PLoS ONE: hemokromatose Forbedrer Tumor Progression via opregulering af Intracellulær Jern i hoved og hals Cancer

Abstrakt

Introduktion

På trods af forbedringer i behandlingsstrategier for hoved og hals pladecellekræft (HNSCC), resultater har ikke væsentligt forbedret; fremhæver betydningen af ​​at identificere nye terapeutiske metoder til at målrette denne sygdom. For at løse denne udfordring, vi fortsatte med at evaluere rollen af ​​jern i HNSCC.

Eksperimentel Design

Expression niveauer af jern-relaterede gener blev evalueret i HNSCC cellelinjer bruger kvantitativ RT-PCR. Cellulære fænotypiske virkninger blev vurderet ved anvendelse levedygtighed (MTS), klonogene overlevelse, BrdU, og tumordannelse assays. Den prognostiske betydning af jern-relaterede proteiner blev bestemt under anvendelse af immunhistokemi.

Resultater

I et panel af HNSCC cellelinier, hæmokromatose (HFE) var en af ​​de mest overudtrykte gener involveret i jern regulering.

In vitro

knockdown af HFE i HNSCC cellelinjer faldt betydeligt hepcidin (HAMP) udtryk og intracellulære jern niveau. Dette vil til gengæld resulterede i et signifikant fald i HNSCC cellelevedygtighed, clonogenicity, DNA-syntese, og Wnt-signalering. Disse cellulære ændringer blev vendt ved genindførelse jern tilbage i HNSCC celler efter HFE knockdown, hvilket indikerer, at jern var mediere denne fænotype. Samstemmende, behandling HNSCC celler med en jern chelator, ciclopiroxolamin (CPX), væsentligt reduceret levedygtighed og klonogene overlevelse. Endelig patienter med høj HFE udtryk oplevet en reduceret overlevelse sammenlignet med patienter med lav HFE udtryk.

Konklusioner

Vores data identificerer HFE som potentielt nyt prognostisk markør i HNSCC der fremmer tumorprogression

via

HAMP og forhøjede intracellulære jern niveauer, hvilket fører til øget celleproliferation og tumordannelse. Derfor disse resultater antyder, at jernkelatorer kan have en terapeutisk rolle i HNSCC management

Henvisning:. Lenarduzzi M, Hui ABY, Yue S, Ito E Shi W, Williams J, et al. (2013) hemokromatose Forbedrer Tumor Progression

via

opregulering af Intracellulær Jern i hoved- og halscancer. PLoS ONE 8 (8): e74075. doi: 10,1371 /journal.pone.0074075

Redaktør: Seema Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA

Modtaget: 18 juni 2013; Accepteret: 22 Jul 2013; Udgivet: 26 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Lenarduzzi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er blevet støttet af midler fra Ontario Institute of Cancer Research, den canadiske Institutes of Health Research, og Dr. Mariano Elia Chair i hoved og hals Cancer Research. Forfatterne også takker den filantropiske støtte fra Wharton Familie, Joe Team, og Gordon Tozer. Michelle Lenarduzzi er en modtager af legater fra Terry Fox Foundation Strategisk Training Initiative for Excellence i Radiation Research af det 21. århundrede (EIRR21) ved den canadiske Institutes of Health Research (CIHR), Ontario Graduate Scholarship (OGS) og Medicinsk Biofysik Excellence award. Der ydes også støtte fra Campbell Family Institute for Cancer Research og Ministeriet for Sundhed og langsigtet planlægning. CIHR – https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html, EIRR21 – https://www.eirr21.utoronto.ca/, OGS – https://osap.gov.on.ca /OSAPPortal/en/A-ZListofAid/TCONT003465.html. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) er den 6. mest almindelige kræftform i verden, med ~ 650.000 nye tilfælde diagnosticeres og ~ 350.000 dødsfald årligt [1,2]. Størstedelen af ​​patienterne er til stede med lokalt fremskreden sygdom, og trods nye behandlingsmetoder, har 5-års sygdomsfri overlevelse stagneret på 30-40% [3]. Disse dårlige resultater fremhæver betydningen af ​​at udvikle nye terapeutiske strategier til at målrette denne sygdom.

Jern er et væsentligt element involveret i flere vigtige processer, herunder DNA og hæm syntese, Wnt signalering, og cellulær metabolisme [4,5]. Mange cancerceller udviser en øget efterspørgsel efter jern for at bevare deres høje cellulære omsætning og DNA-syntese. Derfor er gener involveret i jern regulering ofte dereguleret i cancere. Her rapporterer vi overekspression af hæmokromatose (HFE) i HNSCC, og demonstrere dens evne til at ændre intracellulær jern og øge celleproliferation.

Hemochromatosis er transmembrane glycoprotein, svarende til major histocompatibility class 1 type molekyle ( MHC) som associerer med B

2-mikroglobulin til intracellulær transport til plasmamembranen [6]. På membranen, kan HFE binde til enten transferrin receptor 1 (TRF1) eller transferrin receptor 2 (TFR2). Bindingsstederne af HFE og jern bundet transferrin overlap på TFR1 [7], for derved at regulere jern optagelse i celler. Men nyere oplysninger tyder også, at en central rolle HFE er at stimulere ekspressionen af ​​jern regulerende hormon, hepcidin (HAMP), enten gennem binding med TFR2 [8], eller uafhængigt [9]. Funktionen af ​​HAMP er at internalisere og nedbryde ferroportin (FPN), den eneste cellulære eksportør af jern [10]; fører til en stigning i intracellulære jernniveauer ved at hæmme jern frigivelse [10]. Som et eksempel overekspression af HFE i makrofager og colon adenocarcinom cellelinier inhiberede efflux af cellulært jern [11,12].

På den anden side, genetiske mutationer i

HFE

føre til jernoverskud tilstand, arvelig hæmokromatose (HH). Den mest almindelige form for HH er forårsaget af en enkelt basepar mutation i HFE hvilket resulterer i en c282y substitution [6], som bringer forstyrrelse i samspillet mellem HFE med B

2-mikroglobulin, og derfor vejledning af HFE til cellen membran. Patienter med HH har uhensigtsmæssigt lave niveauer af HAMP [8], der fremhæver betydningen af ​​HFE for HAMP. Lav HAMP resulterer i frigivelse af jern fra reticuloendotheliale makrofager, og giver mulighed for løbende optagelsen af ​​jern fra tarmen, hvilket fører til overskydende jern i omløb [13]. Følgelig bliver cirkulerende transferrin mættet, hvilket resulterer i ophobning af jern i parenchymale celler af forskellige endelige organer, hvilket resulterer i cirrhose, diabetes, kardiomyopati, og cancer [13,14].

I denne foreliggende undersøgelse rapporterer vi den overekspression af HFE i HSNCC, hvilket igen forøgede cellulære niveauer af HAMP, og intracellulær jern. Ved forstyrrende intracellulære jern niveauer, kan HFE fremme celleproliferation, DNA-syntese, Wnt signalering, og tumordannelse

.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Animal Care udvalget ved University Health Network (Toronto, Canada). Protokollen blev godkendt af Animal Care udvalget ved University Health Network (Protokol nummer: 342,19).

Patient prøver blev indsamlet fra 26 HNSCC patienter, med godkendelse fra University Health Network Institutional Research Ethics Board, (REB godkendelse # 07-0521-CE). Disse prøver omfattede matchet gruppe 12 recidiverende og 14 ikke-recidiverende patienter, med en median follow-up tid på 3 år. De kliniske detaljer om disse 26 patienter er angivet i tabel S1. Skriftlig eller mundtlig samtykke kunne ikke opnås fra patienterne på grund af den periode vores kohorte (2003-2007). Derfor er vores University Health Network Institutional Research Ethics Board fraveget kravet om skriftligt informeret samtykke fra deltagerne i denne undersøgelse.

Celler Linjer og reagenser

Den menneskelige hypopharyngeal HNSCC FaDu cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i overensstemmelse med producentens specifikationer. De humane larynx planocellulære linjer, UTSCC-8 og UTSCC-42a (slags gaver fra R Grénman, Turku Universitetshospital, Turku, Finland) [15,16] blev opretholdt med DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (Wisent, Inc) og 100 mg /l penicillin /streptomycin. De normale orale epitelceller (NOE) blev købt kommercielt og dyrket i det anbefalede medium (Celprogen). Alle celler blev holdt i en 37 ° C inkubator med befugtet 5% CO

2, godkendt ved Center for Anvendt Genomics (Hospital for Sick Children, Toronto, Canada) ved hjælp af AMPF /STR Identifier PCR Amplification Kit (Applied Biosystems) og rutinemæssigt testet for forurening med mycoplasma ved anvendelse af Mycoalert detektion kit (Lonza Group Ltd).

Kvantificering af mRNA

Totalt RNA blev ekstraheret fra cellelinjer under anvendelse af Total RNA-oprensningskit (Norgen), derefter omvendt transskriberet hjælp SuperScript II revers transkriptase (Invitrogen Canada) i henhold til specifikationerne. Transcript niveauer af jern regulering gener: ferroportin (FPN), hepcidin (HAMP), hæmokromatose (HFE), transferrin receptor 1 (TFR1), ferritin tung kæde (FTH1), ferritin let kæde (FTL) og mitokondrier ferritin (FTMT) blev vurderet ved QRT-PCR, ved anvendelse af SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), og ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA), som tidligere beskrevet [17]. Primersekvenserne anvendt i denne undersøgelse er alle angivet i tabel S2.

transfektionsforsøg

De biologiske virkninger af HFE blev undersøgt ved anvendelse af siRNA’er rettet mod HFE. siHFE1 (Hs_HFE_5 flexirør siRNA) og siHFE2 (Hs_HFE_2 flexirør siRNA) blev købt fra Qiagen. En forvrænget siRNA (Hs_Control_ss flexirør siRNA) tjente som en negativ kontrol. Alle transfektioner blev udført i komplette medier uden antibiotika anvendelse af Lipofectamine 2000 og 20 nM siRNA, som tidligere beskrevet [18].

Reagenser

ciclopiroxolamin (CPX), deferoxaminmesylat salt (DFO), ferriammoniumcitrat (FAC) blev opnået fra Sigma-Aldrich.

levedygtighed og klonogene assays

levedygtighed HNSCC celler transficeret med siHFE + stråling (RT), eller celler behandlet med CPX, blev bestemt under anvendelse af CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega BioSciences), ifølge producentens anbefalinger. Den kolonidannende evne HNSCC celler transficeret med siHFE + RT eller celler behandlet med CPX + RT blev bestemt under anvendelse af klonogene assay som tidligere beskrevet [19]. Kort fortalt, 48 timer efter transfektion med siHFE eller 72 timer efter behandling med CPX, FaDu celler blev igen udsået i 6-brønds plader og inkuberet ved 37

0C under 5% CO

2 i 10-12 dage. Pladerne blev derefter vasket og farvet med 0,1% krystalviolet i 50% methanol, og antallet af kolonier blev derefter talt. Fraktionen af ​​overlevende celler blev beregnet ved sammenligning af siHFE vs. siCTRL eller CPX vs. CTRL.

flowcytometri

Flowcytometri analyser blev udført på en FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences), analyser blev udført ved anvendelse FlowJo 7.5 software (Tree Star, San Carlos, CA, USA), som tidligere beskrevet [17].

labil Iron

Det cellulære labile jern pulje blev målt ved anvendelse calcein-acetoxymethylester (calcein-AM) som angivet af fabrikanten (Invitrogen). Transficerede celler blev inkuberet med 1 uM af calcein-AM i 15 minutter ved 37 ° C. Celler blev vasket med PBS, derefter målt ved flowcytometri som tidligere beskrevet [18].

BrdU-inkorporering

BrdU-inkorporering blev målt ved anvendelse Exalpha Biologisk BrdU Kolorimetrisk ELISA Kit. Kort fortalt blev transficerede celler inkuberet med BrdU reagens i 24 timer, fikseret, farvet og analyseret i henhold til producentens specifikationer, som tidligere beskrevet [18]. Salg

ROS Eksperimenter

Intracellulære reaktive oxygenarter (ROS) niveauer blev målt ved hjælp af den ikke-specifikke 5- (og 6-) chlormethyl-2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat (CM-H2DCFDA, excitation 488 nm, emission 525 nm) som anvist af fabrikanten (Invitrogen). Transficerede celler blev inkuberet med 5 uM af CM-H2DCFDA i 30 minutter ved 37 ° C. Celler blev vasket med PBS, derefter målt ved flowcytometri [18].

Western Blot

FaDu celler blev transficeret med siHFE eller kontrol, 48 timer efter transfektion blev cellerne lyseret i 1 M Tris -HCI (pH 8), 5 M NaCl og 1% NP40 plus proteaseinhibitorcocktail (Roche Diagnostics). Proteinkoncentration blev vurderet som tidligere beskrevet [17]. Membranerne blev probet med anti-B-Catenin kanin-monoklonalt antistof (Cell Signalling, 8814) eller anti-HFE monoklonalt antistof (Abnova) efterfulgt af sekundære antistoffer konjugeret til peberrodsperoxidase (Abcam). GAPDH og α-tubulin protein-ekspression blev brugt som lastning kontrol. Western blots blev kvantificeret med Adobe Photoshop Pixel Kvantificering Plug-In (Richard Rosenman Reklame Design).

Iron Rescue Eksperimenter

FaDu celler blev transficeret med siHFE eller kontrol; 24 timer efter transfektion blev cellerne behandlet med enten 5 uM af DFO, 5 uM af FACS eller negativ kontrol (DMSO). Otteogfyrre timer efter transfektion blev FaDu celler behandlet med eller uden 2 Gy RT. Fem dage efter transfektion blev cellelevedygtighed målt som beskrevet ovenfor.

Tumor Formation Assay

FaDu celler blev transficeret med siCTRL eller siHFE. Otteogfyrre timer senere blev levedygtige celler høstet og 2.5×10

5 celler blev suspenderet i 100 pi medier og injiceret intramuskulært i venstre musculus gastrocnemius af 8-10 uger gamle svær kombineret immundefekt (SCID) BALB /c mus. Tumorvækst blev overvåget ved måling af tumoren plus ben diameter (TLD) to til tre gange om ugen; mus blev aflivet, når TLD nåede 13 mm som en human endepunkt.

Tumor Formation Assay med CPX

I CPX undersøgelse, to uger efter FaDu tumorcelleimplantation som beskrevet ovenfor, mus blev behandlet dagligt fra mandag til fredag ​​ved oral sondeernæring med CPX (25 mg /kg) i vand eller vehikelkontrol for i alt to uger. Tumorvækst blev overvåget ved måling af tumoren plus ben diameter (TLD) tre gange om ugen; musene aflivet når TLD nåede 13 mm som en human endepunkt.

Immunhistokemi af Iron Proteiner

Angivelse af TFR1 og HFE blev evalueret i 26 primære diagnostiske HNSCC biopsi sektioner ved hjælp mikrobølgeovn antigen hentning i kombination med Level-2 Ultra Streptavidin System, og anti-HFE (Sigma HPA017276, 1/300 fortynding), eller anti-TFR1 (Sigma HPA028598, 1/500 fortynding), som tidligere beskrevet [17]. Kort beskrevet 4-um sektioner var afparaffinering, behandlet med et antigen hentning reagens, blokeret med 3% hydrogenperoxid og inkuberet med enten anti-HFE eller anti-TFR1 ved 4 ° C natten over. Den følgende dag blev snit inkuberet med et biotinyleret sekundært antistof og streptavidin at fuldføre farvning. Cytoplasmatisk farvning af anti-HFE eller anti-TFR1 blev scoret fra 0 til 3 baseret på farvningsintensitet der blev defineret i overensstemmelse hermed: 0 (ingen farvning); 1 (mild forøget farvning sammenlignet med tilsvarende normale epitel); 2 (moderat øget farvning) og 3 (intens øget farvning).

Statistisk analyse

er udført Alle forsøg mindst tre uafhængige gange, og data præsenteres som middelværdi + standard fejl af middelværdien (SEM). Sammenligningen mellem to behandlingsgrupper blev analyseret ved hjælp af Students

t

test. Tosidede tests blev anvendt. Resultater blev betragtet som signifikante, hvis p-værdien var mindre end eller lig med 0,05. Analyse og grafer blev afsluttet ved hjælp Graphpad Prism Software (Graphpad Software, Inc).

Resultater

HFE er overudtrykt i HNSCC cellelinjer sammenlignet med NOE cellelinje

For at identificere differentielt udtrykte jern regulerer gener i HNSCC, basale mRNA ekspressionsniveauer i tre HNSCC cellelinier blev sammenlignet med dem i et NOE hjælp QRT-PCR. HFE blev bemærket at have den højeste ekspressionsniveau af 80-fold overekspression i HNSCCs vs. NOE cellelinje (figur 1A). Ferritin (FTH1) havde den næsthøjeste niveau af overekspression i FaDu og UTSCC 42a celler, i forhold til NOE. Notatet TFR1 syntes også at være lidt overudtrykt i HNSCC forhold til NOE cellelinje.

(A) QRT-PCR-analyse af FPN, HAMP, HFE, TFR1, FTH1, FTL og FTMT udtryk i FaDu, UTSCC 42a og UTSCC8 HNSCC kræft cellelinjer, normaliseret til disse gener i NOE celler. (B) FaDu celler blev transficeret med 20 nM af siCTRL eller siHFE1. Cellelevedygtighed blev vurderet i FaDu celler ved MTS-assayet 24-72 timer efter transfektion. (C) FaDu celler blev transficeret med 20 nM siCTRL eller siHFE1, bestråles derefter 48 timer efter transfektion (4 Gy). Cellelevedygtighed blev vurderet af MTS-assayet 5 dage efter transfektion. (D) Klonogen overlevelse FaDu celler blev målt 10 til 12 dage efter re-seeding celler behandlet med siCTRL (20 nM) eller siHFE1 (20 nM) i 72 timer. (E) Cellelevedygtighed af NOE-celler blev vurderet ved MTS-assay 24, 48 og 72 timer efter transfektion med 20 nM siCTRL eller siHFE1. (F) NOE-celler blev transficeret med 20 nM af siCTRL eller siHFE1 eller 2 ?, bestråles derefter 48 timer efter transfektion (4 Gy). Cellelevedygtighed blev vurderet af MTS-assayet 5 dage efter transfektion. * P 0,05, ** P. 0,005, P = ns (ikke signifikant)

In vitro effekter af HFE nedregulering

For at vurdere den biologiske betydning af HFE overekspression, blev udført knockdown eksperimenter i HNSCC celler under anvendelse et siRNA tilgang. Vedvarende knockdown blev opnået i FaDu celler i op til 72 timer ved anvendelse af to uafhængige siRNA’er rettet mod HFE på både transskriptet og proteinniveauer (fig S1A og S1B). HNSCC celler viste en signifikant reduktion i cellelevedygtighed med eller uden stråling efter transfektion med siHFE sammenlignet med siCTRL (Figur 1B-C, S1c-E). Desuden blev evnen hos HNSCC celler til at danne kolonier signifikant reduceret med eller uden stråling efter transfektion med siHFE forhold til siCTRL (figur 1D, S1F-G). I modsætning hertil levedygtighed NOE celler med eller uden stråling forblev uændret efter transfektion med siHFE forhold til siCTRL (Figur 1E-F, S1H). demonstrerede Samlet set disse observationer, at faldende HFE fortrinsvis reduceret levedygtighed og clonogenicity i HNSCC forhold til NOE celler. For bedre at forstå den mekanisme (r) forestår formidlingsarbejdet denne fænotype, vi undersøgte evne HFE til at regulere cellulære jern.

HFE reguleret HAMP og labile jern pool i HNSCC celler

For at bestemme hvis HFE var involveret i reguleringen hepcidin (HAMP), vi målte mRNA-niveauer af HAMP ved QRT-PCR efter transfektion med siHFE. FaDu celler demonstrerede et signifikant fald i HAMP mRNA-transkript niveau ( 0,5-fold) i op til 72 timer efter transfektion med siHFE forhold til siCTRL (figur 2A). Desuden blev den labile jern pool (LIP) også signifikant reduceret (med ~ 20%) efter HFE knockdown i HNSCC celler sammenlignet med siCTRL (figur 2B). I modsætning hertil var der ingen signifikant ændring i LIP i NOE celler med siHFE transfektion (figur 2C). Samlet set har disse forsøg viste evne HFE til at ændre cellulære jern niveauer fortrinsvis i HNSCC forhold til NOE celler. For at bestemme om intracellulære jernniveauer var involveret i mediering disse siHFE fænotyper, har vi udført en serie af jern redningsforsøg.

(A) QRT-PCR af Hamp-niveauer ved 24, 48 og 72 timer efter transfektion med 20 nM hver af siHFE1 eller siHFE2, i forhold til fold-change i siCTRL-behandlede celler. (B) Cellular labile jern pool (LIP) i FaDu og UTSCC8 celler transficeret med 20 nM hver af siCTRL eller siHFE, opdaget af flowcytometri med calcein-AM på 24-72 timer efter transfektion. (C) Cellulær LIP af NOE celler transficeret med 20 nM siCTRL eller siHFE, opdaget af flowcytometri med calcein-AM på 24-72 timer efter transfektion. * P 0,05, ** P. 0,005, P = ns (ikke signifikant)

Jern medierer celle spredning af HFE

Cellelevedygtighed blev målt i HNSCC celler behandlet med siHFE alene, siHFE med en jern-chelator deferoxamin (DFO), eller siHFE kombineret med opløseligt jern (FAC), både med og uden RT (figur 3A S2A-B). Disse undersøgelser viste, at tilsætning af DFO yderligere reduceret levedygtighed HNSCC celler efter HFE knock-down, som blev fuldstændig reddet ved tilsætning af FAC; RT havde ingen signifikant forskellen effekt på denne proces. Disse resultater bekræftede, at jern var en kritisk mediator af disse virkninger. Vi fortsatte derefter med at vurdere virkningerne af siHFE på downstream jern-afhængige processer.

(A) FaDu celler blev transficeret med 20 nM hver af siCTRL eller siHFE1, derefter behandlet med 5 uM af DFO, eller 5um af FAC , 24 timer efter transfektion, efterfulgt af ± RT (4 Gy), 48 timer efter transfektion. Cellelevedygtighed blev vurderet af MTS-assayet 5 dage efter transfektion. (B) BrdU-inkorporering blev vurderet i FaDu celler 5 dage efter transfektion med 20 nM hver af siCTRL eller siHFE1, ± RT (4 Gy, 48 timer efter transfektion). (C) FaDu celler blev transficeret med 20 nM hver af siCTRL eller siHFE, ± RT (4 Gy, 48 timer efter transfektion). Totalt cellulært ROS niveau blev påvist ved flowcytometri med CM-H2DCFDA 24-72 timer efter RT. (D) Western blotting af B-catenin blev målt i FaDu celler 24-72hr efter transfektion med siCTRL (20 nM) eller siHFE1 (20 nM); billeder (ovenfor), kvantificering (nedenfor). * P 0,05, ** P 0,005, *** P 0,0005, P = ns (ikke signifikant)

BrdU inkorporering assay blev anvendt til at måle ændringer i DNA-syntese. HNSCC celler transficeret med siHFE viste en signifikant reduktion (60%) i BrdU-inkorporering sammenlignet med siCTRL-behandlede celler (figur 3B, S2C). I modsætning hertil blev der ikke observeret nogen signifikant ændring i BrdU inkorporering for NOE celler transficeret med siHFE forhold til siCTRL-behandling (figur S2D). Flowcytometri blev anvendt til at måle ændringer i ROS niveauer efter siHFE. Som forventet FaDu celler viste en signifikant reduktion i ROS-niveauer efter transfektion med siHFE sammenlignet med siCTRL, både med og uden RT (figurerne 3C og S2E). Endelig blev Wnt vej undersøgt ved at analysere ændringer i B-Catenin. FaDu celler transficeret med siHFE viste en signifikant reduktion (~ 40%) i B-catenin-niveauer i op til 72 timer sammenlignet siCTRL-behandlede celler (figur 3D).

siHFE reducerer marginalt tumordannelse in vivo

Næste, vi vurderet virkningerne af HFE knock-down i en

in vivo

tumor model. Tumorgenicitet blev målt

in vivo

hjælp SCID-mus injiceret intramuskulært med FaDu celler transficeret med siHFE eller siCTRL. Undertrykkelse af siHFE marginalt nedsat tumordannelse i forhold til den negative kontrol, mærkbar på senere tidspunkter ( 27 dage). (Figur S2F)

jernkelator CPX reduceret celleproliferation i HNSCC cellelinjer

i betragtning af udfordringerne i den terapeutiske anvendelse af en siRNA strategi blev HNSCC celler behandlet med en klinisk godkendt jernchelator, ciclopiroxolamin (CPX), at bestemme, om siHFE fænotypen kunne forløb. Behandling af HNSCC cellelinjer med 5 uM af CPX resulterede i en signifikant reduktion i kolonidannelse, med eller uden RT, sammenlignet med vehikelbehandlede celler (Fig 4A, S3A-B). I modsætning hertil CPX havde en meget mindre effekt på levedygtighed NOE forhold til FaDu celler (figur 4B). Desværre administrationen af ​​CPX i 2 uger ved 25 mg /kg ikke reduceret tumorvækst i FaDu xenograft model (Figur S3C).

(A) Klonogen overlevelse FaDu celler blev målt 10 til 12 dage efter re-podning af celler, som blev behandlet med ethanol (5 uM) eller CPX (5 uM) i 72 timer efterfulgt af RT (0, 2, 4 eller 6 Gy). (B) Cellelevedygtighed af FaDu og NOE-celler blev vurderet ved MTS-assay 72 timer efter behandling med CPX (2,5 uM, 5 uM eller 10 uM). * P 0,05, ** P 0,005, *** P 0,0005, P = ns (ikke signifikant)

Iron proteiner er de-reguleret i primær HNSCC vævsprøver

Immunhistokemi (IHC) blev anvendt til visuelt bekræfte ekspressionen af ​​HFE og TFR1 i HNSCC væv. Intens immuno-ekspression af både HFE og TFR1 blev observeret i cytoplasmaet af tumorceller, men ikke i den tilstødende stroma eller infiltrerende lymfocytter (figur 5A og 5B). I modsætning hertil blev minimal immuno-ekspression af HFE og TFR1 observeret i en normal larynx (figur 5C-D), hvilket bekræfter den højere ekspression af HFE og TFR1 i HNSCC vs. normale væv. Når udtrykket af HFE eller TFR1 blev dikotomiseret mellem høj (IHC ≥2)

vs

lav. (IHC 2) niveauer, de tidligere grupper oplevede en kortere samlet overlevelse sammenlignet med sidstnævnte (Figur 5E-F ; p = 0,08); selvom statistisk signifikans ikke blev opnået på grund af den lille stikprøve. Tilsvarende medianen IHC score for både HFE og TFR1 var højere i de tilbagefald vs. non-tilbagefald patientprøver (Figur S4A-B), men var statistisk signifikant kun for HFE ekspression (p = 0,04).

(a) et repræsentativt billede af HFE immunhistokemisk ekspression fra en primær HNSCC biopsi; pile, der angiver tumorceller udviser cytoplasmatisk signal. (B) Et repræsentativt billede af TFR1 immunhistokemisk ekspression fra en primær HNSCC biopsi; pile, der angiver tumorceller udviser cytoplasmatiske membran signal. (C) Et repræsentativt billede af HFE immunhistokemisk ekspression fra en normal strubehovedet. (D) Et repræsentativt billede af TFR1 immunhistokemisk ekspression fra en normal strubehovedet. (E) Kaplan-Meier plot af samlet overlevelse for HNSCC patienter dikotomiseret baseret på høj (≥2)

vs

. lav ( 2) HFE immunhistokemi scoringer. (F) Kaplan-Meier plot af samlet overlevelse for HNSCC patienter dikotomiseret baseret på høj (≥2)

vs

. lav ( 2). TFR1 immunhistokemi scoringer

Diskussion

Heri vi rapporterer for første gang, at HFE overekspression synes at være en ny mekanisme ansvarlig for HNSCC sygdomsprogression. Overekspression af HFE i HNSCC fører til øget hepcidin, hvilket igen fremmer intracellulær jern akkumulering, hvilket resulterer i øget DNA-syntese, forhøjede ROS-niveauer, Wnt-signalering, alle drivende tumorcelleproliferation og clonogenicity, med jern som en kritisk mediator i denne proces (figur 6). En potentiel terapeutisk strategi i denne sammenhæng er anvendelsen af ​​en jern-chelator ciclopiroxolamin (CPX), som fortrinsvis reduceret klonogen overlevelse og levedygtighed i HNSCC celler, med minimale virkninger på de NOE’er. Desuden HFE og TFR1 overekspression viste en tendens til dårligere resultat, der tilsammen dokumenterer den kritiske rolle af jern deregulering i HNSCC progression.

Schema viser, at HFE overexpresion fører B2M bindende for cellemembranen menneskehandel. HFE øger HAMP enten direkte eller via TFR2. Hamp forlader derefter cellen, gennem en ukendt mekanisme, og til gengæld nedbryder FPN, hvilket fører til jern ophobning. Kollektivt, dette resulterer i øget DNA-syntese, høj ROS, og Wnt-signalering, alle drivende tumorcelleproliferation og clonogenicity. Kasser i rød betegne de data, demonstreret i denne aktuelle undersøgelse.

Yderligere beviser på relevansen af ​​disse jern regulerer gener leveres ved undersøgelse af offentligt tilgængelige HNSCC databaser (www.oncomine.org) [20 ], bekræfter signifikant overekspression af både HFE [21], og TFR1 [21-23] i HNSCC patientprøver, hvilket viser, at dette faktisk et almindeligt dysreguleret pathway i denne sygdom. Desuden HFE blev også overudtrykt i andre cancere, herunder hjernen [24], og nyrecellecancere [25]. For at identificere potentielle mekanisme (r), der fører til deres overekspression blev TCGA HNSCC databasen ved hjælp af cBIO Cancer Genomisk Portal software [26] afhørt ved at sammenligne tumor transcript niveauer for at DNA-kopi nummer i 295 diskrete patient datasæt. De fleste af disse HNSCCs var diploide for

HFE

; dermed kromosomal ændring ikke syntes at være ansvarlig for sin overekspression. Men forstærkning af

TFR1

genet blev observeret i 18% af HNSCC prøver, hvilket svarede til forhøjede TFR1 mRNA-ekspressionsniveauer, indikerer genomisk ændring som en mekanisme til TFR1 overekspression i HNSCC. I betragtning af den komplekse netværk af proteiner involveret i jern regulering [27], er det klart, at flere mekanismer er ansvarlige for jern deregulering i humane cancere. For eksempel mTOR, som ofte aktiveres i HNSCC [28] er for nylig blevet knyttet til TFR1 stabilitet og jern regulering [29], der giver endnu en mekanisme til jern deregulering i HNSCC. Derfor er der sandsynligvis flere forskellige mekanismer tegner sig for HFE overekspression i HNSCC, hvilket resulterer i jern perturbation

hemokromatose (HFE) er et transmembrant glycoprotein, udtrykkes bredt i hele det menneskelige legeme [30].; et af de vigtigste opgaver er at regulere hepcidin (HAMP) [8], som igen, internaliserer og nedbrudt ferroportin (FPN) (se figur 6) [10]. Hamp eller anden måde forlader cellen, derefter binder til FPN på plasmamembranen, hvilket bevirker tyrosinphosphorylering fører til internalisering af FPN. Når internaliseret, FPN er de-phosphoryleret, så ubiquitylated og nedbrydes gennem lysosomale vej [31]. I sidste ende nedbrydning af FPN af HAMP fører til intracellulær tilbageholdelse af jern.

Under fysiologiske betingelser er HAMP formentlig udskilles af leveren som reaktion på ændringer i plasma jern niveauer. nye oplysninger tyder dog, at HAMP kan spille en patologisk rolle i menneskelige maligniteter; for eksempel har lav FPN og høj HAMP blevet forbundet med dårlig prognose ved brystcancer [32]. Forhøjede HAMP mRNA niveauer korreleret med lav FPN udtryk i kolorektal cancer [33]. Den præcise mekanisme (r), hvorved forhøjet HAMP bidrager til carcinogenese er endnu ikke klarlagt; men det er tænkeligt, at HAMP kunne udskilles af cancerceller til at nedbryde FPN og dermed forøge intracellulære jernniveauer, som foreslået af vores data. Faktisk har forhøjet serum hamp niveauer blevet forbundet med nedsat celle carcinom metastaser [34]; så godt, har høje urin hamp niveauer er observeret hos patienter med myelomatose [35], både tyder patologisk sekretion af HAMP af kræftcellerne. Endvidere HeLa-celler forbigående transficeret med et plasmid indeholdende FPN og udsat for HAMP, resulterede i internalisering af FPN [10], hvilket viser, at tumorer reagerer på HAMP på en tilsvarende måde som hepatocytter eller makrofager.

Den regulerende netværk jern indeholder over 151 kemiske arter og 107 reaktioner trin [27], således er stramt reguleret. Fænomenet cancerceller kræver mere jern til at opretholde deres høje cellulære omsætning og DNA-syntese observeres i mange forskellige maligniteter.