PLoS ONE: Gene Expression Signature Analyse Identificerer Vorinostat som kandidat terapi for gastrisk Cancer

Abstrakt

Baggrund

mavekræft fortsætter med at være en af ​​de dødeligste kræftformer i verden, og derfor identifikation af nye lægemidler rettet mod denne form for kræft er derfor af stor betydning. Formålet med denne undersøgelse var at identificere og validere et terapeutisk middel, som kunne forbedre resultaterne for mavecancerpatienter i fremtiden.

Metodologi /vigtigste resultater

Brug microarray teknologi, genereret vi et gen ekspressionsprofil af humane gastriske cancer-specifikke gener fra humane gastriske cancer vævsprøver. Vi brugte denne profil i de overordnede instituttets Connectivity Kort analyse for at identificere kandidat terapeutiske forbindelser for mavekræft. Vi fandt histondeacetylaseinhibitoren vorinostat som ledende forbindelse og dermed en potentiel terapeutisk lægemiddel til mavekræft. Vorinostat induceret både apoptose og autofagi i gastrisk cancer cellelinjer. Farmakologisk og genetisk hæmning af autophagy dog ​​øget den terapeutiske effekt af vorinostat, hvilket indikerer, at en kombination af vorinostat med autofagi hæmmere terapeutisk kan være mere gavnligt. Desuden genekspression analyse af gastrisk kræft identificeret en samling af gener (

ITGB5, Tyms, MYB, APOC1, CBX5, PLA2G2A

og

KIF20A

) hvis udtryk blev forhøjet i gastrisk tumorvæv og nedreguleret mere end 2 gange ved vorinostat behandling i gastriske cancercellelinier. I modsætning hertil

SCGB2A1, TCN1, CFD, APLP1

og

NQO1

manifesteret en omvendt mønster.

Konklusioner /Betydning

Vi viste, at en analyse af genekspression signatur kan repræsentere en ny tilgang til at opdage terapeutiske midler til gastrisk cancer, såsom vorinostat. Observationen af ​​ændret genekspression efter vorinostat behandling kan give fingerpeg til at identificere den molekylære mekanisme for vorinostat og de patienter forventes at få gavn af vorinostat behandling

Henvisning:. Claerhout S, Lim JY, Choi W, Park YY, Kim K, Kim SB, et al. (2011) Gene Expression Signature Analyse Identificerer Vorinostat som kandidat terapi for mavekræft. PLoS ONE 6 (9): e24662. doi: 10,1371 /journal.pone.0024662

Redaktør: David L. McCormick, IIT Research Institute, USA

Modtaget: 29, 2011; Accepteret: August 16, 2011; Udgivet: 9 September, 2011

Copyright: © 2011 Claerhout et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding til SC som en Odyssey Fellow blev støttet af Odysseen Program og Theodore N. Law Endowment for videnskabelig Achievement ved University of Texas MD Anderson Cancer center. Dette arbejde blev også støttet af midler fra 2009 Intern Medicin Academic Research Fund og Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (nr 2010 til 0.024.248). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den fjerde mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald i verden [1], med en samlet overlevelse på omkring 10 måneder [2] – [4]. Behandling af gastrisk cancer kan omfatte kemoterapi, kirurgi og strålebehandling. Desværre, nuværende kemoterapi-baserede behandlinger af fremskreden mavekræft viser skuffende resultater [2] – [4]. Faktisk komplet remission er sjældne eller kun vare meget længe.

Flere målrettede midler, der giver overlevelse fordele i andre typer kræft har været under efterforskning i mavekræft. Mens nogle tidlige kliniske undersøgelser under anvendelse af vaskulær endotel vækstfaktor receptor (VEGFR) og epitelial vækstfaktor receptor (EGFR) -1 inhibitorer, såsom cetuximab og bevacizumab, har vist noget aktivitet, der er sjældent en egentlig overlevelse fordel for patienterne [5] [6]. En af grundene kan være, at disse undersøgelser ikke valgte patienter i henhold til tilstedeværelsen af ​​biomarkører. For nylig har Trastuzumab for mavecancer (ToGA) forsøg bemærkede, at tilsætningen af ​​trastuzumab til kemoterapi førte til en statistisk signifikant forbedring i progressionsfri overlevelse (PFS) og samlet overlevelse (OS) i ca. 20% af patienter med dissemineret gastrisk og gastroøsofageal (GE) junction tumorer overudtrykker HER2 [7]. Dette understreger behovet for målrettet biologisk terapi og søgen efter biomarkører til at vælge patienter til kliniske forsøg, der kan omfattes overlevelse. Trods nogle beviser for potentielle mål, herunder HER2 [8], [9], er effektiviteten af ​​disse biologisk målrettede behandlinger ikke kendt, og der er mangel på en standard målrettet terapi for mavekræft. På grund af den biologiske heterogenitet af gastriske cancere, er det usandsynligt, at der er en enkelt “magisk kugle” helbredelse. Molekylære markører bliver således vigtigt i fremtiden at forudsige patienternes resultater og skræddersy behandlinger efter individuel biologi.

I søgen efter biomarkører, genekspression signatur analyse er blevet brugt i forskellige applikationer, såsom til at belyse mekanismer i biologiske veje [10], klassificering undertyper af en sygdom [11], forudsige kræft prognose [12] og profilering genekspression som reaktion på specifikke lægemidler [13], [14]. Gen-ekspression signatur analyse kan gøres ved hjælp af De overordnede Instituttets Connectivity kort (https://www.broadinstitute.org/cmap). Connectivity Kort til formål at generere et kort, der forbinder genekspression mønstre forbundet med sygdommen til tilsvarende mønstre produceret af lægemiddelkandidater og genetiske manipulationer [15], [16]. Dette systemer tilgang giver forbindelser, der skal screenes mod genom-dækkende sygdomstilstande signaturer, snarere end en forudvalgt sæt af målgener. Lægemidler parret med sygdomme ved hjælp af avanceret mønster-matching metoder med en høj grad af opløsning og specificitet. Selvom det efterlader mange åbne spørgsmål, har Connectivity Kort vist, at genomisk signatur analyse kan anvendes til at genkende lægemidler med fælles mekanismer for aktioner, opdage ukendte virkningsmekanismer og identificere nye potentielle lægemidler [15], [16].

formålet med denne undersøgelse var at identificere potentielle nye terapeutiske midler til behandling af gastrisk cancer. For at gøre dette, vi først analyseret den genomiske underskrift af menneskets mavekræft. Den resulterende mavekræft gen signatur blev derefter brugt

i silico

ved at ansætte Connectivity Kort analyse for at identificere terapeutiske midler, der potentielt kan være effektive mod denne form for kræft. Vi yderligere valideret toppen målrette lægemiddel til dets effektivitet i gastrisk cancer cellelinjer. Vi fandt, at vorinostat, som en potentiel nyt lægemiddel, induceret både apoptose og autofagi i gastriske kræftceller. Sammen viser denne undersøgelse, at Connectivity Kort analyse kan anvendes til identifikation af terapeutiske midler, der kan blive en succes i behandlingen af ​​en delmængde af gastrisk kræft.

Metoder

Analyse af microarray data

for Connectivity Kort analyse, brugte vi microarray data 65 mavecancerpatienter, herunder 65 kræftformer og 19 normale gastriske væv, der blev opnået fra vores tidligere arbejde, Yonsei oplysninger [17]. Tumor prøver blev indsamlet fra gastrisk kræftpatienter i gastrektomi som en primær behandling. Vævsprøver blev undersøgt af patologer ved indsamling og opbevaret i -80 ° C ved vævsbank indtil starten af ​​forsøget. Totalt RNA blev ekstraheret fra frisk frosset væv ved anvendelse af en Mirvana RNA-isolering mærkning kit (Ambion, Inc.). Primær microarray data er tilgængelige i NCBI s Gene Expression Omnibus offentlige database (microarray platform, GPL6884, microarray data, GSE 13861). En anden genekspressionsprofilen blev opnået fra 69 gastriske vævsprøver, herunder 38 cancer og 31 non cancer stroma, af Stanford Microarray Database (https://smd.stanford.edu, GSE13911), Stanford data. Mavekræft-specifikke gener blev udvalgt af BRB-ArrayTools versionen 3.6.1 (biometrisk Research Branch, National Cancer Institute, Bethesda, MD). Klasse sammenligning i to prøve t-test (størrelsen 0,001, 10,000 tilfældig permutation) identificerede gastrisk cancer specifikke gener og gener, hvis betyde ekspression intensiteter blev ændret ved mindst to gange sammenlignet med betyde normalt væv genekspression blev selekteret

.

Forbindelse Kort analyse

for at identificere potentielle lægemidler rettet mod mavekræft, gen lister over top 500 op reguleret og top 500 ned regulerede gener fra mavekræft-specifikke gener blev brugt (tabel S1). Connectivity Kort analyse blev foretaget via Web interface (https://www.broadinstitute.org/cmap) bruger version, bygge 02, som indeholder mere end 7.000 udtryk profiler repræsenterer virkninger af 1.309 forbindelser på flere dyrkede humane celler [15], [16]. Den Connectivity Kortet viser funktionelle forbindelser mellem narkotika, gener og sygdomme. Lægemidler, som producerer sygdomsfremkaldende efterligner gen signaturer kan hjælpe med at identificere veje, der repræsenterer potentielle terapeutiske mål for denne sygdom. Omvendt kan lægemidler, der inducerer en “omvendt” signatur, dvs. ændringer i genekspression i en retning modsat den, der observeres i sygdomstilstanden, udgør nye terapeutiske midler. Kandidatmidler over for en specifik sygdom kan genkendes ved anvendelse af sygdom specifik genekspression profil til Connectivity Map analyse. Vi valgte lægemiddelkandidater til validering

in vitro

på grundlag af tilslutningsmuligheder score, korrelation, og P-værdi.

Kemikalier og cellekultur

Vorinostat blev opnået fra Merck og fremstillet som en stamopløsning i dimethylsulfoxid (DMSO). Chloroquin og bafilomycin A1 (Sigma) blev opløst i henholdsvis vand og DMSO. Humane gastriske cancercellelinier AGS, NCI-N87, og KATO-III blev opnået fra American Type Culture Collection og blev opretholdt i henhold til deres anbefalinger. Celler blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i 5% CO

2.

cellevækst, levedygtighed og cellecyklus assays Salg

i den 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) assay blev MTT opløst i PBS ved 5 mg /ml. Ca. 5 x 10

3-celler blev podet i plader med 96 brønde og lodes binde natten over. Dyrkningsmediet blev derefter erstattet med frisk medium indeholdende de angivne koncentrationer af vorinostat eller DMSO. Efter 72 timer blev 20 pi MTT-opløsning tilsat, og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Efter inkubering blev 100 pi DMSO tilsat for at opløse formazan, og absorbansen blev aflæst ved 570 nm under anvendelse af en spektrofotometrisk mikrotiterpladelæser (Vmax kinetisk mikropladelæser, Molecular Devices). Forsøgene blev udført tre gange.

I krystalviolet-farvning blev celler behandlet i 12 timer, blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket med PBS og derefter inkuberet i 30 minutter med 0,5% krystalviolet (i 20% methanol og 80% dobbelt-destilleret vand). Cellerne blev derefter vasket tre gange med PBS. Den resterende krystalviolet blev ekstraheret i eddikesyre i 5 minutter, og absorbansen blev målt ved 595 nm under anvendelse af en spektrofotometrisk mikropladelæser.

For at bestemme cellelevedygtighed, blev celler inkuberet med vorinostat i 72 timer. Adhærente celler blev derefter frigjort fra dyrkningsplader ved trypsinisering og kombineret med flydende celler, centrifugeret og suspenderet i 500 pi propidiumiodid (PI) Eksklusiv opløsning (ikke cellemembranen gennemtrængende) i 15 minutter ved 4 ° C. Farvede celler blev overvåget ved flowcytometri (Beckman Coulter Cytomics FC 500).

I cellecyklusanalyse blev celler inkuberet med vorinostat i 24 timer, opsamlet og suspenderet i 500 pi hypotonisk opløsning (0,1% natriumcitrat, 0,1% Triton X-100, 100 pg /ml RNase og 50 ug /ml PI) i 15 minutter ved 4 ° C. PI-farvede celler blev monitoreret ved flowcytometri. Cell cyklus blev analyseret ved multicycle AV software.

RNA isolation og microarray eksperimenter

RNA isolering og microarray eksperimenter blev udført i overensstemmelse med den protokol, som tidligere beskrevet [17]. Totalt RNA blev ekstraheret fra gastriske cancercellelinier med eller uden vorinostat behandling under anvendelse af en Mirvana RNA-isolering kit (Ambion, TX, USA). Integriteten af ​​det store RNA fraktion blev bestemt med en Experion Bioanalyzer (Bio-Rad, CA, USA) som et surrogat for mRNA kvalitetskontrol. Total RNA blev mærket og hybridiseret med human HT12 v.3 ekspressionssystemer BeadChips ifølge fabrikantens protokoller (Illumina, CA, USA). Efter BeadChips blev scannet med en Illumina BeadArray Reader blev microarray data normaliseret ved hjælp af den fraktil normalisering metode i Lineære Modeller for Microarray datapakke i R sproget miljø [18]. Udtrykket niveau hvert gen blev omdannet til en log

2 basen før yderligere analyse. Cluster analyse blev udført med Cluster og TreeView [19].

Western blot-analyse

Celler blev skrabet i medium og spundet ned, og proteiner blev isoleret ved anvendelse af lysepuffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA og 10 mM natriumpyrophosphat (pH 7,4)) indeholdende 100 mM NaF, 10% glycerol, 1,5 mM MgCl

2, 1% Triton X-100 og proteasehæmmer (Roche). Ekstrakter blev inkuberet på is i 20 minutter og centrifugeret ved 20800 g i 20 min. Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af BCA proteinassay reagens (Pierce). Lige store mængder protein fra hver prøve blev separeret ved elektroforese gennem SDS-PAGE og overført til Hybond-C super membran (Amersham Pharmacia Biotech). Membraner blev blokeret i 1 time ved stuetemperatur i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20 og 5% fedtfri tørmælk. Membraner blev inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistof fortyndet i 5% fedtfri tørmælk eller 5% BSA i 1 × Tris-bufret saltvand plus 0,1% Tween-20. Antistoffer mod LC3 (Novus Biologicals), aktive caspase-3 (Epitomics) og P62 (BD Biosciences) blev anvendt. Antistoffer til a-tubulin og beclin-1 var fra cellesignalering Technology; antistof til p-actin var fra Sigma. Membraner blev derefter vasket og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med peroxidase-konjugeret sekundært antistof (Cell Signaling Technology). Protein bands blev visualiseret ved hjælp af forøget kemiluminescens som beskrevet af producenten (GE Healthcare).

siRNA transfektion

siRNA target sekvens for beclin-1, nontargeting siRNA (Risiko Gratis) og Dharmafect 1 var indkøbt fra Dharmacon. Celler blev podet i 10 cm skåle og transficeret med siRNA 24 timer senere i henhold til fabrikantens protokol. Den næste dag blev cellerne trypsiniseret og podet i 6-cm eller 96-brønds plader for at opnå den samme transfektionseffektivitet. Protein-ekspressionsniveauer blev bestemt ved western blot-analyse.

Transmissionselektronmikroskopi

Prøver blev fikseret med en opløsning indeholdende 3% glutaraldehyd plus 2% paraformaldehyd i 0,1 M cacodylatbuffer, pH 7,3, i 1 time. Efter fiksering blev prøverne vasket og behandlet med 0,1% Millipore-filtreret cacodylat pufret garvesyre, efterfikseret med 1% bufret osmiumtetroxid i 30 minutter, og farvet en bloc med 1% Millipore-filtreret uranylacetat. Prøverne blev dehydreret i stigende koncentrationer af ethanol, infiltreret og indlejret i LX-112-medium. Prøverne blev polymeriseret i en 70 ° C ovn i 2 dage. Ultratynde snit blev skåret i en Leica Ultracut mikrotom (Leica, Deerfield, IL), farvet med uranylacetat og blycitrat i et Leica EM farvningsværktøjet og undersøgt i et JEM 1010 transmissionselektronmikroskop (JEOL, USA, Inc., Peabody, MA ) ved en accelererende spænding på 80 kV. Digitale billeder blev opnået ved hjælp af AMT Imaging System (Advanced mikroskopiteknikker Corp, Danvers, MA).

Resultater

Gen-ekspression underskrift mavekræft

Tabel 1 repræsenterer karakteristika patienterne fra Yonsei oplysninger [17]. Gastric kræftformer meste placeret i distale mave og stadie III /IV. Brug af genekspression microarray data for de patienter, fandt vi 3.360 tumorspecifikke gener, hvis betyde ekspression intensiteter blev ændret ved mindst to gange sammenlignet med betyde normalt væv genekspression (

P

0,001, figur S1 ). Dette sæt af 3.360 gener (dvs. mavekræft-specifik signatur) blev anvendt til yderligere

i silico

screening for potentielle terapeutiske lægemidler til mavekræft.

Connectivity Kort analyse identificerer potentielle lægemidler rettet mod mavekræft

for at identificere potentielle lægemidler rettet mod mavekræft, blev mavekræft specifikke signatur bruges som input forespørgsel i Connectivity Kort som beskrevet i “Metode” afsnittet. Vi specifikt søgt efter forbindelser, der havde en signatur omvendt korreleret med mavekræft-specifikke signatur og identificerede flere lægemidler, som er opsummeret i tabel 2. rangordning af kandidat agenter blev etableret baseret på omvendt korrelation værdi og p-værdi. Tabel 2 (kolonne 2-4) viser de højest rangerende forbindelser fra Yonsei data. Connectivity Kort analyse afslørede, at histon deacetylase (HDAC) inhibitorer, herunder vorinostat og trichostatin A repræsenterer potentielle kandidater til at målrette mavekræft. Phosphotidylinositol-3-kinase-inhibitoren LY294002, den phenothiazin trifluoperazin og varmechockproteinet inhibitor tanespimycin blev også identificeret som kandidat target midler til gastrisk cancer. Dernæst vi valideret vores resultater ved at bruge et uafhængigt sæt af genekspression profildata fra Stanford Microarray Database (Tabel 2, Stanford data, søjler 5-7). Connectivity Kort analyse af dette datasæt bekræftede vorinostat som de højest rangerede kandidat. Afslutningsvis Connectivity Kort analyse identificeret vorinostat som en potentiel terapeutisk middel til mavekræft.

Vorinostat viser terapeutisk effekt

in vitro

gastrisk cancer cellelinjer

Til evaluere den terapeutiske effekt af vorinostat, vurderede vi væksten af ​​etablerede gastrisk cancer cellelinier (AGS, KATO-III, og NCI-N87) efter 72 timer vorinostat behandling ved hjælp MTT assay. Sammenlignet med ubehandlede celler, vorinostat inhiberede signifikant cellelevedygtigheden på en dosis-afhængig måde i alle gastriske cancercellelinier (figur 1A). Vi bekræftede reduktionen i cellelevedygtighed ved cellecyklus-analyse af AGS og KATO-III cancerceller. Vi viste, at behandling med vorinostat (5 uM) i 24 timer inducerede en markant stigning i sub-G1 andel af AGS celler sammenlignet med kontrol (2,3 ± 0,07% vs. 39,2 ± 0,99%, henholdsvis;

P

P

= 0,044), vejledende for cellecyklusstop. Vi yderligere testet cellelevedygtighed hjælp PI-udelukkelse. Vi behandlede AGS og KATO-III-celler med 5 uM vorinostat i 72 timer og vurderet dem ved flowcytometri (fig 1C). Mængden af ​​døde celler, som har lav forward scatter og høj sidespredning blev signifikant forøget i AGS celler (12,4 ± 4,3% vs. 79,4 ± 5,7%), og også i KATO-III-celler, sammenlignet med kontrolceller (8,7 ± 0,6% vs. 46,8 ± 2,1%). Vi analyserede endelig induktion af apoptose efter vorinostat behandling i AGS og KATO-III gastrisk cancer cellelinjer under anvendelse immunoblot. Vorinostat øget apoptose, som bestemt ved caspase-3-spaltning, i AGS celler og i mindre grad i KATO-III-celler (figur 1D).

(A) MTT-assays blev udført efter inkubering af AGS, KATO- III, og NCI-N87 med de angivne koncentrationer af vorinostat i 72 timer. (B) Ændring af cellecyklus ved vorinostat blev vurderet ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) analyse af PI farvede celler behandlet med 5 pM vorinostat i 24 timer. (C) Levedygtighed test med PI eksklusiv løsning. AGS og KATO-III-celler blev behandlet med 5 pM vorinostat i 72 timer og vurderet ved FACS. I repræsentativt plot blev døde celler manifesteret som prikker med lav forward scatter og høje side scatter. (D) Western blot-analyse af aktiv caspase-3 fra AGS og KATO-III gastriske cancerceller uden eller med 5 pM vorinostat behandling. Cellelysater blev analyseret i de angivne tidspunkter. Actin blev anvendt som en loading kontrol. *,

P

0,05. I søjlediagrammet, data repræsenterer middelværdien + SD (standardafvigelse).

Sammenfattende indikerer disse data, at vorinostat har antiproliferativ virkning på gastriske cancercellelinier ved at inducere apoptose i AGS celler og G2 /M cellecyklus arrest i KATO-III celler.

global genekspression analyse af gastrisk kræft cellelinjer AGS og KATO-III efter vorinostat behandling

for at analysere effekten af ​​vorinostat på den globale genekspression, AGS og KATO-III gastrisk cancer-celler blev behandlet med 5 pM vorinostat i 48 timer og blev udført microarray analyse. Unsupervised klyngeanalyse af microarray data efter vorinostat behandling viste, at AGS og KATO-III-celler klynger med samme cellelinje uanset at vorinostat behandling (figur 2A). Fordi autophagy er blevet rapporteret at have en rolle i vorinostat-inducerede virkninger i andre cancere [20], [21], gennemførte vi overvåget analyse af autofagi-relaterede gensæt (80 gener og 149 prober; Tabel S2). Vorinostat-behandlede gastrisk cancer cellelinier blev samlet i en klynge (figur 2B), hvilket viser, at induktion af autofagi er en vigtig egenskab af vorinostat i mavekræft linjer.

(A) i vognen hierarkisk klyngedannelse af genekspression data fra AGS og KATO III før og efter 5 uM vorinostat behandling i 48 timer. Gener med et ekspressionsniveau, der har mindst 2-fold forskel i forhold til medianværdien tværs cellelinier i mindst 2 arrays blev udvalgt til hierarkisk klyngedannelse analyse (3.646 gen faciliteter). (B) Overvåget hierarkisk klyngedannelse med autophagy gener (149 prober) af AGS og KATO III efter vorinostat behandling.

Hæmning af autofagi øger vorinostat effekt i gastriske kræftceller

I betragtning af at autophagy kan spille en rolle i både cancercelleoverlevelse og kræft celledød efter lægemiddelbehandling [22], [23], vi vurderet yderligere bidrag denne proces til virkningen af ​​vorinostat på gastriske cancercellelinier. Vi funktionelt evalueret denne proces ved immunoblotanalyse af autofagi markør mikrotubulus-associeret protein 1 lette kæde 3 (LC3). Vorinostat-behandlede KATO-III-celler og i mindre grad AGS celler, viste en klar akkumulering af hurtigere migrerende lipideret form af LC3 (LC3-II) (figur 3A). Akkumulering af LC3-II kan skyldes enten opregulering af autophagosome dannelse eller blokering af autophagic nedbrydning af LC3-II [24], [25]. Vi analyserede derfor vorinostat-behandlede celler for p62 nedbrydning, en markør for autophagic flux [24], og vi observeret et fald i P62-proteinniveauer i vorinostat behandlede celler sammenlignet med den tid matchede ubehandlede cancerceller (figur 3A). Desuden samtidig behandling af vorinostat med bafilomycin A1 (BafA1), en inhibitor af autophagosome-lysosom-fusion, yderligere øget LC3-II akkumulering (figur 3B), forenelig med vorinostat inducerende autophagic flux stedet blokere nedbrydende kapacitet autophagolysomes. Elektronmikroskopi (EM) er en følsom, kvantitativ og endelig metode til påvisning af autofagi [24]. I overensstemmelse med Western blot data, viste EM analyse, at vorinostat markant øget autophagosome dannelse i AGS-celler (figur 4B og B ‘) sammenlignet med kontrol celler (figur 4A og A’).

(A) AGS og KATO -III blev behandlet med 5 pM vorinostat for de angivne tidspunkter. Proteinniveauer af LC3 og p62 blev analyseret ved immunoblotanalyse. Actin blev anvendt som en loading kontrol. P62-niveauer blev målt ved densitometrisk analyse af Western blots og sammenlignet med actinniveauer. P62 niveauer af ubehandlede AGS og KATOIII celler blev betragtet som 1. (B) AGS-celler blev behandlet i 12 timer med 5 uM vorinostat med eller uden 50 nM bafilomycin A1 (BafA1). Cellelysater blev analyseret ved immunoblotanalyse for LC3 og actin.

Efter 12 timer behandling DMSO (A, A ‘), eller med 5 uM vorinostat (B, B’) (venstre paneler, lav forstørrelse, Målestokken: 2 um), blev udført EM analyse. Høje forstørrelse billeder af boxed områder med Av skildrer autophagic vakuoler (venstre paneler, skala bar: 500 nm; N: nucleus, M: mitokondrier).

For at undersøge om ophobning af autophagosomes beskytter celler mod cellulært stress fremkaldt af vorinostat, vi inhiberede autofagi processen ved hjælp af farmakologiske inhibitor chloroquin og lille interfererende RNA (siRNA) mod beclin-1. Tilsætning af chloroquin til vorinostat-behandlede AGS og KATO-III-celler resulterede i en dosis-afhængigt fald i levedygtighed (figur 5A). Reduktionen i levedygtighed blev bekræftet i KATO-III-celler behandlet med beclin-1 siRNA (figur 5B). Sammen antyder dataene, at inhibering af vorinostat-induceret autophagy kan forbedre effektiviteten af ​​vorinostat behandling af gastriske cancerceller.

(A) AGS og KATO-III-celler blev behandlet med 5 pM vorinostat og forskellige koncentrationer af chloroquin (CQ). Cellelevedygtighed blev vurderet efter 12 timer under anvendelse af krystalviolet-farvning og kontrol (CTR) blev sat til 100%. (B) KATO-III-celler blev transficeret med siRNA mod Beclin 1 (siBeclin1) eller med ikke-målretning Risiko Free siRNA eller behandlet med Dharmafect I alene (mock). siRNA effektivitet blev bekræftet ved Western blot analyse af Beclin 1 og Risiko Free som en kontrol. α-tubulin blev anvendt til at vise ens belastning af proteiner. Levedygtighed blev målt efter 12 timer vorinostat behandling med krystalviolet farvning. Levedygtighed ubehandlet kontrol (CTR) celler blev sat til 100%. *,

P

. 0,05

Vorinostat ændrer gen signatur i humane gastriske cancerceller

For at forstå virkningerne af vorinostat på genekspression i gastrisk kræftcelle linjer, vi gennemførte microarray analyse af vorinostat behandlede AGS og KATO-III gastrisk cancer cellelinjer (fig. 2). Vores analyse afslørede signifikante genomiske forskelle mellem ubehandlede og vorinostat-behandlede gastriske cancerceller (AGS og KATO-III). Efter vorinostat behandling blev ekspressionen af ​​1014 gener forøges, og ekspressionen af ​​760-gener blev reduceret i AGS cellelinie. I KATO-III-cellelinje, 164 gener var op og 191 gener blev nedreguleret (dobbelt forskel;

P

0,001). Vorinostat ændret væsentligt udtryk for 140 gener i både AGS og KATO-III cellelinier (vorinostat specifikt gen signatur). De gener, der mest blev ændret efter vorinostat behandling blev identificeret som

SPANXA1, SPANXA2, VGF, DHRS2, ENTPD8, PNPLA7, STX1A, ARRDC4, KRT13, PrPh, NEU1, TXNIP, CCK

( 4-fold op -forordning) og

MUC1, IFITM1, ANKRD37

( . 4 gange nedregulering)

Dernæst beregnet vi at identificere biomarkører kandidater, der kan forudsige vorinostat følsomhed af humane mavecancerpatienter . Derfor vi kombineret sæt af ændrede gener i vorinostat behandlet gastriske cancercellelinier (vorinostat specifikt gen signatur) og de to humane mavekræft signaturer frembragt fra Yosei og Stanford data ved hjælp Venn-diagram analyse. Vi fandt, at de relative ekspressionsniveauer af 12 gener blev vendt ved vorinostat behandling (figur 6). Af disse 12 gener, 7 gener stærkt udtrykt i mavekræft væv blev nedreguleret (

ITGB5

,

Tyms

,

MYB

,

APOC1

,

CBX5

,

PLA2G2A

,

KIF20A

) og 5 lavt-udtrykte gener var opreguleret efter vorinostat behandling (

SCGB2A1

,

TCN1

,

CFD

,

APLP1

,

NQO1 Hotel (tabel 3).

Venn Diagram af gener udvalgt af univariat test (to-stikprøve t-test) gener blev udvalgt til p .. 0,001 mellem sammenlignede grupper Den røde cirkel (gen liste A) repræsenterer mavekræft specifikke gener fra Yonsei data blå cirkel (gen liste B) repræsenterer mavekræft specifikke gener fra Stanford-data.. Den gule cirkel (gen liste C) repræsenterer vorinostat specifikt gen signatur fra både AGS og KATO-III cellelinier (

P

0,001, 2 fold ændring).

Discussion

Vores resultater viser, at en global menneskelig mavekræft gen signatur kan være nyttigt at finde terapeutiske midler, som snarere er rettet mod den genomiske underskrift mavekræft stedet for at målrette en eller to specifikke gener. Ved hjælp af Connectivity Kort, fandt vi, at HDAC-hæmmere, såsom vorinostat og trichostatin A, havde en omvendt korreleret gen signatur i forhold til mavekræft specifikt gen signatur, og derfor kan være bly terapeutiske kandidater til mavekræft.

In vitro

evaluering af den terapeutiske effekt af vorinostat afslørede, at denne terapeutiske stof undertrykt vækst af forskellige gastrisk cancer cellelinjer. Ved siden af ​​sine antiproliferative effekter, vorinostat opreguleret også autofagi-specifikke gener. Hæmning af vorinostat-induceret autofagi resulterede i en yderligere reduktion af levedygtighed. Endvidere kombineret analyse af gastriske cancercellelinjer behandlet med vorinostat og prøver af mavecancerpatienter viste, at vorinostat ændret ekspressionsniveauerne af et sæt af tolv gastrisk cancer specifikke gener.

Vores resultater viste, at HDAC-inhibitorer, vorinostat og Trichostatin A, var de øverste terapeutiske kandidater til mavekræft, der er enig med det koncept, at HDAC er overudtrykt i mavekræft væv [26]. HDAC-inhibitorer har vist sig at øge acetylering af histoner, derfor påvirker genekspression. Disse inhibitorer åbenbart anticancer effekter ved at inducere indre og ydre apoptose pathway [27], [28], blokering tumorangiogenese [29], og inhiberer intracellulære stress response pathways [30]. Fordi HDAC-hæmmere har globale virkninger på genekspression, kan de påvirke endnu uåbenbarede cellulære processer [31], [32]. I kliniske indstillinger, er HDAC-hæmmere blevet meste anvendt på hæmatologiske maligniteter, men kliniske forsøg i solide tumorer er i gang. En nylig undersøgelse, støtte vores

in vitro

fund viste terapeutiske effekt af HDAC-hæmmere på humane mavekræft prøver ved hjælp af histoculture lægemiddelrespons assay [33]. Det er dog stadig at være åbenbaret, om specifikke molekylære definerede undergrupper kan forudsige respons eller modstand mod HDAC-hæmmere.