mulig molekylære grundlag for den fremtidige kliniske anvendelse i kræftbehandling.

Støtte Information

S1 Fig. Ingen metastatiske foci blev observeret i leveren af ​​mus

Repræsentative billeder af H &. E farves levervæv i PBS og SW-behandlede gruppe. Paraffinindlejrede levere blev snittet ved 30 mm mellemrum og 10 MDA-MB-231 cancerceller blev identificeret som metastatiske foci. Scale bar, 200 mm, forstørrelse, × 10

doi:. 10,1371 /journal.pone.0118287.s001

(TIF)