PLoS ONE: Hæmning af oxidativ stress-fremkaldte AKT Activation Letter PPARy agonist-medieret hæmning af Stem Cell Character og Tumor Vækst af leverkræft Cells

Abstrakt

Nye beviser tyder på, at tumor-initierende celler (tics) er den mest malign celle subpopulation i tumorer på grund af deres resistens mod kemoterapi eller strålebehandling. Målretning TIC kan være en vigtig nyskabelse for kræftbehandling. I denne undersøgelse fandt vi, at PPARy-agonister inhiberede cancer stamcelle-lignende fænotype og svækkede tumorvækst af humant hepatocellulært carcinom (HCC) celler. Reaktive ilt arter (ROS) igangsat af NOX2 opregulering var delvist ansvarlig for de hæmmende virkninger medieret af PPARy-agonister. Imidlertid PPARy agonist-medieret ROS produktion markant aktiveret AKT, som igen fremmet TIC overlevelse ved at begrænse ROS-generering. Inhibering af AKT, enten farmakologiske hæmmere eller AKT siRNA, signifikant forøget PPARy agonist-medieret inhibering af celleproliferation og stamcelle-lignende egenskaber i HCC-celler. Vigtigere, i nøgne mus inokuleret med HCC Huh7 celler, demonstrerede vi en synergistisk hæmmende virkning af PPARy agonist rosiglitazon og AKT inhibitoren triciribin på tumorvækst. Afslutningsvis bemærkede vi en negativ feedback loop mellem oxidativ stress og AKT hyperactivation i PPARy agonist-medierede undertrykkende virkninger på HCCs. Kombinatoriske anvendelse af en AKT-inhibitor og en PPARy agonist kan give en ny strategi for hæmning af stamceller celle-lignende egenskaber i HCCs og behandling af leverkræft

Henvisning:. Liu L, Yang Z, Xu Y, Li J Xu D, Zhang L, et al. (2013) Hæmning af oxidativ stress-fremkaldte AKT Activation Letter PPARy agonist-medieret hæmning af Stem Cell Character og Tumor Vækst af Liver kræftceller. PLoS ONE 8 (8): e73038. doi: 10,1371 /journal.pone.0073038

Redaktør: Yin Tintut, University of California, Los Angeles, USA

Modtaget: April 6, 2013; Accepteret: 16. juli 2013; Udgivet: 30 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af kinesisk National Key Project (2013ZX10002-011). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) rangerer som den femte mest almindelige kræftform i verden. Imidlertid HCC har en høj grad af kemoterapi-modstand og en høj forekomst af tilbagefald og metastaser efter kirurgisk behandling, som gør det som den tredje hyppigste årsag til kræft dødelighed [1], [2]. Flere undersøgelser har vist, at HCC kan stamme fra en subpopulation af stamceller-lignende celler, kaldet tumor-initierende celler (TIC) eller cancer stamceller, som er kendetegnet ved ekspressionen af ​​specifikke overflademarkører og display selvfornyelse, differentiering, tumorinitiering og drug-resistens [3] – [10]. Selvom stoffet sorafenib nylig er blevet godkendt til HCC behandling, har begrænsede overlevelse fordele for patienter med sen-fase HCC og ingen stærk effekt på tumor metastase vist [11], [12]. Derfor kan alternative terapeutiske modaliteter til at eliminere eller begrænse subpopulationen af ​​TIC være en effektiv strategi for HCC behandling.

peroxisomproliferatoraktiveret receptor γ (PPARy) er en ligand-afhængig transskription faktor, der tilhører den nukleare hormon receptorsuperfamilie. Agonisterne for aktivering af PPARy omfatter endogene lipofile ligander, såsom 15-deoxy-Δ

12,14-prostaglandin J

2 (15d-PGJ

2) og fedtsyrer, samt det syntetiske thiazolidindioner (en klasse af anti-diabetiske lægemidler), herunder rosiglitazon, troglitazon, ciglitazon, pioglitazon og englitazon [13]. Ligandaktivering af denne transkriptionsfaktor fører til ekspression af målgener at styre mange essentielle fysiologiske processer, såsom metabolisme, celledifferentiering, apoptose, og vævsinflammation [14]. PPARy-agonister er også blevet vist at standse celleproliferation, inducere apoptose, fald celleadhæsion og migrering, og fremme differentiering af cancerceller af forskellig oprindelse [15] – [22]. PPARy blokerer carcinogenese og invasive og metastatiske potentiale HCC [23], [24], hvilket indikerer, at anvendelsen af ​​PPARy-agonister kan være en terapeutisk perspektiv for HCC behandling. Interessant nok har PPARy-agonister er for nylig blevet impliceret i kørsel ET-743-medieret differentiering af myxoid runde celle liposarkom [15] og inhibering af tics hos hjernekræft [25].

I denne undersøgelse viste vi, at PPARy agonister (15d-PGJ

2 eller rosiglitazon) effektivt hæmmede stamceller celle-lignende egenskaber i human lever kræftceller, og at NADPH oxidase-2 (NOX2) -induceret reaktive ilt arter (ROS) generation fungerede som en vigtig nedstrøms begivenhed. Som en negativ feedback reaktion, forøget ROS fremkaldte hyperaktivering af AKT, som i væsentlig grad modvirket PPARy agonist-medieret inhibering af stamcellelignende egenskaber i HCC-celler.

In vivo

forsøg viste endvidere, at forstyrrelse af den negative feedback loop af AKT-inhibitor triciribin betydeligt lettet PPARy agonist rosiglitazon-medieret hæmning af tumorvækst. Disse resultater tyder på, at kombinationen af ​​en AKT-inhibitor og en PPARy agonist kan give en lovende potentiel behandling af leverkræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyr eksperimentel protokoller blev godkendt af Medical Experimental Animal Care udvalg af Shanghai Cancer Institute (Godkendelse ID. ShCI-11-020).

Cell Culture

SK-HEP1 og Hep3B cellelinjer blev opnået fra amerikansk Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Huh7 cellelinie var fra Riken Cell Bank (Tsukuba Science City, Japan). SMMC 7721 cellelinje blev leveret af Patologisk Institut for Anden Military Medical University (Shanghai, Kina) [26]. Alle cellelinier blev dyrket i DMEM med høj glucose (GIBCO, Grand Island, NY) suppleret med 10% føtalt bovint serum (GIBCO) og penicillin /streptomycin (1% [v /v]; GIBCO) ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. Efter cellerne oprindeligt blev dyrket, flere portioner blev kryokonserveret og alle cellelinjer blev anvendt inden for 6 måneder efter genoplivning.

For behandling eksperimenter blev cellerne belagt og vokset i løbet natten, blev mediet derefter erstattet med høj-glucose DMEM medium indeholdende 1% føtalt bovint serum, og inkuberet med 15d-PGJ

2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), rosiglitazon (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), N-acetylatedcysteine ​​(NAC) (Calbiochem, Darmstadt, Tyskland), triciribin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), og /eller LY294002 (Sigma-Aldrich), i de angivne tidsrum. Alle forsøg blev udført tre gange.

Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) analyse

Efter inkubation under angivne dyrkningsbetingelser, celler blev dissocieret og vasket to gange med PBS indeholdende 0,5% BSA ved 4 ° C. PE-konjugeret anti-humant CD133-antistof (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) blev tilsat til inkubation ved 4 ° C i 30 minutter. Flowcytometri blev udført på FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA). Rotte IgG1 /κ antistof konjugeret til phycoerythrin tjente som en isotypekontrol. Døde celler blev udelukket ved farvning med 7-AAD (Sigma-Aldrich) før analyse. For celle sortering, CD133

+ eller GFP

+ celler blev stringent indhegnet og isoleret ved hjælp af en MoFlo XDP (Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Cell Levedygtighed Assay

Cell levedygtighed blev bestemt ved 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium (MTT) (Sigma-Aldrich) metode. Kort sagt /i alt 1000 celler brønd blev podet i 96-brønds plade i et endeligt volumen på 200 pi. Efter inkubation med 15d-PGJ

2 for de angivne tidspunkter blev 20 pi MTT-opløsning (5 mg /ml i PBS) tilsat til mediet og dyrket i yderligere 3 timer. Derefter blev MTT-opløsning kasseres, og 150 pi dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich) blev tilsat til hver brønd. Absorbansen af ​​hver brønd blev målt ved en bølgelængde på 540 nm.

Apoptose Assay

Omfanget af apoptose blev vurderet ved Pharmingen ™ FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) ifølge den forudsat producentens anvisninger. Derefter blev Fluorescens-aktiveret cellesortering analyse gennemført på FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences). Enkelt farvning under anvendelse Annexin V-FITC eller 7-AAD alene blev udført som kontroller.

BrdU Assay

Pharmingen ™ APC BrdU Flow Kit (BD Biosciences) blev anvendt til bromdeoxyuridin (BrdU) inkorporering assay i overensstemmelse med producentens anvisninger.

RNA Extraction og Real-time PCR

Total RNA blev isoleret fra celler med RNAiso Reagent (Takara, Dalian, Kina). Revers transkription (RT) blev udført under anvendelse 500 ng af total RNA til cDNA-syntese i en 10 pi reaktionsvolumen ved anvendelse af PrimeScript ™ RT reagenskittet (Takara) ifølge producentens instruktioner. Brug Premix Ex Taq ™ (Takara) blev kvantitativ PCR udført for

Nanog

,

OCT4

, og

AFP

. Til påvisning af

Notch1

,

SMO

,

NOX2, NOX4, P22

phOx, P47

phOx, P67

phOx

og

Rac

ekspression, kvantitativ realtids-PCR blev udført ved anvendelse SYBR green mix fra TaKaRa på en 7300 real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA).

GAPDH

blev anvendt som en intern kontrol. Primerne er anført i tabel S1.

Små interfererende RNA (siRNA) Transfektion

Den specifikke til siRNA’er

NOX2

,

PPARy

,

Akt1

og

AKT2

blev købt fra Sigma-Aldrich. SiRNA sekvenser er anført i tabel S2. En dag før transfektion blev celler udsået i seks-brønds plader uden antibiotika. De siRNA’er (60 nM) blev transficeret ind i celler med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carisbad, CA) ifølge producentens instruktioner.

Western blotting-analyse

Celler blev lyseret i en RIPA-lysepuffer ( Beyotime, Nantong, Kina), der indeholder Protease Inhibitor Cocktail og PhosSTOP phosphataseinhibitor (Roche, Monza, IT). Proteiner blev analyseret ved anvendelse viste antistoffer: anti-CD133, anti-PPARy, anti-AKT, anti-phospho-AKT (Ser473) (alle fra Cell Signaling Technology, Beverly, MA); anti-GAPDH, anti-α-tubulin (alle fra Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); og anti-NOX2 (Abcam, Cambridge, UK). Den ChemiDoc ™ XRS systemet (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) blev anvendt til at opnå billeder.

Sfæroide-dannende assay

Enkelte celler blev podet i ultralave fastgørelse dyrkningsskåle (Costar , Coring, NY) ved en densitet på 500 celler /ml i et serumfrit 01:01 DMEM: F12 (GIBCO), suppleret med B27 (1:50; GIBCO), 20 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF) og 20 ng /ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) (R 0,05; **,

P

0,01, versus kontrol celler. B, blev Huh7-celler behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 i de angivne tidsrum og farvet med CD133-PE. Før analyse blev 7-AAD anvendes til at udelukke døde celler. Repræsentative FACS-profiler er vist (venstre panel). Procentdele af CD133

+ celler er vist som midlet ± S.E.M (n = 3) (højre panel). *,

P

0,05; **,

P

0,01. C, Huh7 celler blev behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 i 24 timer og totalt protein blev ekstraheret til analyse af CD133 ekspression. Alle prøver blev normaliseret til GAPDH-ekspression. D, Huh7 celler blev behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 i 24 timer. Celler blev høstet for BrdU inkorporering og CD133 farvning. Kvantitative søjlediagrammer præsenteres som middelværdier ± standardfejl (n = 3). *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001, versus kontrol celler. E, Huh7 celler blev dyrket i sfæroid-dannende medium indeholdende 15d-PGJ

2 (1 ug /ml) i 7 dage. Repræsentative mikroskopiske billeder vises (venstre panel). Scale bar = 100 um. Kvantitative søjlediagrammer er vist som middel ± S.E.M. (N = 3) (højre panel). *,

P

. 0,05

For at underbygge vores observationer med

in vivo

eksperimenter, vi behandlede mus med GFP

+ Huh7 tumorer med en PPARy agonist. Fordi den biologiske aktivitet af 15d-PGJ

2 er normalt begrænset

in vivo

[30], [31], rosiglitazon, en syntetisk PPARy agonist, blev brugt i

in vivo

eksperimenter ved en dosis på 100 mg /kg /dag (behandlingsplanen vist i figur 2A). En antitumorvirkning vækst effekt af rosiglitazon blev observeret (figur 2B). Tumorvækst blev inhiberet med ca. 60% (

P

0,001). Vi vurderede endvidere sfæroiden-dannende potentiale af tumorceller afledt fra kontrol og rosiglitazon-behandlede mus. Bemærkelsesværdigt, GFP

+ tumorceller isoleret fra primære tumorer i rosiglitazon-behandlede mus dannet mindre og færre kugler end dem fra kontrolgruppen (Figur 2C). Administration af 100 mg /kg /dag rosiglitazon også signifikant reduceret andelen af ​​GFP

+ CD133

+ tumorceller (figur 2D). Disse resultater antyder en fremtrædende inhiberende virkning af PPARy agonist på tumorvækst og stamcelle-lignende egenskaber hos HCC Huh7 celler

in vivo

.

GFP

+ Huh7 celler (2 x 10

6) var sc inokuleret i nøgne mus. Efter 4 dage blev mus med tumorer behandlet dagligt med vehikel eller rosiglitazon (100 mg /kg /dag) ved ig i 12 dage (n = 7 per gruppe). A, Skematisk oversigt over forsøgsopstillingen. B, er Originale billeder af xenotransplantattumorer vist (venstre panel). Tumorvægt blev målt ved slutningen af ​​behandlingen (højre panel). Hver prik repræsenterer vægten af ​​et individuelt xenograft tumor. Vandrette bjælker repræsenterer middelværdien ± SD (n = 7). ***,

P

0,001. C, tumorvæv fra kontrol og behandlede grupper blev enzymatisk dissocieret til encellede suspensioner og GFP

+ tumorceller blev høstet ved flow sortering og dyrket i sfæroid-dannende medium i 7 dage. Et repræsentativt fotografi er vist (venstre panel). Scale bar = 100 um. Et resumé søjlediagram (middelværdi ± SD) er vist i det højre panel. *,

P

0,05. D, den dissocierede enkelt tumorceller fra hver mus blev farvet med CD133-PE. Procentdelen af ​​GFP

+ CD133

+ celler blev bestemt ved flowcytometri. Repræsentative flowcytometrianalyse profiler er vist (venstre panel). Andelen af ​​CD133

+ -celler i GFP

+ tumorceller præsenteres som middelværdi ± SD (højre panel). ***,

P

. 0,001

PPARy agonister Inhibit Cancer stamcelle-lignende fænotyper via NOX2-afhængige ROS Generation

Det er blevet rapporteret, at PPARy-agonister inducerer ROS produktion i flere typer af cancerceller [32], [33]. Da er blevet observeret reguleringen af ​​celledifferentiering at være en kritisk funktion af ROS [34], [35], undersøgte vi muligheden for, at ROS produktion bidrog til PPARy agonist-induceret undertrykkelse af stamceller celle-lignende egenskaber i HCC celler. Vi først testede ROS niveauer i HCC celler efter udsættelse for 15d-PGJ

2. Resultaterne viste, at niveauerne af intracellulær ROS dramatisk blev forøget i både Huh7 og SK-HEP1-celler efter behandling med 15d-PGJ

2 i 72 timer (Figur S2a). Vi isoleres yderligere CD133

+ subpopulationer fra Huh7 celler ved FACS sortering og dyrket dem i nærvær eller fravær af 15d-PGJ

2 og antioxidanten NAC, et forstadium af intracellulær glutathion som inhiberer ROS-produktion. Efter 3 dage i kultur, blev procentdelen af ​​CD133

+ -celler i kontrolcellerne reduceret til 74.84%, hvorimod 15d-PGJ

2-behandling forårsagede signifikant større fald i andelen af ​​CD133

+ -celler i en dosisafhængig måde (figur 3A). Påfaldende, hyppigheden af ​​CD133

+ -celler blev nedsat til 20,39%, når koncentrationen af ​​15d-PGJ

2 var 1,0 ug /ml. Imidlertid NAC behandling robust svækkede dette 15d-PGJ

2-medieret hæmning og bevaret CD133

+ rum (figur 3A). I overensstemmelse med denne observation, den inhiberende virkning af 15d-PGJ

2 på sfæroide-dannelse blev dramatisk formindsket, da Huh7 celler blev forbehandlet med NAC (figur S2B). Desuden NAC svækkede også faldet i ekspressionen af ​​stemness-relaterede gener i både Huh7 og SK-HEP1 celler (Figur S2C). Disse observationer antyder, at PPARy-agonister hæmmede cancer stamcellelignende fænotyper gennem positiv regulering af ROS-produktion. Hertil kommer, udtømning af PPARy af siRNA kun havde subtile effekter på ROS generation fremkaldt af 15d-PGJ

2 (figur S3), hvilket indikerer, at PPARy behandlingsresultater i ROS induktion hovedsagelig gennem en PPARy-uafhængig vej.

A, Isoleret CD133

+ Huh7 celler blev behandlet med 15d-PGJ

2 (0,5, 0,75 eller 1,0 ug /ml) og NAC (10 mM), enten alene eller i kombination, og procentdelen af ​​CD133

+ -celler blev påvist ved flowcytometri efter 72 timer. B, blev Huh7-celler behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 i de angivne tidsrum. Ekspressionen af ​​mRNA af NADPH oxidase generne (

NOX2

NOX4

) blev målt ved kvantitativ RT-PCR. Data er middelværdier ± S.E.M. (N = 3). ***,

P

0,001. C, Huh7 celler blev behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 i 24 timer. Udtrykket

P22

phOx, P47

phOx, P67

phOx

og

Rac

mRNA blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR. *,

P

0,05; **,

P

0,01. D, Huh7 og SK-HEP1 celler blev behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 i de angivne tidsrum og totalt protein blev ekstraheret til analyse af NOX2 ekspression. E, Huh7 celler blev transient transficeret med negativ kontrol siRNA eller NOX2 siRNA-3, hvorefter cellerne blev podet på ultralave fastgørelse dyrkningsskåle og dyrket i sfæroid-dannende medium indeholdende 15d-PGJ

2 i 7 dage. Antal sfæroider dannet er vist som middel ± S.E.M. (N = 3). *,

P

0,05. F, Huh7 celler blev transient transficeret med negativ kontrol siRNA eller NOX2 siRNA-1. Celler blev behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 i 72 timer og farvet med CD133-PE. Data er middelværdier ± S.E.M. (N = 3). *,

P

0,05; **,

P

. 0,01

NADPH oxidase (NOX) familie af proteiner er ansvarlig for ROS produktion [36]. For at afgøre om NADPH oxidaser opreguleres og contributable den øgede ROS generation af stimulering af PPARy-agonister, vi analyserede den overflod af forskellige

NOX

mRNA, herunder

NOX2

NOX4

, i celler behandlet med 15d-PGJ

2. Udtrykket af

NOX2

NOX4

blev straks opreguleres, startende ca. 3 timer efter behandling med 15d-PGJ

2 (figur 3B). Desuden fandt vi, at transfektion af siRNA’er specifikke for

NOX4

ikke forringe 15d-PGJ

2-induceret ROS generation (data ikke vist), mens mRNA niveauerne af flere store NOX2 komponenter, såsom

P22

,

P47

,

P67

Rac

blev øget betydeligt i 15d-PGJ

2-behandlede Huh7 celler (figur 3C) . Endvidere blev proteinniveauet af NOX2 især forhøjede i både Huh7 og SK-HEP1 celler efter behandling med 15d-PGJ

2 (figur 3D). Vi yderligere depleteret NOX2 udtryk med specifikke siRNA’er i både Huh7 og SK-HEP1 celler, og fandt, at NOX2-depleteret celler udviste en svagere fremkaldelse af ROS i afhængighed 15d-PGJ

2 behandling sammenlignet med celler transficeret med kontrol siRNA (figur S4A). Effektiviteten af ​​

NOX2

siRNA’er på inhibering NOX2 ekspression blev valideret ved Western blotting og kvantitativ RT-PCR-analyse (figur s4b og C). Faktisk nedregulering af NOX2 modvirket 15d-PGJ signifikant

2-medieret hæmning af klumpformet dannelse og pool størrelse CD133

+ delmængde i Huh7 celler (Figur 3E og F). Tilsammen indikerer disse resultater, at opregulering af NOX2 var ansvarlig for PPARy agonist-medieret hæmning af stamceller celle-lignende egenskaber i HCC-celler.

Gensidig forordning af ROS Generation og AKT Aktivering i PPARy agonist-behandlede HCC Cells

Næste, vi udforsket mulige ændringer i de signalveje, der regulerer virkningerne medieret af de PPARy-agonister. Interessant nok fandt vi, at både 15d-PGJ

2 og rosiglitazon drastisk forbedret phosphoryleringen af ​​AKT, og dette PPARy agonist-induceret aktivering af AKT blev svækket ved NAC i Huh7-celler (figur 4A). Et lignende fænomen også forekom i SK-HEP1 celler (data ikke vist). Disse data indikerer, at PPARy agonist-induceret ROS forårsagede AKT hyperaktivering. For at undersøge den mulige sammenhæng mellem AKT aktivering og ROS produktion, brugte vi AKT-inhibitor triciribin og PI3K-inhibitor LY294002 at undertrykke AKT-aktivitet, og vi fandt, at en dosis- eller tidsafhængig undertrykkelse af AKT-phosphorylering blev parallelt med en gradvis trinvis ændring i NOX2 ekspression (figur 4B og C). Desuden kombinatorisk behandling af Huh7-celler med både 15d-PGJ

2 og triciribin førte til et højere niveau af intracellulære ROS end enten alene behandling (figur 4D). Denne synergistiske virkning blev også observeret i celler co-behandlet med 15d-PGJ

2 og LY294002 (figur 4E). Vi bekræftede yderligere vores observationer ved hjælp specifikke siRNA’er mod Akt1 og AKT2. SiRNA mod Akt1 yderligere forøget ROS-induktion i nærværelse af 15d-PGJ

2 (figur 4F). Effektiviteten af ​​Akt1- og AKT2 siRNA’er til inhibering total og phosphoryleret AKT ekspression blev valideret ved Western blotting-analyse (Figur 4F). Taget sammen antyder disse resultater, at PPARy agonist-induceret AKT aktivering moduleret NOX2-medieret ROS-generering via negativ feedback.

A blev Huh7-celler forbehandlet med NAC (10 mM) i 30 minutter efterfulgt af 15d-PGJ

2 (0,5 ug /ml) i den yderligere angivne tidspunkter (øverste panel). Huh7-celler blev behandlet med rosiglitazon (5, 20 eller 50 uM) og NAC (10 mM), enten alene eller i kombination i 6 timer (nederste panel). Totalt protein blev ekstraheret til analyse af P-AKT, AKT, og GAPDH-ekspression. B, Huh7-celler blev behandlet med AKT-inhibitor triciribin i 3 timer og totalt protein blev ekstraheret til analyse af NOX2, P-AKT, AKT, og GAPDH-ekspression. C, Huh7 celler blev behandlet med LY294002 (10 uM) i de angivne tidsrum, og proteinniveauet af NOX2 blev undersøgt ved Western blotting-analyse. D, Huh7 celler blev behandlet med 15d-PGJ

2 og triciribin enten alene eller i kombination i 48 timer, hvorefter de blev mærket med DHE og analyseret ved flowcytometri. Data er middelværdier ± S.E.M. (N = 3). *,

P

0,05; **,

P

0,01. E, Huh7 celler blev behandlet med 15d-PGJ

2 og LY294002 enten alene eller i kombination i 72 timer, hvorefter de blev mærket med DHE og analyseret ved flowcytometri. Data er middelværdier ± S.E.M. (N = 3). *,

P

0,05; **,

P

0,01. F, Huh7 celler blev transient transficeret med Akt1 siRNA og AKT2 siRNA enten alene eller i kombination, hvorefter cellerne blev behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 i yderligere 3 timer (venstre panel). Niveauerne af P-AKT og AKT proteiner blev målt ved Western blotting-analyse. Huh7-celler blev transient transficeret med negativ kontrol siRNA eller Akt1 siRNA, hvorefter cellerne blev behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ

2 i yderligere 72 timer (højre panel). Intracellulær ROS-produktion blev analyseret ved flowcytometri (gennemsnit ± S.E.M, n = 3). *,

P

. 0,05

Den AKT Inhibitor triciribin Samarbejder med PPARy agonister til at hæmme kræft stamcelle-lignende fænotyper og Tumor vækst

De nævnte resultater fik os til at spekulere, at den kombinerede behandling af en PPARy agonist og en AKT-inhibitor kan inhibere tumorvækst mere effektivt end både reagens alene. Vi evaluerede først, om triciribin øget følsomhed over HCC-celler til PPARy agonist-induceret apoptose. Faktisk, i begge Huh7 og SK-HEP1 celler, kombinationen af ​​triciribin med 15d-PGJ

2 eller rosiglitazon markant forbedret induktion af apoptose sammenlignet med enten alene (figur 5A). Interessant, fandt vi, at kombinationsbehandling af Huh7 celler med både 15d-PGJ

2 og triciribin forårsagede ikke et yderligere fald i andelen af ​​CD133

+ celler sammenlignet med behandling af 15d-PGJ alene

2. Imidlertid kombinationsbehandlingen var mere effektiv til at hæmme celleproliferation i Huh7-celler sammenlignet med behandling af enten individuelle middel alene (figur 5B), hvilket indikerer, at kombinationen behandling faldt yderligere det absolutte antal CD133

+ Huh7 celler. I celler behandlet med både 15d-PGJ

2 og triciribin, fandt vi, at antallet af CD133

+ celler blev reduceret med 70,9%, hvilket var højere end de 46,1% i 15d-PGJ

2 behandlede celler (figur 5C). Tilsvarende blev antallet af CD133

+ celler reduceret med 89,6% med kombinationsbehandling af rosiglitazon og triciribin, højere end de 37,5% med rosiglitazon behandling alene (figur 5C). Desuden kombinationsbehandlingen undertrykt klumpformet dannelse af Huh7 celler mere væsentligt end både 15d-PGJ

2 eller AKT-inhibitor alene (figur 5D). Disse data indikerer, at AKT hæmning af triciribin kan have forværret de hæmmende virkninger af PPARy-agonister på befolkningen i CD133

+ celler ved direkte at inducere celledød.

A, Huh7 og SK-HEP1 celler blev behandlet med 15d-PGJ

2, rosiglitazon og triciribin enten alene eller i kombination. Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev vurderet 48 timer senere ved Annexin V-FITC /7-AAD-farvning. Data er middelværdier ± S.E.M. (N = 3). *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001. *,

P

0,05; **,

P

0,01. Scale bar = 100 um. *,

P

0,05; **,

P

0,01. *,

P

0,05; Scale bar = 100 um. *,

P

0,05; *,

P

0,05; **,

P

0,01.