PLoS ONE: Rekombinant lipideret HPV E7 inducerer en Th-1-Biased immunrespons og beskyttende immunitet mod livmoderhalskræft i en musemodel

Abstrakt

E7 oncoproteinet af humant papillomvirus (HPV) er et ideelt mål for at udvikle immunterapeutiske strategier mod HPV-associerede tumorer. Men fordi proteinbaserede immunogener alene er dårlige elicitorer af cytotoksisk T-lymfocyt (CTL) reaktioner, de har været vanskelige at udnytte til terapeutiske formål. I denne undersøgelse rapporterer vi, at en rekombinant lipoprotein bestående af inaktiv E7 (E7m) biologisk forbundet til en bakteriel lipiddel (rLiPO-E7m) inducerer modningen af ​​muse knoglemarv-afledte dendritiske celler gennem toll-like receptor 2 (TLR2), forvrænger de immunresponser mod de Th1-reaktioner og fremkalder E7-specifikke CTL-reaktioner. Vi undersøges nærmere evne rLiPO-E7m at yde beskyttelse mod en TC-1 tumorceller udfordring i en dyremodel. Mus profylaktisk immuniseret med to 10-ug doser af rLiPO-E7m viste sig at være fri for TC-1 tumorvækst. Forsøg i en terapeutisk immunisering model viste, at tumorvolumen i mus, der fik en enkelt dosis rLiPO-E7m var mindre end 0,01 cm

3 på dag 40, hvorimod tumorvolumen i mus behandlet med rE7m var 2,28 ± 1,21 cm

3. Tumorvolumen af ​​hele kontrolgruppen var over 3 cm

3. Derudover demonstrerede vi, at CD8 + T-celler spiller en vigtig rolle i anti-tumor-immunitet, når administration af rLiPO-E7m. Disse resultater viser, at rLiPO-E7m kunne være en lovende kandidat til behandling af HPV-associerede tumorer

Henvisning:. Huang C-Y, Chen JJW, Shen K-Y, Chang L-S, Yeh Y-C, Chen I-H, et al. (2012) Rekombinant lipideret HPV E7 inducerer en Th-1-Biased immunrespons og beskyttende immunitet mod livmoderhalskræft i en musemodel. PLoS ONE 7 (7): e40970. doi: 10,1371 /journal.pone.0040970

Redaktør: Silke Appel, Universitetet i Bergen, Norge

Modtaget: November 23, 2011; Accepteret: 18 juni 2012; Udgivet: 18 Juli 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en Research Investigator Award fra National Health Research Institutes (VC-098-PP-04 til S-JL) og (VC-098-PP-06 til C-HL). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion Salg

human papillomavirus (HPV) infektioner kan forklare udviklingen af ​​flere kræftformer; i særdeleshed, kan HPV-infektion forårsager livmoderhalskræft. Livmoderhalskræft er den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald hos kvinder på verdensplan [1]. Derfor er et presserende behov for nye behandlingsformer til at styre livmoderhalskræft dødelighed af kræft. Til dato har HPV E6- og E7 oncoproteiner blevet identificeret som de vigtigste mål for udviklingen af ​​terapeutiske vacciner mod HPV-associerede tumorer. Som intracellulære (nukleare) proteiner, E6- og E7-genprodukter kan være skjult fra det humorale immunrespons. Opmærksomheden har således fokuseret på frembringelsen af ​​en vaccine, der kan inducere eller stimulere et cellulært immunrespons på HPV E6- og E7 oncoproteiner [2]. Der er taget adskillige metoder til at udvikle HPV terapeutiske vacciner, herunder levende vektorfrie, peptid /protein-, nukleinsyre syre- og hele cellebaserede tilgange. Disse studier har vist betydningen af ​​T-celle-reaktioner i at beskytte mod tumorer i humane og dyremodeller [3]. Af disse tilgange, syntetisk peptid og protein-baserede metoder er de mest attraktive kandidater; Men generelt, peptid og protein alene er ikke-immunogene. Uden yderligere adjuvans, er det vanskeligt at inducere stærke, effektive immunresponser kendetegnet ved produktion af Th1 cytokiner og virale oncoprotein-specifikke cytotoksiske T-lymfocytter (CTL’er) [3].

TLR agonister er naturligt immunstimulerende inducere af medfødte immunitet. TLR2 udtrykkes på mange forskellige celletyper, herunder dendritiske celler, makrofager og lymfocytter. Derfor er TLR2 agonister, såsom bakterielle lipoproteiner lovende kandidater til anvendelse som en ny generation adjuvans til immunterapi.

Vi har for nylig etableret en platform for produktion med højt udbytte af rekombinante lipoproteiner [4]. Lipiddelen af ​​lipo-immunogenet er identisk med den for bakterielle lipoproteiner, der er anerkendt som faresignaler af immunsystemet. Således kan både medfødte og adaptive immunrespons induceres af lipoproteiner [5], [6]. Lipid struktur af det rekombinante lipoprotein er forskellig fra den af ​​syntetisk tri-acyleret lipopeptid [7]. Denne sondring gør rekombinant lipoprotein fremkaldte forskellige immunresponser fra syntetisk lipopeptid ved at inducere forskellige biologiske cytokiner og chemokiner [8]. Vi har tidligere vist, at virusneutraliserende antistofresponser fremkaldt af lipid form af et immunogen var stærkere end dem fremkaldt med en ikke-lipid form af et immunogen [4], [9]. I denne rapport, viser vi, at vanskelighederne ved at bruge proteiner alene at fremkalde CTL-reaktioner kunne overvindes ved hjælp af lipo-immunogen strategi. En lipid form af E7 mutant (rLiPO-E7m) og en ikke-lipid form af rE7m fra HPV type 16 (HPV 16) blev fremstillet, og evnen af ​​disse immunogener til at aktivere muse knoglemarvafledte DC’er (BM-DC’er) blev vurderes. De immunresponser af B og T-celler blev også undersøgt. Endelig vi undersøgt, om de immunrespons hos rLiPO-E7m var i stand til at beskytte mus mod tumor udfordring. Disse undersøgelser ikke kun give oplysninger om rLiPO-E7m som en lovende tilgang til udviklingen af ​​en terapeutisk vaccine mod HPV-associerede tumorer, men også fremlægge en strategi for udviklingen af ​​succesfulde immunterapier bruge protein-baserede kandidater.

Resultater

Produktion af rekombinant Immunogener

det rekombinante E7m (rE7m), som blev manipuleret til at indeholde en hexahistidin tag (HisTag) ved sin C-terminus, blev fremstillet for at sammenligne virkningerne af rE7m til lipideret mål. rE7m blev oprenset under anvendelse af immobiliseret metal-affinitetskromatografi (IMAC) søjle (figur 1b, bane 1-4). rE7m blev påvist med anti-HisTag antistoffer (figur 1b, bane 5-8). Vi har tidligere identificeret en fusion sekvens (D1), som kan være fusioneret med en ikke-lipideret immunogen for at opnå høje ekspressionsniveauer af det rekombinante lipo-immunogen [4]. Under anvendelse af denne strategi blev E7m genet fusioneret til D1 på N-terminus og manipuleret et HisTag i sin C-terminale ende. Dette rekombinante lipiderede E7m (rLiPO-E7m) blev oprenset ved anvendelse IMAC-søjle (figur 1b, bane 9-11). rLiPO-E7m blev påvist med anti-HisTag antistoffer (figur 1b, bane 12-14). Efter lipopolysaccharid (LPS) blev fjernet (mindre end 0,003 EU /ug), renset rLiPO-E7m og rE7m var forholdsvis analyseret for deres immunogenicitet og effekt i dyremodeller.

(a) Tilpasningen af ​​aminosyren sekvens af vildtype HPV16 E7 (Accessionsnummer: NP_041326) og inaktive E7 (E7m). Hver mutant site af E7m er fremhævet. DNA-sekvensen af ​​E7m genet blev afledt ved anvendelse af kodonanvendelse af

E. coli

og fuldt syntetiseret under anvendelse samlingen PCR-fremgangsmåden. PCR-produktet blev klonet ind i pET22b vektor til rE7m ekspression og ind i modificerede pET22b vektor med et lipid signalpeptid for rLiPO-E7m ekspression. De rekombinante proteiner indeholdt et yderligere HHHHHH sekvens (HisTag) ved C-terminus og blev udtrykt under kontrol af T7-promotoren. (B) rLiPO-E7m og rE7m proteinoprensningsproces blev overvåget under anvendelse af 15% reducerende SDS-PAGE efterfulgt farvet med Coomassie Blue-farvning og immunblotting under anvendelse af anti-HisTag antistoffer. Det rekombinante rLiPO-E7m blev udtrykt i

E. coli

stammerne C43 (DE3). Bane 1, rE7m ekspression efter IPTG-induktion; bane 2, proteinekspression i fravær af IPTG-induktion; bane 3, ekstraheret del af rE7m; bane 4, oprenset rekombinant rE7m. Bane 5-8 viser immunoblotting at overvåge rE7m oprensningsprocessen, og prøverne i disse baner er de samme som dem i banerne henholdsvis 1-4. Bane 9, rLiPO-E7m ekspression efter IPTG-induktion; bane 10, proteinekspression i fravær af IPTG-induktion; bane 11, oprenset rLiPO-E7m. Baner 12-14 viser immunblotting at overvåge rLiPO-E7m oprensningsfremgangsmåden, og prøverne i disse baner er de samme som dem i bane 9-11, hhv. Den ikke-lipideret form af rE7m blev udtrykt i

E. coli

BL21 (DE3) stjerne stamme. Pilene angiver de elektroforetiske positioner af rE7m eller rLiPO-E7m i geler eller blots. (C) Intakt rLiPO-E7m blev analyseret ved LC /MS. LC /MS-analyse afslørede tilstedeværelsen af ​​fem store post-translationelle modifikationer af rLiPO-E7m. Molekylmasser (i dalton) blev bestemt ved anvendelse af en maksimal entropi algoritme. De fem store toppe viste masser af 15384,5, 15400, 15412,5, 15426 og 15439. (d) N-terminale rLiPO-E7m fragmenter blev opnået og identificeret efter fordøjelse af rLiPO-E7m med trypsin. Det fordøjede prøve blev analyseret på en Waters® MALDI micro MX ™ massespektrometer. Den MALDI-TOF MS spektre afsløret eksistensen af ​​fem toppe med m /z-værdier på 1452, 1466 og 1480, 1492 og 1506.

Identifikation og karakterisering af renset Immunogener

rLiPO-E7m og rE7m blev fordøjet med trypsin for at vurdere deres peptidmassefingeraftryk (PMF). Resultaterne bekræftede, at de store toppe i massespektre blev afledt fra rLiPO-E7m og rE7m (data ikke vist). For at identificere lipiddelen af ​​rLiPO-E7m blev direkte infusion prøve ESI-MS af intakt rLiPO-E7m udført på en Q-TOF instrument. Efter behandling af dataene, fem store toppe med masser af 15384,5, blev 15400, 15412,5, 15426, og 15439 Da identificeret (figur 1c). Baseret på vores tidligere undersøgelser, vi betragtede eksistensen af ​​disse store toppe som undertegnelsen af ​​lipid modifikationer af lipoproteiner [4], [7].

Vi målte derefter den nøjagtige masse af N-terminale fragmenter af rLiPO -E7m. Fem toppe med m /z-værdier på 1452, 1466, 1480, 1492, og 1506 blev identificeret (figur 1d). Oprensning af de typtic lipo-fragmenter til masse-analyse afslørede yderligere to toppe, der ikke tidligere er blevet identificeret. For at verificere, at lipid modifikation af hver top er i den N-terminale cysteinylrest, blev N-terminale fragmenter af rLiPO-E7m underkastet MALDI-TOF-TOF analyse for at bestemme sekvensen af ​​hver top. Sekvenserne af disse fem toppe var de samme, og den identificerede sekvens fra y5 til y1 var “sqeak” (data ikke vist). Vi bekræftede, at toppene af rLiPO-E7m var forbundet med den lipiderede cysteinrest, og kontrolleret, at rLiPO-E7m indeholder en bakteriel lipid-del på dens N-terminal.

rLiPO-E7m Aktiverer knoglemarv-afledte dendritiske celler Gennem TLR2

for at vurdere funktionen af ​​rLiPO-E7m, vi først undersøgte lymfocyt proliferation reaktion på de rekombinante immunogener og styre agonister. LPS (a TLR4 agonist) og det syntetiske lipopeptid palmitoyl-3-Cys-Ser- (Lys) 4 (Pam3, en TLR2 agonist) inducerede proliferation af splenocytter på en dosis-afhængig måde. rLiPO-E7m viste sig at stimulere splenocytterne ved koncentrationer på 10 nM og 100 nM [rLiPO-E7m aggregeret ved 1000 nM i phosphatbufret saltvand (PBS)]. I modsætning hertil rE7m inducerede ikke splenocytproliferation. Disse resultater viser, at lipid-delen af ​​rLiPO-E7m er i stand til at aktivere immunceller (figur 2A).

(a) Splenocytter blev isoleret fra vildtypemus og udpladet med en tæthed på 2 x 10

5 celler /brønd i plader med 96 brønde. Cellerne blev inkuberet med forskellige koncentrationer af LPS (0-1000 pg /ml), Pam3 (0-1000 pg /ml), rLiPO-E7m (0-100 pg /ml) eller rE7m (0-1000 pg /ml) for 48 timer. Under de sidste 24 timer, 1 pCi af [

3H] -thymidin blev tilsat til hver brønd for at måle DNA-syntese. Dataene er vist som middelværdien ± SD af tredobbelte prøver. (B) BM-DC’er fra vildtypemus blev dyrket i medium suppleret med LPS (0,01 ug /ml), rE7m (10 ug /ml) eller rLiPO-D1E3 (10 ug /ml) i nærvær eller fravær af polymyxin B (20 ug /ml). Efter en 24-timers inkubation blev ekspressionen af ​​den dendritiske celleoverflademarkører CD40 og CD86 analyseret under anvendelse af flowcytometri. Eksperimenter blev udført tre gange og den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) på celler dyrket i medium alene blev defineret som 100%. (C) Ved cytokinsekretion undersøgelser, BM-DC’er blev dyrket i medium suppleret med LPS (0,01 ug /ml), Pam3 (0,15 ug /ml), rE7m (0,1-10 ug /ml) eller rLiPO-E7m (0,1- 10 ug /ml) i nærvær eller fravær af polymyxin B (20 pg /ml). Efter en 24-timers inkubation blev supernatanterne høstet og analyseret for TNF-α og IL-12 (p40) produktion ved ELISA. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. (D) BM-DC’er fra vildtype, TLR1-knockout (TLR1-KO), TLR2-KO eller TLR6-KO-mus blev dyrket enten i alene eller i medium suppleret med LPS (0,01 ug /ml), Pam3 medium (0,15 ug /ml), rE7m (10 ug /ml), eller rLiPO-E7m (10 ug /ml). Efter en 24-timers inkubation blev supernatanterne høstet og analyseret for TNF-α-produktion ved ELISA. Dataene er vist som middelværdien ± SD af tredobbelte prøver.

Vi derefter brugt BM-DC’er som model til at studere de immunstimulerende egenskaber af rLiPO-E7m. Polymyxin B blev sat til at overvåge interferens forårsaget af resterende LPS i funktionel analyse. rLiPO-E7m opreguleret ekspressionen af ​​overflademarkører, såsom CD40 og CD86 på BM-DC’er, hvorimod rE7m havde nogen virkning (figur 2b). Lignende resultater blev opnået i cytokinsekretion undersøgelser. Udskillelsen af ​​TNF-αand IL-12p40 blev induceret ved rLiPO-E7m men ikke af rE7m gruppe (figur 2c). Polymyxin B hæmmede LPS-medieret stimulering af BM-DCs, men det havde ingen signifikant effekt på stimulerende egenskaber af rLiPO-E7m. Disse resultater viser, at aktiveringen af ​​BM-DC’er ved rLiPO-E7m ikke skyldtes resterende LPS og at immunstimulerende aktivitet af rLiPO-E7m blev knyttet til dets lipid-del.

Fordi lipid struktur rLiPO -E7m er en agonist for TLR1 /TLR2 og /eller TLR2 /TLR6, den næste undersøgt, hvilke af disse TLR’er er afgørende for immunstimulerende aktivitet af rLiPO-E7m. For at løse dette spørgsmål, BM-DCs fra vild-skrevet, blev TLR1-, TLR2- og TLR6-knockout (KO) mus anvendes. rLiPO-E7m og Pam3 induceret TNF-α-sekretion i BM-DC’er fra TLR1-KO og TLR6-KO-mus, men undlod at stimulere BM-DC’er fra TLR2-KO-mus, hvilket indikerer, at TLR2 er nødvendig for immunstimulerende aktivitet af rlipo- E7m (figur 2d). Disse data viser, at immunogenet fusioneret med bakteriel lipiddel aktiveret modningen af ​​BM-DC’er gennem TLR2.

Immunisering med rLiPO-E7m Forhøjer antigenspecifikke antistoffer og genererer en Th1-forspændt respons

for at evaluere de iboende adjuvansegenskaber af rLiPO-E7m

i

vivo

analyserede vi størrelsen af ​​antigen-specifik antistofrespons i mus immuniseret med enten rE7m eller rLiPO-E7m (figur 3a) . Antistoftitrene fremkaldt af rLiPO-E7m var 100 gange højere end dem fremkaldt af rE7m i uge 4, 6 og 8. Efterfølgende analysere antistofisotyperne fremkaldt ved immunisering med rE7m eller rLiPO-E7m, de inducerede niveauer af IgG1 og IgG2b blev målt. De IgG1 niveauer var sammenlignelige i både rE7m- og rLiPO-E7m-immuniserede mus; imidlertid IgG2b niveauer i rLiPO-E7m-immunzed mus var højere end i rE7m-immuniserede mus (figur 3b). Dette fænomen kan tydeligt ses ved at sammenligne de IgG2b /IgG1-forhold i disse mus (figur 3b, insert).

(a) C57BL /6-mus (n = 5) blev immuniseret to gange ved subkutan injektion af 30 ug af rE7m i PBS eller 30 ug rLiPO-E7m i PBS ved to-ugers intervaller. Sera blev opsamlet, og IgG eller (b) IgG2b /lgG1 responser mod rE7m blev evalueret ved hjælp af ELISA. De IgG2b /IgG1-forhold i begge grupper er vist i indsatsen. (C) Mus blev injiceret subkutant på 30 ug rE7m eller rlipoE7m to gange med to ugers intervaller. Syv dage efter den anden immunisering blev splenocytter isoleret og stimuleret med rE7m (10 ug /ml) i 4-5 dage. Supernatanterne blev opsamlet, og niveauerne af IFN-γor IL-5 blev målt ved ELISA. Data er udtrykt som middel + SD af prøver (n = 5).

Desuden undersøgte vi sekretionen af ​​INF-γ og IL-5 i splenocytter fra mus immuniseret med rE7m eller rLiPO-E7m. Niveauet af INF-γinduced upon rLiPO-E7m immunisering var 4 gange højere end den induceret ved rE7m immunisering (figur 3c); imidlertid rE7m immunisering inducerede en 7 gange højere sekretion af IL-5 ved splenocytter end gjorde det rLiPO-E7m immunisering (figur 3c). Tilsammen resultaterne af T-cellen og B celleassays tyder på, at fusionere et immunogen til en bakteriel lipidenhed resulterer i en Th1-immunrespons fremkaldt af den lipiderede immunogen.

Immunisering med rLiPO-E7m inducerer E7- specifikke T celle responser

Vi undersøgte dernæst, om rLiPO-E7m immunisering var i stand til at inducere E7-specifikke CTL-reaktioner. C57BL /6-mus blev subkutant immuniseret på dag 0 og 7 med rLiPO-E7m, rE7m eller en PBS-kontrol. Splenocytterne fra de immuniserede mus blev stimuleret med peptid RAHYNIVTF (RAH, E7

49-57) og antallet af E7-specifikke IFN-y-secernerende celler blev bestemt ved anvendelse ELISPOT-analyse (se Materialer og fremgangsmåder). Immunisering med rLiPO-E7m inducerede et højere antal INF-γsecreting celler end der gjorde immunisering med rE7m (figur 4a). Derudover farvning med en RAH /H-2D

b R-Phycoerythrin (PE) -konjugeret tetramer påvist en dramatisk stigning i E7-specifikke CD8 + T-celler efter immunisering med rLiPO-E7m. Antallet af E7-specifikke CD8 + T-celler induceret af rLiPO-E7m immunisering var mere end 4 gange så induceret af rE7m immunisering (figur 4b). For at teste T celledræbende aktivitet efter rLiPO-E7m eller rE7m immunisering blev RAH peptid-pulserede T2-celler anvendt som målceller i en standard 4-hr chromfrigivelsesassay. rLiPO-E7m immunisering inducerede et højt niveau af E7-specifik CTL-aktivitet. I modsætning hertil kun rE7m immunisering inducerede et lavt niveau af E7-specifik CTL-aktivitet (figur 4c). Disse resultater viser klart, at HPV E7-specifikke CTL-responser blev induceret ved rLiPO-E7m vaccination.

(a) Splenocytter (2 × 10

5 celler /brønd) fra immuniserede mus blev inkuberet med eller uden 10 ug /ml RAHYNIVTF (RAH) peptid i 48 timer i et anti-IFN-γ-coatede 96-brønds ELISPOT plate. De IFN-γ-udskillende pletter blev målt ved anvendelse af en ELISPOT-læser. Data er udtrykt som middel + SD af seks dyr per gruppe. (B) De RAH-specifikke CD8 + -T-celler blev detekteret ved tetramerfarvning og analyseret ved flowcytometri. Procentdelen af ​​tetramer-positive celler blandt CD8 + -T-celler er angivet ved hvert panel. Antallet af TetraRAH-tetramer + /CD8 + -celler ialt CD8-celler (1 x 10

5) fra tre forsøg var viste. Søjlediagrammer angiver middelværdien procentdel af RAH tetramer + /CD8 + celler blandt de CD8 + -celler. Data er udtrykt som middelværdi + SD. * P 0,05. (C) For at vurdere den cytotoksiske virkning af rLiPO-E7m immunisering på tumorceller, blev en standard chrom-frigivelsesassay udføres. Isolerede splenocytter (effektorceller) blev stimuleret med RAH (10 ug /ml) i 7 dage i nærvær af rIL-2 (10 enheder /ml). Målcellerne (5 × 10

3 /brønd) blev inkuberet med forskellige forhold mellem effektorceller (1:25, 1:50, 1:100). Specifik lyse (%) blev beregnet som følger:. 100 x (Prøve releasecpm – Spontan releasecpm) /(Maximum releasecpm – Spontan releasecpm)

Evaluering af terapeutisk og profylaktisk Effekt af rLiPO-E7m

i den profylaktiske model blev mus immuniseret to gange med PBS, rE7m eller rLiPO-E7m på to ugers mellemrum, og TC-1-celler blev injiceret subkutant på 7 dage efter sidste immunisering. På dag 58 efter udfordring, tumorerne forblev næppe målbar i rLiPO-E7m-immuniserede mus. I modsætning hertil gennemsnitlige tumorvolumen i mus injiceret med PBS var større end 2,5 cm

3, og den gennemsnitlige tumorvolumen var 0,59 ± 0,62 cm

3 i mus vaccineret med rE7m (figur 5a). For at vurdere den terapeutiske model blev C57BL /6-mus injiceret subkutant med TC-1-celler på dorsum. Syv dage senere, disse mus modtog 30 ug af enten rLiPO-E7m eller rE7m eller modtog kun PBS via subkutan injektion af maven. På dag 58 efter udfordring, tumorerne var næppe påviselige i mus, der modtog rLiPO-E7m. I modsætning hertil gennemsnitlige tumorvolumen i mus injiceret med PBS var over 3 cm

3, og den gennemsnitlige tumorvolumen i mus immuniseret med rE7m var større end 2,0 cm

3 (figur 5b). Disse resultater viser, at både de profylaktiske og terapeutiske effektiviteter af rekombinante immunogener dramatisk øges, når de leveres i en lipideret form,. Salg

(a) Mus blev immuniseret to gange ved subkutan injektion af rE7m /rLiPO-E7m (10 ug ) eller PBS med en uges mellemrum. Syv dage efter den sidste immunisering blev mus injiceret subkutant med 2 x 10

5 TC-1-celler i et totalt volumen på 200 pi subkutant. (B) Mus blev subkutant inokuleret med TC-1-celler (2 x 10

5 /mus). Efter 7 dage blev tumorbærende mus (5-10 mus pr gruppe) injiceret en gang med rE7m /rLiPO /rE7m (30 ug /mus) eller PBS. Tumorvolumenet blev vist som længde x bredde x bredde /2 (mm

3). Data er udtrykt som middel + SEM. (C) Tre grupper (rLiPO-E7m /CD4, rLiPO-E7m /CD8 og rLiPO-E7m /Rat IgG) af mus blev injiceret med anti-CD4, anti-CD8 og kontrol antistoffer ved en dag før injektion af TC -1 celler. Disse grupper og to yderligere grupper (rLiPO-E7m og PBS) blev injiceret en gang med rLiPO-E7m (10 ug /mus) eller PBS syv dage efter inokuleret med TC-1-celler (2 x 10

5 /mus). Tumorvolumenet blev vist som længde x bredde x bredde /2 (mm

3). Data er udtrykt som middel + SEM.

Fem grupper af C57BL /6-mus blev anvendt til yderligere at identificere hvilken undergruppe af T-celler bidrager til anti-tumor-immunitet. Tre grupper blev injiceret anti-CD4 (rLiPO-E7m /CD4), anti-CD8 (rLiPO-E7m /CD8) og kontrol-antistoffer (rLiPO-E7m /Rat IgG) en dag før injektion af TC-1-celler. Syv dage senere, disse mus modtog 10 ug rLiPO-E7m. Behandlinger PBS og 10 ug rLiPO-E7m blev serveret som negative og positive kontroller, hhv. På dag 30 efter podning med tumoren, den gennemsnitlige tumor volumen PBS og rLiPO-E7m grupper var 1,1 cm

3 og 0,14 cm

3 hhv. Ingen signifikante forskelle blandt grupper af rLiPO-E7m, rLiPO-E7m /CD4 og rLiPO-E7m /Rat IgG. Tværtimod blev den beskyttende virkning afskaffes, når CD8 + celler blev udtømt i rLiPO-E7m /CD8-gruppen (p 0,005, figur 5c). Dette resultat åbenbart viste, at administration af rLiPO-E7m kunne generere CD8 + -celler medieret antitumorvirkning.

Discussion

Vi har produceret et lipideret immunogen, rLiPO-E7m, som består af det inaktiverede E7 protein af HPV16 biologisk fusioneret til et bakterielt lipid-del. Vores resultater viser, at rLiPO-E7m alene inducerer Th1 immunresponser, E7-specifikke CTL-reaktioner og tumor-beskyttende immunitet i en mus tumormodel.

Udviklingen af ​​en protein-baserede immunterapier mod tumorer er, at proteinbaserede immunogener selv har lav immunogenicitet og ikke let fremkalder CTL-responser. Formulering immunogenet med hjælpestoffer er den mest almindelige metode til at udvikle effektive vacciner og overvinde begrænsningen af ​​protein-baserede immunterapier. Vi har udvidet denne idé ved kovalent binding af et immunogen til en immunpotentiator, hvilket skaber en lipoprotein-baseret vaccine med iboende adjuvansaktivitet.

Tidlige undersøgelser viste den kraftfulde adjuvansaktivitet af bakteriel lipoprotein, syntetiske lipider til peptidantigenerne og lipid -tailed glyco-peptider [10], [11], [12]. For eksempel kunne det rekombinante lipiderede OspA inducere beskyttende immunitet korreleret med udviklingen af ​​antistoffer. Dette borreliose vaccine (LYMErixTM) blev licenseret af amerikanske FDA i 1998 [13], [14]. En anden rekombinant lipoprotein tilgang er baseret på den ydre membran lipoprotein I (Opri) fra Pseudomonas aeruginosa. Opri vaccine formulering ved hjælp af klassisk svinepest (CSF) E2 og NS3 forfremmet DC aktivering i grisen, hvilket resulterer i forbedrede T-celle responser sammen med humorale immunforsvar [15]. Den Opri er også blevet fusioneret med en tuberkulose vaccine kandidat, mycolyl-transferase antigen 85A (Ag85A). Subkutan boosting med dette fusionsprotein i fravær af adjuvans steget betydeligt de Ag85A-specifikke humorale immunreaktioner [16]. MALP-2 (makrofag-aktivering lipopeptid-2) har vist opmuntrende antitumorale aktivitet i nogle modeller [17], [18]. Oldford og medarbejdere vist, at Pam3CSK4 inhiberede tumorvækst i en mastcelle og mastcelleafledte IL-6-afhængig måde [19]. Senere en tre-komponent GLP vaccine ved Ingale og medarbejdere (en tre palmitinsyre Pam3CSK4 del, en CD4 + og en B-celleepitop) viste induktion af stærke tumorspecifikke IgG-responser [20]. For nylig Renaudet og medarbejdere udviste en fire-komponent HER-GLP vaccine konstrukt (en CD4 + T-celleepitop, en OVA CD8 + T-celle-epitop, et kulhydrat B-celleepitop og en indbygget palmitinsyre adjuvans) inhiberede tumorvækst i HER-GLP immuniserede mus [21].

Adjuverende brug af lipopeptider fremkalder både Th1 og Th2 cytokiner afhængigt af modellen antigen i immuniseringer. For eksempel var fuldstændig syntetiske lipopeptider herunder palmitoyl-lipideret peptid og cholesterol-lipiderede peptid fundet, der kan udløse en Th1-afhængig beskyttende immunitet [22]. I modsætning hertil diacylerede lipopeptid FSL-1 inducerer TLR2-medieret Th2-responser [23]. Imidlertid kan de immunresponser være skæv af lipoproteiner og lipopeptider mod Th1-responser blev stadig observeret mange gange. En syntetisk Pam3 lipopeptid af OspA inducere Th1 fænotype udvikling i αβ T-cellereceptor-transgene mus [5]. Bettahi og medarbejdere fandt, at lipopeptidet fremkaldte en polariseret Th1 immunrespons [24]. Imanishi og medarbejdere viste, at Pam3-CysSK4 og MALP-2 som en specifik aktivator af Th1-cellefunktion og indebærer inddragelse i Th1-medierede responser [25].

Vi har vist, at en lipo-immunogen kunne med held forbedre frembringelsen af ​​neutraliserende antistoffer mod dengue virus [4], [7]. Her brugte vi rLiPO-E7m at påvise, at lipoprotein immunogener kan fremkalde tumor CTL respons. Vigtigere er det, denne avancerede tilgang giver en rationel design til kræft immunterapier for fremtiden. Vi mener, at der kan udvikles denne lipo-immunogen-tilgang til en ny billig og effektiv behandling for HPV-associerede kræftformer. Endvidere lipid struktur selv er en TLR2 agonist [26] og kan gå gennem udfoldning og refoldning proces under fremstillingen uden at påvirke dets funktion. Denne fordel giver rekombinante lipo-immunogener at fastholde mere fleksibilitet og giver mulighed for den robuste produktion af lipiderede immunogener. Selv om godkendelsen af ​​lipideret OspA blev spurgt om de arthritogene reaktioner forårsaget af den molekylære mimicry af OspA, blev der ikke sikkerhedsproblemer rejst vedrørende lipid-delen af ​​rekombinante lipo-immunogener [27]. I vores platform-teknologi, har vi optimeret de opstrøms og nedstrøms processer til fremstilling af rekombinant lipoprotein, rAg473 af

Neisseria meningitides

gruppe B, og har karakteriseret rAg473 ved hjælp af de optimerede processer [28]. De prækliniske toksikologiske og dyreforsøg af rAg473 er ​​afsluttet og vi allerede sikkerhedsdata til Taiwan Food and Drug Administration til Investigational New Drug (IND) ansøgning.

For at inducere CTL-responser, protein- baserede immunogener normalt skal formuleres med adjuvanser (review [3] [29]). For eksempel har den saponin adjuverende ISCOMATRIX [30] og liposom-polykationiske-DNA (LPD) adjuvans [31] vist sig at forbedre CTL-responser af HPV-protein-baserede vacciner. HPV-16 E7 er blevet fusioneret til et fragment af

Haemophilus influenzae

protein D formuleret i et adjuvans indeholdende monophosphoryllipid A og QS-21 saponin-adjuvans [32]. For nylig Nventa Biopharmaceuticals (købt af Akela Pharma), rapporterede, at effekten af ​​HspE7 blev yderligere forstærket af den adjuverende Po1y-ICLC, og dette fund tjent som grundlag for de fase 1 clinica1 forsøg [3]. Selv om de seneste fremskridt inden for adjuverende felt har givet flere potente og nyttige adjuverende kandidater, udvikle effektive og sikre adjuvanser til human anvendelse er fortsat en udfordring [33]. Vores tilgang undgår hurdle for at bruge adjuvans, hvilket tyder på, at det kan give en ny metode til at fortsætte udviklingen af ​​terapeutiske vacciner.

Som konklusion, vi har vist, at biologisk sammensmelte en tumor antigen med en bakteriel lipid-del gjort dette antigen, der kan stimulere BM-DC’er gennem TLR2, inducere et Th1 immunrespons, inducere antigenspecifikke CTL-responser, og generering tumor-beskyttende immunitet i en mus tumormodel. rLiPO-E7m kan således være en lovende terapeutisk vaccine kandidat mod HPV-associerede tumorer. Desuden

E. coli

har været anvendt som et stabilt system produktion for Biologics, og dette lipidering teknologi kan let anvendes på andre tumor-associerede antigener med få begrænsninger. Denne strategi kan give en metode til udvikling af succesfulde immunterapier bruge protein-baserede kandidater og vil forhåbentlig give sikkerheds- og effektive vacciner til human brug.

Materialer og Metoder

Kemikalier

Alle kemikalier blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO) og Merck (Darmstadt, Tyskland). Restriktionsenzymer og ligase blev købt hos New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Primere anvendt til kloning blev indkøbt fra Mission Biotech, Inc. (Taipei, Taiwan). Trypsin og matrixen anvendes til massespektrometrianalyse blev erhvervet fra Promega Co. (Madison, WI).

cellelinier og Medium

TC-1, en mus epitelcellelinie transformeret med onkogener Ras, HPV16 E6 og E7, var en venlig gave fra Dr. TC Wu (Johns Hopkins University). TC-1-celler blev dyrket i DMEM (GIBCO-BRL, Grand Island, NY) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (HyClone, Logan, Utah), penicillin (100 enheder /ml) og streptomycin (100 ug /ml ). Komplet RPMI-10 medium indeholdt RPMI-1640 suppleret med 10% (vol /vol) varmeinaktiveret føtalt kalveserum, 25 mM HEPES, 4 mM L-glutamin, 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycinsulfat og 50 pM . β-mercaptoethanol

Grundlag for design af Inaktiv HPV E7 (E7m)

HPV E7 indeholder oncoprotein tre konserverede regioner: domæner CR1, CR2 og CR3 [34].