PLoS ONE: Sorterede MikroRNA’er i urin og blod Fail at validere som Predictive Biomarkører for High-Risk Prostata Cancer

Abstrakt

Formål

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme, om microRNA profilering af urin og plasma ved radikal prostatektomi kan skelne potentielt dødbringende fra indolent prostatacancer.

Materialer og metoder Salg

Et panel af microRNA blev profileret i plasmaet hos 70 patienter og urinen hos 33 patienter indsamlet forud til radikal prostatektomi. Angivelse af microRNA var korreleret til de kliniske endpoints på en opfølgende tid på 3,9 år for at identificere microRNA, der kan forudsige klinisk respons efter radikal prostatektomi. En maskine learning tilgang blev anvendt til at teste den prædiktive evne alle microRNA’er profileret i urin, plasma, og en kombination af begge dele, og den globale præstation vurderet ved hjælp af arealet under receiver operatør karakteristisk kurven (AUC). Validering af urin udtryk for miRNA blev udført på en yderligere uafhængig kohorte af 36 patienter.

Resultater

Den bedste forudsigelse i plasma ved hjælp af otte Mirs gav kun moderat prædiktiv ydeevne (AUC = 0,62). Den bedste indikator for høj risiko for sygdom blev opnået ved hjælp af miR-16, miR-21 og miR-222 målt i urin (AUC = 0,75). Denne kombination af tre microRNA i urin var en bedre indikator for høj risiko for sygdom end nogen individuel microRNA. Ved hjælp af en anden metode fandt vi, at dette sæt af miRNA ikke var i stand til at forudsige høj volumen, høj kvalitet sygdom.

Konklusioner

Vores første resultater antydede, at plasma og urin profilering af microRNA ved radikal prostatektomi kan tillade prognosticering af prostatacancer adfærd. Vi fandt imidlertid, at microRNA udtryk signatur undladt at validere i en uafhængig kohorte af patienter, der anvender en anden platform til PCR. Dette understreger behovet for uafhængige validering patientkohorter og foreslår, at urin microRNA signaturer på radikal prostatektomi ikke kan være en robust måde at forudsige forløbet af klinisk sygdom efter endelig behandling for prostatakræft

Henvisning:. Sapre N, Hong MKH, Macintyre G, Lewis H, Kowalczyk A, Costello AJ et al. (2014) Sorterede MikroRNA’er i urin og blod Fail at validere som Predictive Biomarkører for High-Risk prostatakræft. PLoS ONE 9 (4): e91729. doi: 10,1371 /journal.pone.0091729

Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal

Modtaget: September 24, 2013; Accepteret: 14 februar 2014; Udgivet: April 4, 2014

Copyright: © 2014 Sapre et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. NS er støttet af postgraduate stipendier fra Cancer Råd Victoria, Cybec Foundation og Royal Australasian College of Surgeons. Denne undersøgelse blev støttet af midler fra den australske regering til den australske Prostata Cancer Research Epworth. AK og GM er understøttet af NICTA. NICTA er finansieret af den australske regering som repræsenteret ved Department of bredbånd, kommunikation og den digitale økonomi og Australian Research Council gennem IKT Centre of Excellence-programmet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er kendetegnet ved sine udpræget variable og uforudsigelige resultater. Indførelsen af ​​prostataspecifikt antigen (PSA) kontrol har resulteret i en dramatisk stigning i tidlig påvisning af prostatacancer (CAP) og en scene migration, således at flere mænd med tidlig fase CaP nu bliver diagnosticeret med sygdommen [1], [2 ]. Men testen hverken specifik for CaP [3] heller ikke mulighed for nøjagtig risiko lagdeling og udvælgelse af de patienter, der kan bukke under for deres sygdom efter tidlig radikal terapi [4], [5]. Den morbiditet forbundet med typiske behandlinger har givet anledning til et væld af biomarkør udviklingsstudier i et forsøg på at identificere patienter med størst sandsynlighed vil drage fordel af rettidig indgriben for at reducere deres risiko for recidiv og metastaser [6].

Selvom meget forskning tager sigte på at finde biomarkører, som kan forbedre prostatakræft afsløring satser end PSA, det centrale spørgsmål klinisk, er påvisning af højrisiko-CaP på et tidligt, helbredes stadium. Mens de fleste tilfælde følge en indolent kurs og kræver ikke helbredende behandling, visse kræftformer har potentiale til at metastasere og kræver aggressiv, tidligt, klinisk intervention. nuværende klinisk-patologiske modeller dog ikke tillade klinikere til præcist skelne på et tidligt tidspunkt mellem høj risiko og indolent CaP [7]. Der er et presserende klinisk behov for nye markører, der vil diskriminerer indolent fra aggressive prostatakræft på et tidligt tidspunkt.

MikroRNA’er (miRNA) er cirka 22 nukleotid-lange, enkelt-strengede, ikke-kodende RNA, der binder til komplementære “seed” regioner findes i den 3 ‘utranslaterede region (UTR) af særlig messenger RNA (mRNA) arter. MiRNA modulere udtryk for deres mRNA-mål, enten markere dem til destruktion eller hæmme deres binding til translationel maskiner [8]. MiRNA har vist sig at være involveret i en lang række vigtige fysiologiske og patologiske processer, herunder cellecyklus processer, udvikling, overlevelse, differentiering, vækst, apoptose og immunreaktion [8].

Flere undersøgelser har vist, at deregulering af miRNA er en vigtig mekanisme i prostata carcinogenese [9], og der kan påvises sådanne ændringer i sera Cap patienter [10], [11], [12], [13]. Der er flere fordele ved miRNA som biomarkører i kropsvæsker. Biofluids såsom plasma og urin er mindre invasive at opnå sammenlignet med væv og miRNA ofte dereguleret i cancer og udviser vævsspecifik ekspression. Desuden deres ekspression i blod og urin er stabil og kan kvantificeres følsomt ved kvantitativ realtids polymerasekædereaktion (RT-PCR) [14]. Der har således været meget spænding om potentialet i miRNA som biomarkører for CaP. Men få af disse undersøgelser har udført systematisk validering af disse biomarkører, som har forhindret deres kliniske oversættelse i ledelse af CaP. Derudover har de fleste af disse undersøgelser, der har sammenlignet tidlig CaP til avanceret /metastaserende CaP brugte prøver indsamlet, når patienterne har udviklet metastatisk sygdom. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge, om profilering af et panel af miRNA i plasma og urin fra patienter primære prostatacancer før radikal prostatektomi kan skelne indolent CaP fra højrisiko-fænotype og at validere eventuelle resultater i en uafhængig kohorte af patienter.

Materialer og metoder

etik Statement

Dette projekt havde fuld etik godkendelse fra institutionelle anmeldelse boards. De etiske godkendelser vedrørende dette manuskript er Royal Melbourne Hospital menneskelige Research Ethics Committee (HREC) nr 2006,073 og Epworth Healthcare HREC No. 34506. Alle patienter gav fuld skriftligt samtykke til deres prøver, der skal lagres og bruges til forskning ved hjælp af patientinformation og samtykke formularer som blev godkendt af de etiske komiteer.

MicroRNA panel valg

En systematisk litteraturgennemgang blev gennemført i PubMed at finde microRNA impliceret i prostata og epitelial kræft initiering, progression og metastase ved hjælp af begreberne »prostata kræft “og” microRNA “i juli 2011. citerede referencer af undersøgelser blev kontrolleret for yderligere artikler af interesse. Alle artikler, herunder originale artikler, anmeldelser og abstracts blev overvejet. Baseret på vores gennemgang valgte vi et panel af 12 Mirs til profilering i plasma og 13 Mirs til profilering i urin, som alle havde mindst 2 uafhængige undersøgelser offentliggjort viser engagement i prostatakræft carcinogenese, med præference givet til dem med samtidig støtte mekanistisk data . Desuden indgår vi RNU48 i vores panel som en formodet endogen kontrol [15].

Patient Selection

Alle patienter med diagnosen CaP som gennemgik radikal prostatektomi på Epworth Hospital 2003-2010 med detaljeret PSA opfølgning og komplette kliniske og patologiske data blev identificeret fra et prospektivt registreres og opbevares dedikeret prostatakræft database. Den første gruppe bestod af patienter med fænotype prostata højrisiko-cancer (n = 33 plasmaprøver, 16 urinprøver) og patienter med lav-risiko eller indolent fænotype cancer (n = 37 plasmaprøver, 17 urinprøver). Den anden (validering) kohorte bestod af patienter med fænotype prostata højrisiko-cancer (n = 22 urinprøver) og patienter med indolent fænotype prostatacancer (n = 14 urinprøver). Højrisiko cancer blev defineret som Gleason grad større end eller lig med 7 og tumorvolumen 1ml eller udvikling af metastatisk sygdom eller tidlig biokemisk tilbagefald tyder på systemiske mikro metastaser (kort PSA fordoblingstid kroppen bjærgning strålebehandling, PSA persistens). Indolent cancer blev defineret som Gleason 6, T2a, PSA 10 og PSA overlevelse i mindst 3 år (Epstein kriterier) [16]. Plasma og urin blev indsamlet fra patienter før prostatektomi umiddelbart efter en digital rektal undersøgelse, snap-frosne og opbevares i flydende kvælstof.

Klinisk dataindsamling

Relevante kliniske og patologiske data blev registreret prospektivt og analyseret med tilbagevirkende kraft. Nærmere oplysninger om PSA opfølgning blev registreret prospektivt og ajourføres hvert år. Tumor volumener blev målt nøjagtigt ved computertomografi planimetri på tidspunktet for histologisk vurdering som beskrevet tidligere [17]. Den TNM (2002) klassifikationssystem blev brugt til at iscenesætte prøverne. Den Gleason sum score, og patologisk tumor fase blev alle vurderet separat. For patienter, der ikke oplever en biokemisk tilbagefald i løbet af undersøgelsen periode, opfølgning blev censureret på tidspunktet for deres sidste registrerede PSA-test. For patienter med mere end en enkelt postoperativ PSA registreres, blev PSA fordoblingstid (PSAdt) beregnes ved hjælp af log hældningsmetoden [18]. Til denne undersøgelse blev biokemisk tilbagefald defineret som en postoperativ PSA-værdi større end eller lig med 0,2 ng /ml og stigende, eller en stigende PSA-niveau under denne tærskel, der blev følt af den behandlende læge til at repræsentere en gentagelse og førte til institutionen i salvage terapi. Signifikant biokemisk tilbagefald blev defineret som PSA recidiv med en fordoblingstid 6 måneder, da dette har vist sig at være en mere nøjagtig forudsigelse af udviklingen af ​​metastaser og cancer-dødelighed end PSA recidiv alene [19], [20]. For patienter med primær PSA vedholdenhed, der straks blev behandlet med bjærgning terapi PSAdt blev vilkårligt antages at være 6 måneder. Indsamling og brug af disse oplysninger havde Melbourne Sundhed etiske komité godkendelse.

RNA-ekstraktion

500 pi plasma eller urin blev optøet på is i total RNA-ekstraktion ved hjælp af Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, TX, USA) ifølge producentens protokol med de følgende modifikationer /forhold: 1,5 volumener lysis /Binding Buffer blev anvendt til cellelyse, før tilsætning af homogenatet, og RNA blev elueret i 40 pi vand. RNA elueringer blev nedfrosset på tøris og opbevaret i -80 ° C.

RT-PCR

RNA blev koncentreret fra 40 pi til 15 pi under anvendelse af en Savant SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, NC, USA) ved 45 ° C /højt tryk. Revers transkription blev udført på et termisk cykliseringsapparat (Applied Biosystems, CA, USA) under anvendelse af Taqman microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, CA, USA) ifølge producentens lille RNA assay-protokol med følgende modifikationer: 7 pi RNA blev anvendt som skabelon og samlede primere blev anvendt til de foreløbigt udvalgte 14 miRNA arter.

Original kohorte.

Kvantitativ real-time PCR blev udført med den resulterende cDNA på brugerdefinerede Taqman Low Density Array Cards (Applied Biosystems , CA, USA) indeholdende primere til vores miRNA panel ifølge producentens protokol. Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer og medianen inkluderet i den endelige analyse. TLDA kort blev kørt på en 7900HT Hurtig Real-Time PCR System.

Validering Cohort.

Preamplification af det syntetiserede cDNA blev udført ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt, 2,5 pi cDNA blev sat til 12,5 pi preamplification MasterMix, 3,75 ul primer pool og 6,25 pi nuclease-frit vand. Denne reaktion blev opvarmet til 95 ° C i 10 min, 55 ° C i 2 min, 72 ° C i 2 min efterfulgt af 12 cyklusser af amplifikation før opvarmning til 99 ° C i 10 minutter. De amplificerede reaktionsprodukter blev fortyndet til 200 pi anvendelse af 0,1 × Tris-EDTA-buffer (pH = 8). RT-PCR blev perfomed på VIIa 7 (Applied Biosystems, CA, USA) under anvendelse af 0,5 ul 20 × miRNA assay 0.1 pi forforstærker produkt, 5,0 pi TaqMan Hurtig Universal PCR Master Mix (2⊥), 4,4 pi nuclease-frit vand var kombineres til en 10 ul PCR-reaktion. Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer og medianen inkluderet i den endelige analyse.

Dataanalyse

Pre-behandling.

Tærskler for PCR kørsler blev sat ved hjælp af RQ Manager ( Applied Biosystems) og manuelt kontrolleres for at sikre CT svarede til midtpunktet af den logaritmiske forstærkning. Alle observerede Ct værdier større end 34 blev anset for ikke udtrykt og sat til 34. Eventuelle ubestemte Ct-værdier blev også sat til 34. Som hver miR blev profileret i tre eksemplarer, blev enhver replikere værdi mere end 20% forskellig fra de resterende to værdier betragtes som en afvigende og fjernet fra analysen. Den gennemsnitlige Ct-værdi blev derefter bestemt for hver prøve og miR tværs gentagelser.

Normalisering.

RNU48 blev profileret i hver prøver som en endogen kontrol, men blev anset for uegnede til plasma som i de fleste prøver det ikke blev påvist (figur 1a), vurderet som utilstrækkelige til urin som det var miR med den tredje højeste standardafvigelse (figur 1b), og viste variable udtryk mellem høj-risiko og lav risiko grupper. Derfor geometriske gennemsnit normalisering blev brugt, til en normalisering vist være effektivt i miR PCR profilering [21]

a) Ct-værdier for den endogene kontrol på tværs af alle prøver i plasma kohorte. En CT af 34 anses uopdaget. b) standardafvigelsen af ​​Ct-værdier på tværs af prøver for hver miR i den oprindelige urin kohorte.

Differential udtryk analyse.

Den gennemsnitlige Ct af prøver, der tilhører høj risiko og lav -risk grupper blev anvendt til at beregne ΔΔCt. Fold-ændring blev beregnet som 2

-ΔΔCt. En studerende t-test blev anvendt til at beregne betydningen af ​​forskellen mellem høj og lav risikogrupper og p-værdi blev justeret for multipel testning korrektion ved hjælp af Benjamini-Hochberg metoden [22]

Feature udvælgelse og classifiaction .

Vi antager data er givet som en matrix, N funktioner (Mirs) for

M

prøver iE og med etiketten vektor arrangeret på en sådan måde, at for og for de resterende prøver. Vi har brugt to forskellige metoder til udvælgelse /bestilling af funktioner /Mirs fra de fleste til mindst “diskriminerende”. Den første metode var den klassiske t-test, der er afsat til

jeg

th funktionen scorewheredenote midlerne anddenote varianserne af

jeg

th variabel for prøver af den både grupper af interesse henholdsvis. Så funktionerne er rangeret i den prioriterede rækkefølge, absolutte værdier af statistikken, for. Den anden teknik, opkaldt

det geometriske tyngdepunkt funktionen udvælgelse

, rangerer den funktion i den prioriterede rækkefølge af størrelsen af ​​forskellen mellem hjælp af

jeg

th variabel for prøver af begge grupper af interesse.

af forskellige delmængder af

t

øverste funktioner, vi genereret lineær classifiersfor en prøve efter en support vektormaskine algoritme, hvor udvalgte vægte

w

k

og skæringspunktet

b

ved at minimere den følgende funktionelle: Her

C

er justerbar legalisering konstant, med en relativt svag indvirkning på det endelige resultat i vores tilfælde. Resultaterne rapporteres har brugt

C

= 1.

Resultater

demografi og klinisk-patologiske karakteristika for patienter med lav risiko og høj risiko i kohorte 1 (discovery kohorte) i plasma og urin profilering arme er skitseret i tabel 1.

microRNA profilering af plasma

de fleste af miRNA var på påviselige koncentrationer i plasma hos patienter med høj risiko prostata kræft og prostatakræft lav risiko (figur 2). Tre prøver viste overordnede lave afsløring satser og blev fjernet fra efterfølgende analyse. Unsupervised klyngedannelse blev anvendt på prøver på tværs af de 12 Mirs profileret i plasma for at afgøre, om der var adskillelse mellem høj-risiko og lav risiko grupper. Der syntes at være nogen tilsyneladende adskillelse mellem høj og lav risiko grupper. Vi anvendte en funktion udvælgelsesprocedure og testet udførelsen af ​​de 12 Mirs for deres evne til at afgrænse prostatakræft høj risiko fra prostatakræft lav risiko. Tabel 2 viser resultaterne fra vores funktion udvælgelsesprocedure. Brug både t-test og tyngdepunkt funktion udvælgelsesprocedure blev miR16 valgt som den mest prædiktive træk, dog viste rangeringen ustabile resultater på tværs af alle de Mirs. Figur 3, viser en ROC-kurve for miR16, viser, at miR generelt har en ganske dårlige resultater med et areal under kurven for 0,62. Mens prædiktiv, besluttede vi denne præstation ikke var tilstrækkeligt til at berettige yderligere validering.

Prøverne er blevet udsat for ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse, og resultaterne er afbildet af dendrogram øverst i billedet.

mIR-16 ikke præcist forudsige sandsynligheden for at udvikle høj risiko for sygdom ved radikal prostatektomi (AUC = 0,62).

microRNA profilering af urin

Discovery kohorte.

screening urin, udviste alle prøver et påviseligt niveau af ekspression for de valgte Mirs (figur 4). Unsupervised gruppering af prøverne på tværs af alle Mirs viste en moderat adskillelse af lav risiko og høj risiko prøver (figur 4). Mirs 16, 20a, 21, 34a, 145, 106b, 182, 205, 221, 222, 331 og 375 blev påvist på højere niveauer i højrisikogruppen, mens miR 218 blev påvist på lavere niveauer i urinen med høj risiko prostatacancer. Af disse Mirs alle, men miR 218 var signifikant forskellig mellem de høje og lave risikogrupper (q-værdi 0,1) som vist i tabel 3. fold ændring for de miRNA, som i væsentlig grad blev opreguleres varierede fra 2,17 (miR 145) til 8,09 (mIR 222) som vist i tabel 3. for at bestemme den minimale sæt af Mirs som viste den bedste adskillelse af høje og lave risikogrupper, anvendte vi en funktion udvælgelsesprocedure hvis resultater kan ses i tabel 4. Både t- procedure test funktionen udvælgelse og det geometriske tyngdepunkt procedure valgte miR16 og Mir222 som de mest prædiktive funktioner. Udover dette placeringen af ​​miR præstation var ustabil. Vi valgte derfor Mir222 og miR16 til validering. Derudover valgte vi også miR21. Selv om det ikke rangerer højt om proceduren funktionen til valg af, valgte vi det som en funktion, der sandsynligvis ville være uafhængige af Mir222 og miR16, som den mindst korreleret miR inden for klyngen som indeholder Mir222 og miR16 (figur 4). Vi testede udførelsen af ​​alle kombinationer af de 3 Mirs og alle tre kombineret viste den bedste ydeevne af AUC = 0,75 (figur 5). Vi anså denne præstation tilstrækkelig til yderligere opfølgning og søgte en validering kohorte.

Prøverne er blevet udsat for ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse og resultaterne er vist ved dendrogram i toppen af ​​billedet.

miR 16, miR 222 og miR 21 forudsige prostatakræft høj risiko med et AUC på 0,75. Vejviser

Validering kohorte.

De demografi og klinisk-patologiske karakteristika for patienter med lav risiko og høj risiko i kohorte 2 (validering kohorten) er skitseret i tabel 5. validering blev kun foretaget for urin udtryk som klassificeringen for plasma udtryk for miRNA gav kun moderat ydeevne.

Vi valgte miR 16, 21 og 222 til validering i en uafhængig kohorte af lav risiko og høj risiko prostatakræft. Vi valgte en anden fremgangsmåde til profilering af miRNA i valideringen kohorte at teste for robusthed, som beskrevet i fremgangsmåderne. For at teste for ensartet registrering på tværs af de to platforme, vi profileret prøverne fra den oprindelige kohorte på den nye platform og observerede korrelationen af ​​Ct-værdier mellem platformene for de tre Mirs. Alle tre Mirs viste høj korrelation mellem platforme (figur 6) tyder på, at påvisning af disse Mirs var robust. Deres præstation som prædiktorer for høj risiko for sygdom var også sammenlignelige på tværs af platforme (figur 7, AUC = 0,72). som vist i tabel 6, i valideringen kohorte, vi fandt imidlertid, at de tre miRNA overraskende blev fundet ved lavere niveauer i højrisikogruppen, sammenlignet med gruppen med lav risiko: miR 16 (FC = 0,07, q = 0,08 ), miR 21 (FC = 0,14, q = 0,10) og miR 222 (FC = 0,14, p = 0,10). Når klassificeringen bygget på den oprindelige kohorte ved hjælp af de tre Mirs blev brugt på validering kohorte, opnåede vi en opførelse af AUC = 0,35 (figur 7).

R

2 værdier repræsenterer Pearson korrelation.

Prostata kræftpatienter fra den oprindelige kohorte (blå). Prostata cancer patienter fra valideringen kohorte (rød).

Evaluering af metoden af ​​miRNA profilering.

For at vurdere, om denne ændring i udtryk mønster af miRNA skyldtes metodologisk forskel, vi profileret for de tre miRNA med begge metoder på den oprindelige opdagelse kohorte. Vi fandt, at bruge begge metoder blev alle tre miRNA opdages på højere niveauer i højrisikogruppen i den oprindelige opdagelse kohorte. Sammenligning af ekspressionen af ​​disse tre miRNA med begge metoder på den oprindelige kohorte viste god korrelation (korrelationskoefficient R

2 = 0,96 (miR 16), R

2 = 0,91 (miR 222) og R

2 = 0,86 (miR 21)), der bekræfter, at den observerede forskel skyldes en biologisk variation snarere end metodisk variation.

diskussion

Forudsigelse højrisiko CaP fortsat en udfordring, og det understøtter vores nuværende overbehandling af biologisk ubetydelige cancere. For enhver biomarkør med held oversat til den kliniske arena, skal den kunne modstå tilstrækkelig validering i selvstændige grupper af patienter og demonstrere metodiske robusthed. I denne undersøgelse har vi fremhævet vigtigheden af ​​validering af resultater i et selvstændigt kohorte hjælp alternative metodiske platforme. I den oprindelige kohorte, fandt vi, at miR 16, 222 og 21, blev opreguleret i prostatakræft høj risiko i forhold til lav-risiko kræft og urin profilering af miR 16, miR 222 og miR 21, var i stand til at skelne mellem de kræftformer, der kan have en indolent kursus fra de biologisk signifikante kræftformer efter radikal prostatektomi. Imidlertid fandtes disse samme miRNA skal detekteres ved lavere niveauer i en uafhængig kohorte af prostatakræft i højrisikogruppen sammenlignet med lav risiko kræftformer. Dette er i modsætning til resultaterne fra den oprindelige kohorte. Således profilering for disse miRNA i plasma eller urin, i vores undersøgelse, ikke håndfast skelne mellem lav risiko og høj risiko CaP.

I betragtning af at miRNA profilering med begge disse distinkte metoder på den oprindelige opdagelse kohorten gav lignende resultater, det er mest sandsynligt at repræsentere ægte biologisk variation snarere end en forskel på grund af metodologiske variation. De TLDA kort er en forholdsvis ny platform til at udføre PCR, der ikke er udsat for intens validering, men er blevet brugt af mange grupper tidligere til kvantificering af genekspression [23], [24], [25]. Profilering af miR 16, 21 og 222 på prøverne i den oprindelige kohorte anvendelse af de to forskellige metoder viste, at resultaterne korrelerede godt. Dette bekræftede, at den eksperimentelle metode var robust og resultaterne indikerer en sand biologisk variation i ekspressionen af ​​disse miRNA i de to uafhængige grupper.

Analysen af ​​urin som en diagnostisk eller prognostisk værktøj er ikke uden fortilfælde. Niveauer af protein, mRNA, miRNA og endda gen-methylering i urin er blevet korreleret med kræft tilstedeværelse og aggression i tidligere undersøgelser [26], [27], [28], [29], [30]. Desuden har andre fundet urin at være en bedre kilde til prostata materiale end plasma [28]. Metoden af ​​disse cellulære stoffer nå urinen er sandsynligt via transport af kræftceller gennem prostata gangsystemet [30] eller exosomal vej [27].

Mange tidligere undersøgelser har studeret reguleringen af ​​miRNA arter i prostata cancer væv i forhold til benign prostata, high-grade primære i forhold til lav kvalitet, eller metastatisk forhold til primær kræft [31], [32], [33]. Derudover har mange af de involverede i prostatakræft initiering, progression og metastase miRNA er blevet funktionelt karakteriseret [34], [35]. Nylige arbejde også profilerede miRNA arter, der findes at være opreguleret eller nedreguleret i plasma eller serum af patienter med prostatacancer [10], [11], [12], [13], [36], [37]. Disse undersøgelser har vist, at specifikke miRNA kan være nyttige for en ikke-invasiv prognostisk test, men kun under anvendelse af plasma eller serum. Kun få studier har profileret for miRNA i urin fra patienter med prostatakræft. De har fundet, at adskillige cirkulerende miRNA differentielt udtrykt i prostatacancer [10], [11], [12], [13], [36], [37], [38]. Nogle har fundet, at miR 26a, 30c og ​​lad 7 udtrykkes forskelligt i plasma eller serum fra patienter med prostatacancer sammenlignet med dem med godartet prostatahyperplasi (BPH) [12], [36]. Andre har sammenlignet patienter med lav risiko for prostatakræft høj risiko og på tværs af forskellige undersøgelser miR-141, mir-375, mir-221, MIR-21 og MIR-145 har vist sig at være forhøjet hos patienter med høj risiko eller metastatisk prostatacancer [10], [11], [37], [38]. Mens miR 222 ikke har vist sig at være væsentligt prædiktiv for høj risiko for sygdom i tidligere undersøgelser [39], er miR 21 vist sig at være forhøjet i mere aggressiv prostatakræft i nogle undersøgelser [11], [37]. Shen et al fandt, at miR 21 niveauer korreleret med kræft i prostata Risikovurdering (Capra) scores [11], og Agaoglu og kolleger fandt, at miR 21 niveauer var forhøjet hos patienter med metastatisk tumorer i forhold til dem med lokaliseret sygdom [37]. Ligeledes miR 221 har vist sig at være forhøjet i begge disse undersøgelser, men miR 221 blev ikke konsekvent forhøjet i højrisiko tumorer i vores kohorte.

Disse undersøgelser har gentagne gange givet forskellige miRNA signaturer til at risikere stratificere prostatakræft grund varierende eksperimentel metode, manglende robusthed statistisk analyse og ikke-standardiserede definitioner af høj risiko eller prostatakræft lav risiko. Vi har forsøgt at løse nogle af disse problemer ved hjælp af robuste statistiske metoder til analyse af resultater samt ved hjælp af standardiserede definitioner af indolent (Epstein kriterier) og høj-risiko for sygdom. De fleste af de tidligere undersøgelser har ikke inkluderet validering af betydelige miRNA og dermed de mangler evnen til at påvise reproducerbarhed af data [11], [12], [13], [36], [37].

et andet punkt, der skal fremhæves, er, at prøverne i andre undersøgelser udført hidtil blev taget fra patienterne, når de havde udviklet metastatisk sygdom. Mens dette giver indsigt i biologi tumorprogression, betyder det ikke tillader risikoen lagdeling af patienterne, når de stadig har lokaliseret sygdom, og som sådan ikke har en umiddelbar klinisk implikation. Vores undersøgelse er ny i at alle plasma og urinprøver blev indsamlet før radikal prostatektomi og dermed på tidspunktet risikoen lagdeling, udvælgelse til behandling og prognosticering af patienter er altafgørende.

Andre tests kommercielt tilgængelige for risiko lagdeling af prostatakræft er PCA3 og PHI testen. PCA3-test, som er en urin-baseret mRNA test, er mere specifik for prostatacancer end PSA-testen [30], [40]. Det har vist sig at være nyttige i vejlede beslutninger for prostatabiopsi baseret på en kumulativ score beregnes ved at måle ekspressionen af ​​prostatacancer gen mRNA. For nylig har det vist sig at være prædiktiv for “væsentlig” prostatakræft, som der var en signifikant forskel i PCA3 snesevis af patienter, der opfyldte Epstein kriterier for indolente kræftformer [41] og “væsentlig” kræft, der blev anset passende for radikal prostatektomi. PHI test, som måler en anden isoform af PSA, den [-2] pro-PSA, har vist sig at være nyttig til at forudsige prostatacancer med Gleason score≥7 hos patienter med PSA på 2-10 ng /ml er dog ikke forbundet med prostatavolumen [42]. Men ingen af ​​disse tests med til at bestemme de mennesker, der kan udvikle metastatisk sygdom efter radikal prostatektomi.

Der er nogle begrænsninger af denne undersøgelse, der skal angives. Med ingen accepterede biologisk kontrol for miRNA i kropsvæsker, har vi ikke normaliseret vores resultater til en ‘hus-holder “gen. Adskillige endogene kontroller anvendes i væv profileringsstudier. når vi brugte RNU48 som en endogen kontrol Vi fandt imidlertid, at dens udtryk ikke var i overensstemmelse i lav risiko og højrisikogrupper. Med sådan en systematisk forstyrrelse i sit udtryk, det var uegnet som en endogen kontrol. Med tiden, da miRNA er undersøgt yderligere i kropsvæsker, kan visse biologiske kontroller dukke. Dernæst urin er en dynamisk kropsvæske og koncentrationer kan ændre sig med hydrering status og renal patologi. I vores undersøgelse blev alle urinprøver indsamlet umiddelbart inden radikal prostatektomi dermed er der sandsynligvis vil være en høj grad af ensartethed i urin sammensætninger. Måling urinvolumener 24-timers ville være den gyldne standard til at vurdere hydrering status, men dette er besværlig, dyrt og fyldt med lave driftsomkostninger satser i kliniske omgivelser. Måling kreatinin nøgletal eller vægtfylde forbliver andre muligheder og potentielt mere gennemførlige alternativer. Endelig vores stikprøve er lille.

For at konkludere, her har vi vist plasma og urin profilering af miRNA kan ikke være en robust markør for prognosticering af prostatakræft aggression og høj risiko for sygdom. Denne undersøgelse understreger betydningen af ​​at indarbejde validering kohorter og metodisk robusthed for at sikre reproducerbarhed af data i alle fremtidige biomarkører studier.