PLoS ONE: Reduceret mRNA og protein Ekspression af Genomisk Vicevært RAD9A i primære fibroblaster af Personer med Childhood og uafhængig Second Cancer

Abstrakt

Baggrund

Ætiologien af ​​sekundær kræft i barndommen kræft overlevende er stort set uklar. Eksponering af normale somatiske celler for stråling og /eller kemoterapi kan beskadige DNA og hvis ikke alle DNA-læsioner er ordentligt fast, kan mis-reparation føre til patologiske konsekvenser. Det er plausibelt at antage, at genetiske forskelle, dvs. i de veje, der er ansvarlige for cellecyklus kontrol og DNA-reparation, spille en afgørende rolle i udviklingen af ​​sekundær cancer.

Metode /Fund

For at identificere faktorer, der kan påvirke modtageligheden for anden cancer dannelse, vi rekrutterede 20 personer, der overlevede en barndom malignitet og derefter udviklede en anden kræft samt 20 omhyggeligt matchede kontrolpersoner med barndommen malignitet, men uden en anden cancer. Ved antistof-mikroarrays, screenede vi primære fibroblaster af matchede patienter for forskelle i mængden af ​​repræsentative DNA-reparation-associerede proteiner. Vi fandt konstitutivt nedsatte niveauer af RAD9A og flere andre DNA reparation proteiner i to-kræftpatienter, sammenlignet med patienter én-cancer. Den RAD9A proteinniveau øges som reaktion på DNA-skade, men i mindre grad i patienterne to-cancer. Kvantificering af mRNA-ekspression af real-time RT-PCR afslørede lavere

RAD9A

mRNA-niveauer i både ubehandlede og 1 Gy y-bestrålede celler af patienter to-cancer.

Konklusioner /Betydning

Kollektivt, vores resultater støtter tanken om, at graduering af RAD9A og andre cellecyklusstop og DNA reparation proteiner bidrager til risikoen for at udvikle en anden malignitet hos patienter børnekræft

Henvisning:. Weis E, Schoen H, Victor A, Spix C, Ludwig M, Schneider-Raetzke B, et al. (2011) Reduceret mRNA og protein Ekspression af Genomisk Vicevært RAD9A i primære fibroblaster af Personer med Childhood og uafhængig Second Cancer. PLoS ONE 6 (10): e25750. doi: 10,1371 /journal.pone.0025750

Redaktør: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Frankrig

Modtaget: Juli 1, 2011; Accepteret: 9. september 2011; Udgivet: Oktober 3, 2011

Copyright: © 2011 Weis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Stiftung Rheinland-Pfalz für Innovation (projekt nr. 698) og Fazit-Stiftung. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

I de fleste tilfælde, kræft er en multifaktoriel sygdom forårsaget af miljøfarer, usund livsstil og /eller genetiske [1] faktorer. Fordi børn er normalt mindre udsat for et ugunstigt miljø eller livsstil end voksne, vil sandsynligvis være en vigtigere genetiske faktorer [2]. Det er dog kun en lille del (1-10%) af barndommen kræftformer har en kendt genetisk ætiologi [3]. Det er velkendt, at bestråling og andre DNA-beskadigende midler, der anvendes til behandling af cancer er i stand til at udløse dannelsen af ​​leukæmi og andre kræftformer [4], [5]. Stråling og /eller kemoterapi udgør risikofaktorer for udvikling af en anden malignitet, der ikke kan klassificeres som remission af den primære tumor. Fordi relativt få barndom kræft overlevende udvikle en anden malignitet [6], kan genetisk disposition være involveret.

Celler er konstant udsat for endogene og eksogene DNA-ødelæggende midler. Der er flere veje, der overvåger og vedligeholder genom integritet. Celler har flere checkpoints, der forbigående forsinker cellecyklusprogression at give ekstra tid til DNA-reparation eller inducere apoptose [7], [8]. Mutationer eller afvigende regulering af gener, der styrer cellecyklus checkpoints og DNA-reparation spille vigtige roller i tumorigenese [9], [10] og er prime kandidater når de søger efter gener modulerende risikoen for sekundær cancer. Hvis behandling-induceret DNA-skader er misrepaired, kan dette igangsætte anden tumor udvikling. Genetisk disposition kan føre til øget kromosomale ustabilitet efter strålebehandling eller kemoterapi [5], [11], [12]. Kun i meget sjældne tilfælde af anden barndom malignitet en genetisk ustabilitet syndrom som fanconis anæmi, ataksi teleangiectasia eller xeroderma pigmentosum er blevet diagnosticeret [10]. I de fleste tilfælde årsagerne underliggende udvikling af en anden cancer forbliver ukendt.

For at teste den hypotese, at modulationer i ekspressionen af ​​cellecykluskontrol og DNA reparation gener er associeret med sekundær cancer, analyserede vi primære fibroblaster i barndommen cancerpatienter med en anden cancer (2c patienter) og omhyggeligt matchede kontroller uden en anden cancer (1C patienter). Hudfibroblaster repræsenterer en normal somatisk celletype. I modsætning til blod og EBV-transformerede lymfoblaster, som lettere kan opnås, primære fibroblaster udgør en homogen cellepopulation med intakte cellecyklus og DNA reparation checkpoints. Hidtil har der kun været få undersøgelser om primære fibroblaster af kræftpatienter. Fibroblaster af bryst og skjoldbruskkirtel kræftpatienter viste sig at have defekt reparation og /eller cellecyklus regulering [13]. Unormal genekspression i somatiske celler i de upåvirkede forældre retinoblastom patienter er også i overensstemmelse med en arvelig disposition til kræft udvikling [14].

For at identificere følsomhed faktorer for anden cancer dannelse, vi screenede forskellige DNA-reparation associerede gener for konstitutive proteinekspressionsplasmider forskelle i 2C versus 1C patienter. DNA beskadigelse checkpoint protein RAD9A blev nedreguleret i både ubehandlede og bestrålet somatiske celler af patienterne to-cancer, sammenlignet med patienter én-cancer. Øget konstitutive og DNA-beskadigelse-inducerede niveauer af RAD9A protein og andre genomiske husholdere kan bidrage til at bevare genom stabilitet og forhindre anden tumorudvikling efter strålebehandling og kemoterapi. RAD9A, hvilket i nogle papirer kaldes hRAD9 eller blot rad9, er en interessant kandidat, fordi det fungerer på flere veje, herunder DNA-reparation, cellecyklus checkpoint-kontrol og apoptose og dens unormal ekspression er blevet forbundet med tumorigenese [15], [16 ].

Resultater

Rekruttering af patienter

Tyve personer, der overlevede en børnekræft og derefter udviklede en anden cancer blev rekrutteret fra den tyske Childhood cancer indskrive. Mindst et år, skal er gået siden diagnose af den anden cancer. Tyve matchede sager, der overlevede en børnekræft og ikke udviklede en anden cancer blev tilfældigt udvalgt fra indskrive. Kriterierne matchende var samme køn, lige primær kræftdiagnose, lige alder ved første diagnose, og samtidig under observation. Fordi de primære tumorer i matchede en- og to-cancer patienter blev diagnosticeret i samme år, de behandlingsmodaliteter var stort set identiske. Alle patienter blev fulgt op af primær kræftdiagnose til det tidspunkt, hvor de blev ansat.

Patienterne skulle være i live, og mindst 18 år (juridisk alder i Tyskland) for at give deres informerede samtykke til hudbiopsi . Mindre end 50% af de kontaktede patienter to-cancer besluttet at deltage i undersøgelsen. På grund af disse inklusionskriterier, kunne vi kun ansætte et begrænset antal patienter to-cancer i hele Tyskland. Der er en vis skævhed i fordelingen af ​​primære og sekundære kræftformer. For eksempel er den hyppigste kombination af akut myeloid leukæmi efter akut lymfoid leukæmi har en meget ugunstig prognose, og derfor ikke er repræsenteret. På den anden side, er sekundære thyroid carcinomer overrepræsenteret, fordi patienterne har en god prognose og nå voksenalderen.

Reducerede niveauer af DNA-reparation-associerede proteiner i celler af to-cancer patienter

Tilpassede antistof-mikroarrays (se for eksempel figur 1) blev anvendt til at sammenligne de konstitutive ekspressionsniveauer (uden induktion af DNA-beskadigelse) af forskellige DNA-reparation-associerede proteiner i eksponentielt voksende primære fibroblaster fra patienter barndommen cancerpatienter med og uden anden tumor, hhv. De 19 undersøgte gener (Tabel 1) blev udvalgt, fordi de er centrale aktører i forskellige DNA reparation veje (dvs. DNA dobbelt-strenget pause reparation, nukleotid excision reparation, bunden excision reparation og mismatch repair), som deltager enten i signalering af DNA-skader , checkpoint kontrol og /eller DNA-reparation. Mutationer i mange af disse gener er kendt for at prædisponere for udvikling af kræft.

Forskellige mængder (ca. 1,5, 1,0 og 0,5 pg) af anti-RAD9A antistof (2 ng /pl) er plettet i triplikater på nitrocellulose overtrukne objektglas og inkuberet med fluorescensmærket kerneprotein ekstrakt af ubehandlede fibroblaster fra to-kræftpatient 2C-7 og den matchende one-kræftpatient 1C-7 hhv. Anti-ACTB tjener som positive og spotting puffer som negativ kontrol. Den målte 2C /1C RAD9A protein-forhold er 0,5.

For hver matchede (2C vs. 1C) patient par vi bestemt z forholdet tredobbelte målinger af protein niveauer (normaliseret med log10 transformation og Z-score). Seks af de 19 testede proteiner, der repræsenterer forskellige DNA-reparationsveje, vises lavere niveauer i to-kræftpatienter (tabel 1). De box parceller i figur 2 nuværende fordelingen af ​​z nøgletal for BRCA1 (-1.36x; p = 0,017), DDIT3 (-1.27x; p = 0,011), MSH6 (-1.16x; p = 0,021), TP53 (-1,18 x; p = 0,003), RAD9A (-1.38x; p = 0,040), og RAD51 (-1.37x; p = 0,009). De p-værdier blev ikke korrigeret for multiple test og bør betragtes som eksplorativ. For at demonstrere pålideligheden af ​​vores antistof microarrays, blev Western blot analyse af RAD9A udført på et repræsentativt matchede par. Den anti-RAD9A antistof farves den forventede 45 kDa store bånd i proteinekstrakter nukleare, hvorimod ingen eller kun et svagt bånd blev set i cytoplasmatiske ekstrakter (Fig. 3). Overensstemmelse med antistoffet microarray (fig. 1), viste Western blot en mindre mængde (60%) af RAD9A protein i 2C patienten, sammenlignet med den matchede 1C patient. Salg

De relative ekspressionsniveauer i fibroblaster af 2C versus 1C patienter er -1.36x (p = 0,017) for BRCA1, -1.27x (p = 0,011) for DDIT3, -1.16x (p = 0,021) for MSH6, -1.18x (p = 0,003) til TP53, – 1.38x (p = 0,040) for RAD9A, og -1,37 (p = 0,009) for RAD51. Proteinekspression blev målt ved antistof-mikroarrays (normaliseret ved log10 transformation og Z-score). Box plots viser fordelingen af ​​z nøgletal i matchede 2C vs 1C patienter. Medianen er repræsenteret af en vandret linje. Bunden af ​​kassen angiver 25

percentil, top 75

percentil. De T stænger strækker sig fra kasserne til højst 1,5 gange højden af ​​kassen. Outliers er vist som åbne cirkler.

Gelen på venstre side viser Coomassie blåfarvning af nukleare og cytoplasmatiske proteinekstrakter (30 pg hver) fra ubehandlede fibroblaster af to-kræftpatient 2C-7 og matchede én-kræftpatient 1C-7. Den tilsvarende gel på højre side er farvet med anti-RAD9A antistof, som genkender en 45 kDA kerneprotein. Den beregnede 2C /1C RAD9A protein-forhold er 0,6.

De seks proteiner viser konstitutiv ekspression forskelle blev også kvantificeret i celler på 1 time og 4 timer efter en Gy γ-bestråling. For hver patient, sammenlignede vi proteinniveauer målt ved hjælp af antistof microarrays i behandlede versus ubehandlede prøver. To proteiner, RAD9A og DDIT3, afveg i deres cellulære respons på DNA beskadigelse mellem 2C og 1C patienter. De box plots i figur 4 viser z nøgletal for RAD9A (efter normalisering med log10 transformation og z scores) i 2C og 1C gruppen. I begge grupper blev RAD9A proteinniveauer forhøjet efter DNA beskadigelse. I én-cancer gruppe blev RAD9A overudtrykt mere end dobbelt på 1 time og 4 timer efter bestråling, i forhold til den konstitutive proteinniveau. I 2C-gruppen, mængden af ​​RAD9A protein steg 1.76- og 1,63 gange ved 1 time og 4 timer henholdsvis, hvilket indebærer en lavere induktion (-1.44x, p = 0,012 ved 4 h) ved DNA-skader i barndommen cancerpatienter med en anden tumor. Svarende til RAD9A, proteinet kodet af DNA beskadigelse inducerbare transkript

DDIT3

blev også fundet at være forøget i bestrålede celler (fig. 3). I 1C patienter blev proteinniveauet forhøjede 1.40- og 1,96 gange ved 1 time og 4 timer efter DNA beskadigelse sammenlignet med 1.26- og 1,95 gange i 2C-gruppen. Ved 1 time efter bestråling var der en lavere induktion (-1.13x, p = 0,019) i to-cancer gruppe.

Differential induktion af RAD9A (venstre side) og DDIT (højre side) på 1 time, og 4 timer efter en Gy γ-bestråling i fibroblaster af patienter to-cancer (grå kasser) og en-kræftpatienter (stiplede kasser). Proteinekspression blev målt ved antistof-mikroarrays (normaliseret ved log10 transformation og Z-score). Box plots viser fordelingen af ​​z-forhold af behandlet vs ubehandlede celler fra de samme patienter. Medianen er repræsenteret af en vandret linje. Bunden af ​​kassen angiver 25

percentil, top 75

percentil. De T stænger strækker sig fra kasserne til højst 1,5 gange højden af ​​kassen. Outliers er vist som åbne cirkler. DNA-skade induceret stigning i 2C-gruppen er lavere end i 1C gruppe for RAD9A ved 4 timer efter bestråling (-1.44x, p = 0,012) og for DDIT3 på 1 time efter bestråling (-1.13x, p = 0,019 ).

Reduceret RAD9A mRNA ekspressionsniveauer i to-cancer patienter

Fordi RAD9A protein blev mest dramatisk nedreguleret hos patienter to-cancer, fokuseret vi vores videre undersøgelse af dette cellecyklus checkpoint og DNA-reparation protein. Vi udførte kvantitative mRNA-ekspression analyser af real-time RT-PCR i både ubehandlede og bestrålede celler. De box plots i figur 5 nuværende fordelingen af ​​udtryk nøgletal i 20 matchede par af patienter. De konstitutive

RAD9A

mRNA-niveauer (uden induktion af DNA-skader) var signifikant lavere hos patienter to-cancer (-2.40x, p = 0,004), sammenlignet med patienter én-cancer. Mellem-gruppe forskelle blev også observeret ved 1 time (-2.54x, p = 0,003), 4 timer (-2.62x, p = 0,003) og 24 timer (-2.54x, p = 0,003) efter bestråling. Tre matchede par repræsenterer outliers eller ekstreme udsving i boksen plot diagrammer, hvilket indikerer, at relativ

RAD9A

udtryk niveauer kan betragteligt variere mellem patienterne og ikke altid reduceres hos patienter to-cancer. De (ekstreme) outliers repræsenterer forskellige kombinationer af primær og sekundær cancer.

RAD9A

mRNA-niveauer i ubehandlet og bestrålet (1 time, 4 timer og 24 timer efter en Gy) fibroblaster ved to- kræftpatienter, sammenlignet med matchede patienter én-cancer. mRNA blev kvantificeret ved real-time RT-PCR (normaliseret med ΔΔCT metode og to endogene kontrol gener). Box plots viser fordelingen af ​​udtryk nøgletal i matchede 2C vs. 1C patienter. Medianen er repræsenteret af en vandret linje. Bunden af ​​kassen angiver 25

percentil, top 75

percentil. De T stænger strækker sig fra kasserne til højst 1,5 gange højden af ​​kassen. Outliers er vist som åbne cirkler, ekstreme outliers som trekanter. To kræftpatienter viser reduceret

RAD9A

mRNA-niveauer uden induktion af DNA-skader (-2.40x, p = 0,004) samt på 1 time (-2.54x, p = 0,003), 4 h (-2,62 x, p = 0,003), og 24 timer (-2.54x, p = 0,003) efter bestråling.

Fordi det er blevet rapporteret, at

RAD9A

ekspression er afhængig af DNA-methylering [17], bestemte vi status methylering af formodede cis-regulatoriske region ved bisulfit pyrosekventering. Sammenlignet med klassiske bisulfit plasmid sekventering, kan bisulfit pyrosekventering kun analysere et begrænset antal bindingssteder for CpG placeret på det mest 30-50 bp 3 ‘fra sekvenseringsprimeren, men på den anden side kan meget mere nøjagtigt (± 2%) kvantificere CpG methylering niveau. Det analyserede DNA-segment, som indeholder tre tilstødende bindingssteder for CpG, viste sig at være ikke-methyleret i ubehandlede celler af både 2C og 1C patienter. Rækken af ​​methylering værdier var 4-10%, som forventet for en transkriptionelt aktiv gen. Der var ingen signifikant mellem grupperne methyleringsforskellen, hvilket kunne forklare den observerede ekspression forskel. Fordi tætheden af ​​methylerede CpG’er frem for enkelte steder i et CpG island tænde et gen til eller fra [18], [19], den gennemsnitlige methylering af et par CpG’er kan normalt tjene som en repræsentativ epigenetiske markør for en given cis-regulatoriske region .

kromosom 11q13.1 der indeholder

RAD9A

gen ofte forstærket i en række humane tumorer [17]. For at udelukke

RAD9A

kopi nummer variationer mellem 2C og 1C patienter, vi udførte høj opløsning karyotype analyser med Affymetrix GeneChip Genome Wide Menneskelig SNP-array 6.0 samt kvantitativ real-time PCR. Begge metoder afslørede to kopier af

RAD9A

gen i alle undersøgte patienter.

Diskussion

I forhold til de enorme bestræbelser på at karakterisere de transcriptomes og proteomer af tumorceller, der er relativt få undersøgelser, der søger efter genekspression forskelle i normale somatiske celler af tumor patienter [13], [14]. For at teste den hypotese, at forskelle i DNA-reparation pathways kan influere på risikoen for at udvikle en anden tumor efter behandling af kræft hos børn, sammenlignede vi de konstitutive niveauer af DNA-reparation-associerede proteiner i primære fibroblaster af matchede patienter to-cancer og én-cancer. Fordi vi ikke forvente dramatiske forskelle, men snarere subtile modulationer i DNA-reparation kapacitet i to-kræftpatienter, vi ikke udføre en genom-wide screen men testes kun et begrænset antal kendte DNA reparation-associerede gener ved hjælp meget følsomme antistof microarrays. Den iagttagelse, at 6 ud af 19 testede DNA-reparation-associerede proteiner konstitutivt blev nedreguleret i normale celler fra patienter to-cancer fremmer ideen om, at DNA-reparation veje for to-kræftpatienter er mindre i stand til at håndtere DNA-skade end patienter én-cancer . For to proteiner viste vi også en lavere induktion efter DNA beskadigelse. Et gen,

RAD9A

blev analyseret nærmere. Både konstitutiv mRNA-ekspression i eksponentielt voksende fibroblaster samt DNA-skader induceret ekspression på forskellige tidspunkter efter bestråling var lavere hos patienter to-cancer end hos patienter én-cancer. I dette lys RAD9A er en god kandidat til en faktor disponerer til anden kræft. Forskellen

RAD9A

udtryk ikke blev medieret af DNA methylering eller kopiere nummer variation.

RAD9A

genet er evolutionært stærkt konserveret fra gær til mand, som generelt betragtes som en god indikator for funktionel signifikans. Det virker i flere veje, herunder basen excision, homolog rekombination og mismatch reparation samt cellecyklus checkpoint-kontrol og apoptose. Mange af dets funktioner synes at være medieret af den nukleare RAD9A-hus1-rad1 proteinkompleks, der ligner PCNA [15], [16]. Mus

rad9

–

/Kreis – og i mindre grad

rad9

+ /

– knockout celler [20] og human RNAi knockdown celler med reducerede

RAD9A

niveauer [21] er følsomme over for forskellige typer af DNA-skader, viser genom ustabilitet, DNA-reparation mangel og ændrede cellecyklus checkpoints. Embryonale letalitet af musen

rad9

–

/Kreis – mutation viser, at de mange funktioner i Rad9A er afgørende for embryogenese og normal udvikling. Mus med målrettet

rad9

–

/Kreis – sletning i keratinocytter er stærkt modtagelige for genotoxin-induceret hud tumordannelse [22], [23].

rad9

–

/

– keratinocytter vise et større antal spontane og genotoxin-induceret DNA pauser, afvigende cellecyklus distribution og en øget hyppighed af apoptose. Dette er i overensstemmelse med det synspunkt, at RAD9A fungerer som en tumorsuppressor i huden og andre væv ved at fremme DNA-reparation i beskadigede celler og stabiliserende genomet før tumorigenese sker. Det er interessant at bemærke, at både nedregulering og opregulering af

RAD9A

har været forbundet med tumorigenese.

RAD9A

overekspression er blevet observeret i en række tumorer, herunder bryst- [17], lunge [24], thyroid [25], og prostatacancer [26]. Dette antyder, at

RAD9A

kan også fungere som et onkogen, mest sandsynligt ved aberrerende transaktivering af downstream målgener. Generelt

RAD9A

niveau korreleret med tumorstørrelse og /eller fase.

RAD9A

tilhører en voksende gruppe af gener med dobbelte roller i kræft. Afhængigt af celletypen og væv miljøet, kan det vise, enten tumorfremmende eller tumor-undertrykkende aktivitet [15]. De mekanismer, hvorved multifunktionelle RAD9A protein virker som et onkogen og en tumor suppressor, henholdsvis er stort set ukendt.

Da antallet af patienter to-cancer bliver 18 år eller ældre er relativt lille, vi kunne ikke begrænse vores studerede patienter til en specifik tumor enhed eller behandlingsprotokol. Den største undergruppe af primære tumorer var lymfoide leukæmier (10 tilfælde). På grund af deres god prognose blev thyroid carcinomer (6 tilfælde) overrepræsenteret som anden cancere. Strålebehandling er en vigtig risikofaktor for thyreoideakarcinom [27]. På denne baggrund fristende at spekulere i, at den overflod af RAD9A protein kan modulere risiko for stråling-induceret tumorer. Fremtidige mere omfattende undersøgelser bør overveje virkningerne af forskellige behandlingsmodaliteter af børnekræft. Det er som anført ovenfor, rekruttere homogene grupper af patienter er meget udfordrende. Vi opnåede hudbiopsier og blodprøver fra alle vores undersøgte patienter. Fordi mange patienter var knoglemarv transplanteres, blev blodcellerne ikke analyseret. Fibroblastkulturer etableret et eller flere år efter anden kræftdiagnose /behandling, hvilket gør det usandsynligt, at udtrykket forskelle mellem to-kræft versus patienter én-cancer er direkte eller indirekte påvirket af stråling eller kemoterapi. Selv om det er rimeligt at antage, at dyrkede fibroblaster repræsenterer situationen i kroppens normale celler, ville det være ønskeligt også at studere ukultiverede celler og /eller andre væv.

Antallet af analyserede patienter er relativt lille. Alligevel tyder vore resultater, at de konstitutive RAD9A protein niveauer samt omfanget af induktion efter DNA beskadigelse varierer mellem to-cancer og et-barndommen kræftpatienter. Vi foreslår, at RAD9A fungerer som tumorsuppressor i hudfibroblaster og andre normale celler i kroppen og dermed bidrager til at forebygge anden cancer. Analyse af forskellige normale celletyper i større patientgrupper, for eksempel voksne kræft overlevende er nødvendige for at understøtte en rolle for RAD9A i DNA-skader-induceret carcinogenese.

Materialer og metoder

Patient prøver

Den tyske Childhood Cancer Registry har indsamlet næsten fuldstændig alle barndom kræftformer i Tyskland siden 1980, gennemføre en tidsubegrænset opfølgning med en vægt på sekundære neoplasmer. Med hjælp fra den indskrive, vi rekrutterede 20 personer, der overlevede en barndom malignitet og derefter, uden relation til det første arrangement, der er udviklet en anden cancer (2C patienter) samt 20 omhyggeligt matchede personer [samme køn, samme primære cancer (ICCC klassifikation ), lige alder (± 1 år) ved første diagnose], der ikke udviklede en anden malignitet (1C patienter). Genetisk rådgivning blev tilbudt og skriftlige indhold blev opnået fra alle patienter, der deltog i undersøgelsen, som blev godkendt af den etiske komité for Medical Association of Rheinland-Pfalz (nr 837.440.03 [4102]).

gennemsnitsalderen ved diagnose af den første tumor var 6,8 år (interval 0-14) i begge grupper. De primære tumorer blev akut myeloid eller lymfoid leukæmi (11 tilfælde), Hodgkin eller Burkitt lymfom (5 sager) og andre solide tumorer (4 tilfælde). Den gennemsnitlige alder ved anden diagnose i 2C gruppen var 16,7 år (spændvidde 9-30). Den anden tumorer var myelodysplastisk syndrom eller lymfom (7 sager), skjoldbruskkirtel carcinom (6 tilfælde) og andre solide tumorer (7 sager). Anden neoplasmer blev bekræftet af erfarne kliniske onkologer at være nogen tilbagefald eller alternative manifestationer af den primære neoplasma.

Hud biopsier blev taget på det tidligst et år, som regel flere år efter anden kræftbehandling. Primære fibroblast cellekulturer blev etableret fra hudbiopsier og dyrket i minimalt essentielt medium med Earles salte (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) suppleret med 10% kalvefosterserum, vitaminer og antibiotika. Celler (uden DNA-skader) blev høstet fra eksponentielt voksende subkonfluente kulturer. For at inducere DNA-reparation, blev subkonfluente kulturer eksponeret for 1 Gy ioniserende stråling ved hjælp af en Gammacell 2000 (Cs137) strålerøret. Prøver blev udtaget 1 time, 4 timer og 24 timer efter bestråling. Celler blev vasket to gange med PBS og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.

Western blot og antistof microarray

I nuklear proteinekstraktion celler blev resuspenderet to gange i 500 pi 10 mM HEPES , 1,5 mM MgCI2, 10 mM KCI, pH 7,9 og inkuberet på is i 10 min. Efter 10 s centrifugering ved maksimal hastighed supernatanten blev kasseret. Derefter blev pelleten resuspenderet i 100 pi 20 mM HEPES, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 25% glycerol, pH 7,9 og homogeniseret under anvendelse af en sprøjte med gauge nål. Efter inkubation på is i 30 minutter og centrifugering i 30 minutter ved maksimal hastighed ved 4 ° C blev supernatanten indeholdende det kerneekstrakt adskilt fra cytoplasmatiske pellet og opbevaret ved -80 ° C. Proteinkoncentrationen blev målt ifølge Bradford ved anvendelse Roti Quant (Roth, Karlsruhe, Tyskland).

Til Western blot-analyse, 30 ug nukleart proteinekstrakt blev separeret på en 8% SDS-PAGE-gel og derefter overført til en Hybond-P-membran (Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Membranen blev først blokeret med 5% fedtfri tørmælk (NFDM) opløst i Tris-saltvand (50 mM Tris-CI, pH 7,5, 150 mM NaCl), 0,1% Tween 20 (TBST). Blottene blev derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med monoklonalt muse-anti-RAD9A antistof, fortyndet 1:250 (2 ug /ml) i TBS med 5% NFDM. Efter vask af blottet tre gange i 5 minutter med TBST blev proteiner detekteret med peroxidase-mærket sekundært kanin-anti-muse-antistoffer under anvendelse af BM Chemiluminescence Western Blotting Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Band intensiteter blev kvantificeret med en LAS-3000 (Fujifilm, Düsseldorf, Tyskland) selvlysende billedanalysator. Comassie blue-farvning blev anvendt til at justere signalintensiteter til mængden af ​​protein.

Tilpassede antistof-microarrays til kvantificering af 19 forskellige DNA-reparation-associerede proteiner (tabel 1) blev fremstillet ved at spotte en dråbe, to dråber og /eller tre dråber, hver dråbe indeholder ca. 0,5 pg antistof i tre eksemplarer på nitrocellulose-coatede objektglas (Oncyte, nitrocellulose 16 multi-pad dias, Grace Bio-Labs, Bend, OR, USA), ved hjælp af en ikke-kontakt-array spotter (sciFLEXARRAYER 3 , Scienion, Berlin, Tyskland). Antistoffer mod beta-actin (ACTB) tjente som positiv, spotting puffer som negativ kontrol. Objektglas blev opbevaret ved 4 ° C i tør tilstand. Kerneproteiner blev mærket med en amin reaktiv fluor farvestof, der danner en kovalent amidbinding mellem de primære aminer i proteiner. To mikrogram protein og 0,12 pi fluorescerende farvestof (Dylight 649 NHS-ester, Pierce, Rockford, USA) blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i mørke. Hvorefter overskydende fluorescerende farvestof blev inaktiveret ved tilsætning af 100 mM glycin til reaktionsblandingen. Før brug, var antistof mikroarrays dækket med 16-pad FAST frame hybridisering kamre (Whatman, Maidstone, UK). Uspecifikke bindingssteder blev blokeret i 1 time ved 4 ° C med 120 pi PBS indeholdende 4% NFDM pr undergruppering, efterfulgt af tre vaske med 120 pi PBS hver i 10 min. Mærkede proteinprøver blev inkuberet på sub-arrays natten over ved 4 ° C. Bagefter blev objektglassene vasket to gange i 15 minutter med PBS, 5% Tween 20 og to gange i 15 minutter med HPLC-kvalitet vand. Endelig blev objektglassene tørret i en SpeedVac og scannet med en høj opløsning konfokal skanner (Affymetrix opstillingsscanner 428 TM, High Wycombe, UK). Lysbilederne blev analyseret ved anvendelse af Spotfinder 3.1.1 software (TM4, Dana Faber Cancer Institute, Boston, USA). Baggrund subtraktion blev udført ifølge formlen: spot intensitet = gennemsnitlig intensitet SP – (sum BKG – sum top25 BKG) /(antal pixelSP – antal pixel top25 BKG), hvor SP betegner enhver plet, BKG den tilsvarende baggrund og top25 BKG de øverste 25% af baggrunden pixel.

for statistisk analyse af microarray data, vi udførte log10 transformation, Z-score og z forholdet beregninger [28]. For mellem-gruppe sammenligninger brugte vi tegnet test og om muligt, Wilcoxon test (skævhed [-1, + 1]) og box plots som grafik (PASW statistik 18,0). Ingen justering for multiple test blev udført. Analyserne blev betragtet som eksplorative, og p-værdier for de tilsvarende prøver præsenteres til beskrivende årsager. Resultaterne af disse tests kan derfor ikke betragtes som væsentlig på alle niveauer.

Kvantitativ real-time RT-PCR

Totale RNA’er blev fremstillet af behandlede og ubehandlede fibroblastkulturer vha TRIzol metoden (Invitrogen ). Et mikrogram af RNA-prøver blev omvendt transkriberet til cDNA under anvendelse af SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). Kvantitativ real-time RT-PCR på

RAD9A

blev udført med en QuantiTect Primer Assay (Qiagen, Hilden, Tyskland) og en Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR systemet (Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland). Exon-spænder fremad (5′-GAGAAGACGGTGGAAAAATG-3 ‘) og omvendt (5′-GGAAGGACAGGTTGTGAGTC-3’) primere blev designet med Primer3, versionen 0.4.0 (https://frodo.wi.mit.edu/primer3/) program. Linearitet af amplifikation blev verificeret ved qPCR standardkurve og sekvensanalyse.

RRN18S

(Qiagen, # QT00199367) og

TBP

(# QT00000721) blev anvendt som endogene kontrol gener. Alle reaktioner blev udført i triplikater. Hver 25 gl reaktionsvolumen indeholdt 25 ng cDNA skabelon i 10 pi RNase-frit PCR gradueret vand, 2,5 pi 10x QuantiTect Primer Assay og 12,5 pi 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen). PCR blev udført i to trin med en cyklus på 95 ° C i 15 minutter (første fase) og 40 cykler ved 94 ° C i 15 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 40 s (andet trin).