PLoS ONE: Den Angivelse af miR-375 er forbundet med Carcinogenese i tre undertyper af lungekræft

Abstrakte

Mange undersøgelser viste unikke microRNA profiler i lungekræft. Ikke desto mindre, den rolle og relateret signalveje af miR-375 i lungekræft er stort set ukendt. Vores studie undersøgte forhold mellem carcinogenese og MIR-375 i adenocarcinom, pladecellecarcinom og småcellet carcinom at identificere nye molekylære mål for behandling. Vi evaluerede 723 microRNA i mikrodissekeres kræftceller og tilstødende normale celler fra 126 snap-frosne lunge prøver vha microarrays. Vi valideret udtrykket profiler af miR-375 og dens 22 formodede mål mRNA i en uafhængig kohorte af 78 snap-frosne lungekræft væv ved hjælp af kvantitativ reverse transkriptase PCR. Desuden har vi udført dobbelt luciferase reporter assay og Western blot på 6 målrettede gener (

FZD8

,

ITGA10

,

ITPKB

,

LRP5

,

PIAS1

RUNX1

) i småcellet lungekræft cellelinje NCI-H82. Vi har detekteret også virkningen af ​​miR-375 på celleproliferation i NCI-H82. Vi fandt, at MIR-375-ekspression var betydeligt opreguleret i adenocarcinom og småcellet carcinom men nedreguleret i pladecellecarcinom. Blandt de 22 formodede målgener, 11 viste signifikant forskellige ekspressionsniveauer i mindst 2 ud af 3 parvise sammenligninger (adenocarcinom vs. normal, pladecellecarcinom vs. normal eller småcellet carcinom vs. normal). Seks målrettede gener havde stærk negativ korrelation med ekspressionsniveauet af MIR-375 i småcellet lungecarcinom. Yderligere undersøgelser afslørede, at miR-375 direkte målrettet 3’UTR af

ITPKB

mRNA og overekspression af miR-375 medførte faldt betydeligt ITPKB proteinniveauet og fremmet cellevækst. Således er vores undersøgelse viser den differentielle ekspression profiler af miR-375 i 3 undertyper af lungecarcinomer og finder thatmiR-375 direkte henvender

ITPKB

og fremmes cellevækst i SCLC cellelinje

Henvisning.: Jin Y, Liu Y, Zhang J, Huang W, Jiang H, Hou Y, et al. (2015) Udtrykket af miR-375 er forbundet med Carcinogenese i tre undertyper af lungekræft. PLoS ONE 10 (12): e0144187. doi: 10,1371 /journal.pone.0144187

Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: 19. juni 2015; Accepteret: November 13, 2015; Udgivet: December 7, 2015

Copyright: © 2015 Jin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.472.174 og 81.401.879), Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (nr 14411965900 og 14ZR1406100 ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft har længe været den førende årsag til cancer-relaterede dødsfald hos mænd verden over [1]. Histologisk er lungekræft inddeles i 2 hovedklasser, ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og småcellet lungecancer (SCLC). NSCLC er en heterogen gruppe består af 2 mest almindelige undertyper, dvs. pladecellecarcinom (SQ) og adenocarcinom (AC) [2] .Despite forbedringerne i tidlig diagnose og seneste gennembrud i kemo /målrettede behandlinger, den samlede 5-års overlevelse for lungekræft er fortsat lav, og tilbagefald er høj [3] .Poor prognose skyldes sene sygdom præsentation, heterogene, og relativt begrænset forståelse af tumor biologi. Derfor vil opdagelsen af ​​nye molekylære markører og mål for diagnose og behandling af lungekræft spille afgørende roller i at forbedre prognosen.

MicroRNA (miRNA) er en klasse af endogent udtrykt, kodende lille RNA med omkring 22 nukleotider. Det er blevet vist, at miRNA scanne regulere genekspression på posttranskriptionel plan gennem ufuldkommen baseparring med 3′-utranslaterede region (3’UTR) af target mRNA’er [4]. Voksende tyder på, at deregulering af miRNA kan bidrage til bestemte typer kræft, herunder lungekræft. Mange undersøgelser har vist, unikke miRNA profiler i lungekræft [5-7] .I vores tidligere undersøgelse om undersøgelse af miRNA-biomarkører i 3 undertyper af lungecarcinomer, fandt vi signifikant opregulering af microRNA-375 (miR-375) udtryk niveauer i AC og SCLC men nedregulering af miR-375 i SQ [8]. Vi hypotesen, at MIR-375 kan være kandidat onkogen i AC og SCLC men en tumor suppressor i SQ. Faktisk fænomenerne en enkelt miRNA, der spiller modstående roller under tumor patogenese, enten som et onkogen eller en tumor suppressor, er blevet rapporteret i forskellige cancere [9-11] .Desuden opregulering af MIR-375 i SCLC blev rapporteret for nylig [12, 13]. Imidlertid signalveje reguleres af MIR-375 og den rolle, MIR-375 i lungekræft er stadig ukendte.

Vi undersøgte rollen af ​​MIR-375 i carcinogenese af 3 lungekarcinomceller undertyper at identificere nye molekylære mål for diagnose og behandling af lungecancer. I dette papir viser vi en vellykket validering af distinkte MIR-375 ekspressionsprofiler i de 3 undertyper. Desuden præsenterer vi udtryk profiler af 22 formodede mål mRNA af miR-375 i 3 lunge Carcer undertyper. Desuden viser vi, at miR-375 fremmer cellevækst i SCLC cellelinje og hæmmer ITPKB udtryk på posttranskriptionel niveau ved direkte rettet mod 3’UTR af

ITPKB

mRNA.

Materialer og metoder Salg

Kliniske prøver

den lokale etiske udvalg godkendte undersøgelsen og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. For stikprøveudvælgelsen, blev rutine histologisk klassifikation anvendes efter WHO Klassificering af lungetumorer [2] .Den diagnosen AC blev bekræftet ved fravær af keratinisering eller intercellulære broer og positiv TTF1 farvning. SQ Diagnosen blev bekræftet ved intercellulære broer eller positiv P63-farvning (mindst 40% af tumorcellerne). For alle de SCLC sager, der var fuldstændig enighed om neuroendokrine morfologi, små celler og neuroendokrine positiv farvning. Hvis der var en uenighed, blev opnået enighed ved påvisning af TTF1 /P63. Alle sager blev uafhængigt revideret af 2 erfarne lungekræft patologer. Patienter, som havde modtaget præoperativ strålebehandling eller kemoterapi blev udelukket. De kliniske karakteristika er vist i tabel 1.

RNA isolering

Totalt RNA af de frosne vævssnit blev udtrukket ved hjælp Mirvana miRNA isolation kit ifølge producentens instruktioner (Applied Biosystems, Foster city, CA). Koncentrationen blev kvantificeret ved NanoDrop 1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Waltham, MA). Kvalitetskontrollen af ​​RNA blev udført ved en 2100 Bioanalyzer hjælp af RNA 6000 Pico LabChip kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Kvaliteten blev målt ved hjælp af RNA integritet nummer (RIN). En RNA-prøve blev kasseret, hvis RIN point er mindre end 5,0.

QRT-PCR

Kvantitativ revers-transkriptase-polymerase-kæde-reaktion (QRT-PCR) blev udført på 78 macrodissected frosset lungevæv at validere udtrykket profiler af mIR-375 og dets formodede målrettede gener i 3 undertyper af lungecarcinomer. I valideringen af ​​miR-375, blev QRT-PCR udføres ved hjælp af Taqman microRNA analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Den U47 lille nukleare RNA blev anvendt som en endogen kontrol. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer.

For 22 forudsagt målgener af miR-375 (

ACSL3

,

CACNG2

,

CCDC6

,

CSNK2A1

,

FZD8

,

ITGA10

,

ITPKB

,

JAK2

,

JUND

,

LAMC1

,

LRP5

,

MAP3K5

,

NLK

,

PAK7

,

PDGFC

,

PDPK1

,

PIAS1

,

RUNX1

,

RYR2

,

SOCS5

,

SP1

WNT5A

) , QRT-PCR under anvendelse af SYBR Green PCR Master Mix kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) blev udført ifølge producentens anvisninger.

GAPDH

blev anvendt som en endogen kontrol. Alle assays blev udført in triplo. Primer sekvenser er tilgængelige efter anmodning. Eksklusionskriterier for statistisk analyse er som følger: 1) Et target gen, som viste tærskel cyklus (CT) værdier over 35 cyklusser i 20% af de testede prøver og 2) En prøve, der viste CT-værdier over 35 cyklusser i 20% af de testede gener.

Target forudsigelse og sti analyse

Målene for miR-375 blev forudsagt gennem gateway miRecords (https://mirecords.biolead.org/). For at øge forudsigelse nøjagtighed, blev de gener, som blev forudsagt af mindst 4 af 11 databaser (Diana, microinspector, miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, pita, rna22, rnahybrid og Targetscan) valgt som mål.

Kegg database (https://www.genome.jp/kegg/tool/search_pathway.html) blev anvendt til at kortlægge de forudsagte mål lungekræft-associerede veje.

Celler

En SCLC cellelinie NCI-H82 blev venligst stillet til rådighed af Dr. Xueliang Zhu (Institut for Biokemi og Cellebiologi, Shanghai Institutes for Biologisk Institut, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina) [13]. NCI-H82 stabilt transduceret med MIR-375-udtrykkende (H82-MIR-375) eller tomme (H82-NC) lentivirus blev opretholdt i RPMI-1640 med 10% føtalt bovint serum (FBS). SV40-transformerede embryoniske nyrecellelinie 293T, opnået fra American Type Culture Collection, blev opretholdt i DMEM med 10% FBS.

vektor konstruktion

Seks formodede målrettede gener (

ITPKB

,

RUNX1

,

LRP5

,

PIAS1

,

FZD8

ITGA10

), der havde en stærk negativ korrelation med miR -375expression niveau i SCLC blev udvalgt til funktionelle studier. Af de 6 målrettede gener, 3’UTR på

ITPKB

mRNA indeholdt 3 formodede målområder for miR-375 (target site 1: frø 1667-1673, målområde 2: frø 2463-2469 og målområdet 3 : frø 2513-2519). To forskellige segmenter af

ITPKB

3’UTR, betegnet ITPKB-Δ1 (target site 1) og ITPKB-Δ2 (target site 2 og 3), blev klonet, respectively.Schematic repræsentation af

ITPKB

3’UTR og de formodede bindingssteder for mIR-375 er vist i S2 fig.

til konstruktion af mIR-375 ekspressionsvektor (pS-mIR-375), et DNA-fragment kodende for mIR-375 pre-miRNA (flankerende opstrøms og nedstrøms 30-50 nt) blev forstærket og indsat i

Bam

HⅠ og

Hind

ⅲ steder at udtrykke vektor pSilencer4.1 CMV-puro. MIR-375-udtrykkende lentiviral vektor blev konstrueret med Ubi-EGFP-MCS-IRES-Puromycin.

For at konstruere vildtype 3′-UTR pGL3 reportere (pGL3-ITPKB-Δ1, pGL3-ITPKB-Δ2 , pGL3-RUNX1, pGL3-LRP5, pGL3-PIAS1, pGL3-FZD8 og pGL3-ITGA10), 100 bp DNA-fragmenter af de forudsagte målrettede gener, herunder de formodede mIR-375 bindende sekvenser og XbaⅠrestriction sites blev syntetiseret og klonet i XbaⅠ stedet umiddelbart nedstrøms for stopkodonen i pGL3-promotor vektor. Muterede 3′-UTR pGL3 reportere (pGL3-ITPKB-Δ1-mut1, pGL3-ITPKB-Δ2-Mut2, pGL3-ITPKB-Δ2-mut3, pGL3-RUNX1-mut, pGL3-LRP5-mut, pGL3-PIAS1-mut, pGL3-FZD8-mut og pGL3-ITGA10-mut), som bar den muterede sekvens i den komplementære site for frø regionen mIR-375, blev genereret baseret på vildtype 3′-UTR pGL3 reportere ved stedspecifik mutagenese. Alle klonede produkter blev verificeret ved sekventering. Primere til kloning MIR-375 og oligonukleotider til mål-3’UTR konstruktion er vist i S1 tabel.

Luciferase reporter assay

293T-celler blev podet i 96-brønds plade. Cellerne blev co-transficeret med 2 ng af en intern kontrol vektor pRL-Renilla (Promega, Madison, WI), 40 ng af forskellige 3′-UTR pGL3-promotor- reportere, 160 ng MIR-375 ekspressionsvektor (pS-miR -375) eller tomme kontrol (pS-negativ). Otteogfyrre timer efter transfektion blev ildflue og Renilla luciferaseaktiviteter analyseres under anvendelse Dual-Glo Luciferase assaysystem (Promega, Madison, WI). Luciferaseaktiviteten af ​​hver prøve blev normaliseret ved Renilla luciferaseaktivitet. Den normaliserede luciferase aktivitet for pS-negative blev sat som relativ luciferaseaktivitet 1. Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer og uafhængigt repeated3 gange.

Western blot

NCI-H82 celler blev inficeret med miR -375-udtrykkende (H82-miR-375) eller tomme (H82-NC) lentivirus ved en MOI på 80. infektion effektivitet var omkring 100% som vurderet ved mikroskopi af GFP-fluorescens. Cellerne blev høstet efter 72 timer. Totalt protein af cellerne eller friske væv (2 AC, 2 SQ, 3 SCLC og 1adjacent normalt væv) blev fremstillet ved anvendelse RIPA-lysepuffer. Celle proteinlysater blev adskilt i 10% SDS-polyacrylamidgeler, elektroforetisk overført til polyvinylidenedifluoride membraner (Roche, Pleasanton, CA), detekteres derefter med antistoffer, herunder anti-ITPKB (for cellelinie: ab171984, Abcam, for væv: NBP1- 81.589, Novus Biologicals), anti-RUNX1 (ab54869, Abcam), anti-LRP5 (ab38311, Abcam), anti-PIAS1 (ab77231, Abcam), anti-FZD8 (ab155650, Abcam), anti-ITGA10 (ab118099, Abcam), anti -GAPDH (Santa Cruz) og peroxidise-konjugeret sekundære antistoffer (Santa Cruz). Intensiteten af ​​proteinfragmenter blev kvantificeret under anvendelse Mængde One-software og er normaliseret ved GAPDH.

CCK-8 assay

NCI-H82-celler blev inficeret med MIR-375-udtrykkende (H82-miR- 375) eller tomme (H82-NC) lentivirus som nævnt ovenfor. H82-MIR-375 eller H82-NC-celler blev podet i plader med 96 brønde. Cellerne blev inkuberet i 24 timer, 48 timer, og 72 timer hhv. CCK-8 reagens (DOJINDO) blev tilsat til hver brønd 3h før udgangen af ​​inkubation. Optisk densitetsværdi (OD) af hver prøve blev målt ved en bølgelængde på 450 nm. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt og uafhængigt repeated3 gange.

Statistisk analyse

I microarray data, envejs variansanalyse (ANOVA) med Benjamini-Hochberg korrektion (p ≤ 0,001) blev udført at bestemme differentielt udtrykte miRNA blandt normale, AC, SQ og SCLC væv. Hierarkisk klyngedannelse blev udført med Pearson korrelation ved hjælp af differentielt udtrykte miRNA

For QRT-PCR-data, en uparret, ulige varians

t

-test med Benjamini-Hochberg korrektion (p 0,05). Var anvendes til mIR-375 og differentielt udtrykt målrettede gener i sammenligninger af AC vs normal, SQ vs. normal og SCLC vs. normalt væv. De målrettede gener med korrigerede p 0,05 og fold udtryk forandring 2 blev valgt som kandidater til yderligere funktionelle undersøgelser. Alle p-værdier var tosidet.

Yderligere metoder, herunder laser capture mikrodissektion (LCM), er macrodissection og microarray hybridisering beskrevet i S2 Filer.

Resultater

The miR- 375 udtryk profiler i tre undertyper af lungecarcinomer

i en microarray analyse blev udtryk profiler af 723 menneskelige miRNA undersøgt i udvalgte LCM kræft cellepopulationer og normale celler, der stammer fra 36 AC, 30 SQ, 16 SCLC og 44 tilstødende normale væv. Fig 1A illustrerer hierarkiske clustering af forskellen ekspressionsniveauerne af miRNA i 3 undertyper af lungecarcinomer og normal lungevæv. De overordnede miRNA udtryk profiler klart opdelt prøverne i fire hovedgrupper: AC, SQ, SCLC og normal væv. Opregulering af MIR-375 ekspressionsniveauet blev observeret en smule i AC og betydeligt i SCLC, mens markant nedregulering af MIR-375 ekspression blev observeret i SQ (Fig 1B og tabel 2).

A, Hierarkisk gruppering af miRNA udtryk profiler i AC, SQ, SCLC og normal lungevæv på microarrays. Den gennemsnitlige signal fra biologiske udtages blev anvendt til klyngedannelse. Farvede søjler angiver rækken af ​​normaliserede log2-baserede signaler. B, En interaktiv dot diagram af miR-375 normaliserede signaler microarrays. C, En interaktiv dot diagram af miR-375 normaliserede CT værdier QRT-PCR. AC: adenocarcinom, SQ: planocellulært karcinom, SCLC:. Småcellet lungekræft

Udtrykket profiler af miR-375 i 3 lunge carcinoma undertyper blev yderligere valideret i en uafhængig kohorte af 78 lynfrosset kirurgiske lungevæv ved hjælp QRT-PCR. Tilsvarende miR-375-ekspression var signifikant opreguleret i AC og SCLC men nedreguleret i SQ (Fig 1C og tabel 2).

Foreningen af ​​miR-375 udtryk med lunge carcinogenese

Vi identificerede 191 gener gennem gateway miRecords at være forbundet med miR-375. Efter kortlægning til Kegg pathway databasen blev 22 gener identificeret til at være involveret i vigtige signalveje i lungekræft (S2 tabel.).

Ekspressionsniveauerne for de 22 formodede målgener blev næste bestemt i 78 macrodissected frosset lungevæv. Udtrykket profiler af de formodede mål mRNA i 3 undertyper af lungecarcinomer er præsenteret i tabel 3. Af de 22genes, 11 (

ACSL3

,

CACNG2

,

CCDC6

,

FZD8

,

ITGA10

,

ITPKB

,

JUND

,

LRP5

,

PIAS1

,

RUNX1

RYR2

) havde markant differentieret ekspressionsniveauerne i mindst 2 ud af 3 parvise sammenligninger af AC vs normal, SQ vs normal eller SCLC vs. normal. Bortset

ACSL3

, viste alle de 11 formodede målgener signifikant nedregulering i alle de 3 lunge carcinomasubtypes. Omvendt

ACSL3

viste over 10 gange opregulering når compareits udtryk niveau i SCLC som i normalt væv (p = 0,011). To gener (

CSNK2A1

og

MAP3K5

) viste differential ekspressionsniveauerne i SQ vs. kun normal sammenligning. Tre gener (

NLK

,

PDPK1

og

SP1

) viste forskellen udtryk i SCLC vs. kun normal kontrol. To gener (

JAK2

LAMC1

) viste sammenlignelige ekspressionsniveauer i de 3 sammenligninger, mens andre 4 gener (

PAK7

,

PDGFC

,

SOCS5

WNT5A

) ikke passere kvalitetskontrollen, hvor målgenet viste CT-værdier over 35 cyklusser i 20% af de testede prøver.

Korrelation af miR-375 niveau med target mRNA-ekspression

I sammenligningen af ​​AC vs normal (Fig 2A), blev der observeret stærke negative korrelationer mellem ekspressionsniveauet af miR-375, og at 10 formodede mål mRNA (

ACSL3

,

CACNG2

,

CCDC6

,

FZD8

,

ITGA10

,

ITPKB

,

JUND

,

LRP5

,

PIAS1

RYR2

). I sammenligningen af ​​SQ vs. normal (Fig 2B), blev påvist stærke positive korrelationer mellem ekspressionsniveauet af MIR-375 og af 13 formodede mål-mRNA’er (

ACSL3

,

CACNG2

,

CCDC6

,

CSNK2A1

,

FZD8

,

ITGA10

,

ITPKB

,

JUND

,

LRP5

,

MAP3K5

,

PIAS1

,

RUNX1

RYR2

). I sammenligningen af ​​SCLC vs. normal (Fig 2C), blev stærke negative korrelationer fundet mellem ekspressionsniveauet af miR-375, og at af 6 formodede mål mRNA (

FZD8

,

ITGA10

,

ITPKB

,

LRP5

,

PIAS1

RUNX1

), mens stærke positive korrelationer blev observeret mellem ekspressionen af ​​miR-375, og at af 4 formodede mål mRNA (

ACSL3

,

NLK

,

PDPK1

og

SP1

).

A, Korrelation af miR-375 med mål-mRNA ekspression i sammenligningen af ​​AC vs. normal. B, Korrelation af MIR-375 med mål-mRNA ekspression i sammenligningen af ​​SQ vs. normal. C, Korrelation af miR-375 med target mRNA-ekspression i sammenligningen af ​​SCLC vs. normal. Grøn cirkel: nedregulering. Rød cirkel: opregulering. Hvid cirkel: genet viste ikke differentiel ekspression i den parvise sammenligning af AC vs normal, SQ vs. normal eller SCLC vs. normal. Blå cirkel: genet ikke passere kvalitetskontrol. AC: adenocarcinom, SQ: planocellulært karcinom, SCLC:. Småcellet lungekræft

ITPKB: et direkte mål for miR-375

Dual luciferase reporter assay blev udført på seks målrettet gener (

FZD8

,

ITGA10

,

ITPKB

,

LRP5

,

PIAS1

RUNX1

) der havde en stærk negativ korrelation med ekspressionsniveauet af miR-375 i SCLC. For de 3 putative målsteder på 3’UTR af

ITPKB

mRNA, luciferaseaktiviteten af ​​reporteren bærer site 2 og 3 vildtype (ITPKB-Δ2) var signifikant undertrykt af MIR-375, mens luciferaseaktiviteten af ​​site 1 vildtype (ITPKB-Δ1) var upåvirket. Vigtigere er det, site 2 mutant (ITPKB-Δ2-Mut2) blev ikke ramt af miR-375, mens sitet tre mutant (ITPKB-Δ2-Mut3) blev stadig hæmmet af miR-375 (Fig 3A). Tilsammen resultaterne viste, at miR-375 målrettet 3’UTR af

ITPKB

mRNA primært gennem målområdet 2 (frø: 2463-2469).

A, Luciferaseaktivitet. luciferaseaktiviteten af ​​hver prøve blev normaliseret ved Renilla luciferaseaktivitet. Den normaliserede luciferase aktivitet for pS-negative blev sat som relativ luciferaseaktivitet 1. Kolonne: middelværdien af ​​3 uafhængige forsøg i tre eksemplarer. Fejl bar: standardafvigelse. *: P 0,05, sammenlignet med cellerne transficeret med tom pGL3-promotor vektor. B, blev Ekspressionsniveauerne for ITPKB proteinet af H82, H82-NC og H82-MIR-375-celler vurderet ved Western blot. Efter transfektion af MIR-375, blev ekspressionsniveauet af ITPKB protein signifikant undertrykt. C, Kvantitativ analyse af Western blot. De protein intensiteter ITPKB blev normaliseret ved GAPDH.

Effekten af ​​miR-375 på den endogene udtryk for ITPKB blev yderligere undersøgt ved Western blot. Den ektopiske ekspression af MIR-375 undertrykte signifikant den ITPKB proteinet i MIR-375-transficerede H82-celler (H82-MIR-375) sammenlignet med vektorkontrol transficerede H82-celler (H82-NC) (figur 3B og 3C). Dataene viste, at miR-375 hæmmede ekspressionen af ​​ITPKB på posttranskriptionel niveau ved direkte rettet mod 3’UTR (primært målrette site2) af

ITPKB

mRNA.

Desuden observerede vi ITPKB proteinekspression var signifikant nedreguleret i lungekræft væv sammenlignet med tilstødende normalt væv, som er i tråd med ekspressionsmønsteret for

ITPKB

mRNA nævnt ovenfor (figur 4 og tabel 3).

Western blot blev anvendt til at påvise ekspressionen af ​​ITPKB protein i lungecarcinom væv (2AC prøver, 2SQ prøver, 3SCLC prøver) og tilstødende normale lungevæv. De ITPKB protein intensiteter blev normaliseret ved GAPDH.The fold ændringer var 0.2and0.3 i sammenligninger af 2AC vs normal, 0,2 og 0.4of 2SQ vs normal, 0,3, 0,3 og 0.4of 3SCLC vs normal henholdsvis.

For andre 5 formodede målrettede gener (

RUNX1

,

LRP5

,

PIAS1

,

FZD8

ITGA10

), blev der observeret minimale virkninger på mIR-375 i deres luciferaseaktiviteter (S3 Fig). Desuden blev de ektopiske ekspressionsniveauer af MIR-375 ikke signifikant undertrykt af de 5 formodede målproteiner i H82-MIR-375 sammenlignet med H82-NC (S4 Fig).

Virkning af MIR-375 overekspression på SCLC cellevækst

Den betydelige opregulering af miR-375-ekspression i SCLC prøver og dens hæmmende effekt på

ITPKB

fik os til at undersøge dens mulige biologiske rolle i SCLC celler. Efter inficeret, miR-375 ekspressionen af ​​både H82-NC og H82-miR-375 blev påvist ved hjælp af real-time QRT-PCR (figur 5A). Bedømmes derefter vi cellevæksthastigheden af ​​CCK-8 assay. Resultaterne vist i fig 5B Resultaterne antydede, at exogen ekspression af MIR-375 kan fremme cellevækst af H82-celler i en tid-afhængighed måde. Efter 24 timer inkubation blev der ikke forskel i cellernes levedygtighed mellem de to grupper observeret (p 0,05) .Men signifikant forskel mellem de to grupper blev observeret efter 48 timer og 72 timer inkubation og fremme effektivitet var 33,1% og 35,9%, henholdsvis ( p. 0,01)

A blev miR-375 ekspression af begge H82-NC og H82-miR-375.NCI-H82-celler inficeret med miR-375-udtrykkende (H82-miR-375) eller tomme (H82-NC) lentivirus før proliferationsanalysen. B, kunne MIR-375 fremmer cellevækst af H82-celler. De inficerede celler blev podet til plader med 96 brønde. Efter inkubering i adskillige dage blev cellevækst målt ved CCK-8 assay. *: P 0,01, sammenlignet med H82-NC.

Diskussion

MIR-375 blev først identificeret som en pancreas-ø-specifikke miRNA regulerer insulinsekretion [14-16]. yderligere undersøgelser viste imidlertid, at miR-375 er et multifunktionelt miRNA, der deltager i pancreas-ø udvikling, glukose homøostase, slimhindeimmunitet, lungesurfactant sekretion og endnu vigtigere, tumorigenese. Deregulering af MIR-375 er blevet observeret i forskellige typer af cancere. For eksempel, Kong et al rapporterede, at MIR-375-ekspression var stærkt nedreguleret i øsofageal pladecellecarcinom (ESCC), og MIR-375 inhiberede tumorvækst og metastase gennem undertrykke insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF1R) [17]. En anden undersøgelse overbevist om, at miR-375 ofte blev nedreguleret i ESCC cellelinjer og væv, og miR-375 var signifikant associeret med fremskredent stadium, metastaser og dårlig resultat af ESCC [18]. Leidner et al fandt, at MIR-375 var forbundet med progression til invasive carcinom i Barretts øsofagus [19] .Chang et al viste, at nedregulering af MIR-375 i gliom blev korreleret med ugunstige kliniske resultat [20]. Lav ekspression af MIR-375 blev fundet i colorektal cancer [21, 22], og også korreleret med dårligt resultat og metastase i hoved og hals pladecellecarcinomer [23, 24]. Han et al fandt, at miR-375, nedreguleret i hepatocellulært carcinom (HCC) væv og cellelinjer målretter AEG-1 i HCC og undertrykker væksten af ​​kræft celle

in vitro

in vivo

[ ,,,0],25]. I lungekræft, nedsat miR-375 udtryk niveau NSCLC vævsprøver signifikant korreleret med fremskredent stadium og lymfe metastaser [26] blev observeret .Reduced udtryk for miR-375 i alle typer kræft er nævnt ovenfor, mens miR-375 opregulering blev bemærket i bryst cancer og prostatacarcinom [27, 28]. Disse resultater understreger en grundlæggende rolle miR-375 i tumorigenese. Vores resultater var i overensstemmelse med tidligere resultater. Vi opdagede og valideret betydelig miR-375 opregulering i AC og SCLC men signifikant nedregulering i SQ.

De nuværende to rapporter om miR-375 udtryk i SCLC var i overensstemmelse med vores resultater [12, 13] . Sammenlignet med dem, vores undersøgelse er unik af følgende grunde: For det første, Zhao et al undersøgte miRNA ekspressionsmønstre kun i cellelinjer (fire SCLC-cellelinier (H209, H69, H82, og H345), en NSCLC cellelinje CRL 5908 og en immortaliseret human lunge epitelcellelinie Beas-2B), fandt de, at mIR-375 konsekvent blev opreguleret i alle fire SCLC-cellelinier. Den anden også drog den konklusion af dyrkede celler, og brugte små prøver af væv (7 NSCLC vs. 8SCLC) til verificering uden normal kontrol. Vores undersøgelse omfattede ikke kun cellelinjer, men også en mere omfattende scanning af kliniske prøver, så vi kan bedre identificere potentielle diagnostiske miRNA-markører. Understreger den miRNA udtryk profiler i subtypning SCLC og NSCLC skyldes de vanskeligheder med at opnå primære vævsprøver, som de fleste SCLC tumorer ikke er kirurgisk resektion. For det andet opdagede vi miRNA biomarkører på LCM valgt cancerceller og tilstødende normale celler afledt fra AC, SQ og SCLC. Denne fremgangsmåde sikrer renheden af ​​target-celler, reducerer baggrund signaler fra ikke-kræftceller og forbedre pålideligheden af ​​de fundne biomarkør kandidater [29] .Og interessant, bemærkede vi, at overekspression af miR-375 drastisk kan fremme cellevækst i SCLC cellelinje NCI-H82.

miRNA er negative post-transkriptionsregulatoriske elementer af genekspression. Enkelte miRNA kan regulere flere mRNA og er muligvis bedre drug targets. For bedre at forstå den molekylære mekanisme af MIR-375 i de 3 undertyper af lungecancer, vi forventede yderligere målgenerne af MIR-375 og filtreres de formodede målgener gennem Kegg pathways. Vi observerede that22 målgener er de vigtigste medlemmer af etablerede signalveje i lungekræft, herunder calcium, insulin, Jak-STAT, MAPK, mTOR, PPAR, TGF-beta og Wnt veje. Blandt disse gener, fandt vi, at 6 målgener (

FZD8

,

ITGA10

,

ITPKB

,

LRP5

,

PIAS1

og

RUNX1

) havde en stærk negativ korrelation med miR-375 ekspressionsniveauet i sammenligningen af ​​SCLC vs. normalt væv. Sammenhængen mellem lungekræft og 4 målgener (

FZD8

,

LRP5

,

PIAS1

RUNX1

) er tidligere blevet rapporteret [30-33 ] .Det er blevet rapporteret, at

FZD8

er stærkt udtrykt i A549-cellelinje og dysregulering af

FZD8

kunne spille nøgleroller i human kræft gennem aktivering af beta-catenin-TCF vej [30 ]. Lee et al viste en signifikant ned-ekspression af

LRP5

gen i 6 af 17 lung pladecarcinom prøver [31]. I H1299 cellelinie,

PIAS1

inhiberede STAT1-medieret gen-aktivering og det DNA-bindende aktivitet [32]. I NSCLC patienter,

RUNX

blev oftere methyleret i tumorvæv end i noncancerous væv [33] .Men funktioner

ITGA10

ITPKB

i lungekræft er stadig ukendt. I vores undersøgelse,

ITPKB

mRNA og protein-ekspression var signifikant nedreguleret i lungekræft væv. Den luciferaseanalyse afslørede, at

ITPKB

er den direkte målgenet af miR-375. Den overekspression af miR-375 medførte faldt betydeligt ITPKB proteinniveau. Resultaterne bekræftede, at miR-375 negativt reguleret

ITPKB dele på oversættelsen niveau. For

ITGA10

gen, vi ikke observere nogen virkninger på miR-375 i luciferaseaktiviteten og undertrykkelse af ITGA10 protein-ekspression af miR-375.

For nylig miR-375 har været fundet at undertrykke centrale kendetegnende for kræft ved at målrette flere vigtige gener som

AEG-1

,

YAP1

,

IGF1R

PDK1

[16]. de målgener reguleret af miR-375 kan fungere spatiotemporally eller i samarbejde med hinanden i forskellige cellulære processer. Vores identifikation af ITPKB gen som et direkte mål for miR-375 giver nye indsigter i de mekanismer, der ligger til grund tumorigenese. ITPKB, et medlem af [Ins

P

3] 3-kinaser familie, blev kortlagt til den telomere ende af humant kromosom 1 og forbundet med calcium-signalvejen. Det er blevet identificeret som en kandidat-gen i patogenesen af ​​immunlidelser, dissemineret sklerose, Alzheimers disease, og malignt melanom [34, 35].