PLoS ONE: miR-143 Forstyrrer ERK5 Signaling, og ophæver prostatakræft Progression i Mice

Abstrakt

Baggrund

Micro RNA er små, ikke-kodning, enkeltstrenget RNA, som negativt regulere genekspression på post-transkriptionel niveau. Da MIR-143 viste sig at være nedreguleret i prostatacancerceller, vi ønskede at analysere dets ekspression i human prostatacancer, og teste evnen af ​​MIR-43 til at standse prostatakræft cellevækst in vitro og in vivo.

Resultater Salg

Ekspression af mIR-143 blev analyseret i humane prostatacancer ved kvantitativ PCR og ved in situ hybridisering. MIR-143 blev introduceret i cancerceller in vivo ved elektroporering. Bioinformatik analyse og luciferase assays blev anvendt til at bestemme MIR-143 mål. Vi viser i denne undersøgelse, at MIR-143-niveauer er omvendt korreleret med fremskredne stadier af prostatacancer. Redning af miR-143-ekspression i cancer celler resulterer i arrestationen af ​​celleproliferation og ophævelsen af ​​tumorvækst i mus. Endvidere viser vi, at virkningerne af MIR-143 medieres, i det mindste delvist ved inhibering af ekstracellulær signal-kinase-5 (ERK5) aktivitet. Vi viser her, at ERK5 er en miR-143 mål i prostatakræft

Konklusioner

MIR-143 er som et nyt mål for prostatakræft behandling

Henvisning:.. Clape C, Fritz V, Henriquet C, Apparailly F, Fernandez PL, Iborra F, et al. (2009) miR-143 Forstyrrer ERK5 Signaling, og ophæver prostatakræft Progression i mus. PLoS ONE 4 (10): e7542. doi: 10,1371 /journal.pone.0007542

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Juni 23, 2009; Accepteret: September 29, 2009; Udgivet: 26 oktober 2009

Copyright: © 2009 Clape et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Agence Nationale pour la Recherche (ANR physio2006), Institut National du Cancer (INCA) Association pour la Recherche contre le Cancer (ARC), og Fondation pour la Recherche Medicale (FRM). CC er støttet af en bevilling på Region Languedoc-Roussillon, og ARC. PLF er støttet af Ministerio de Ciencia e Innovacion FIS-PI080274

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (CaP) er den hyppigste kræft og den anden hyppigste årsag til kræft død hos mænd i de vestlige lande. Androgen receptor (AR) er sandsynligvis en afgørende faktor i prostatakræft progression. Prostatacancer er oprindeligt afhængig af androgener for vækst, og androgen ablation terapi forårsager regression af tumoren [1], sandsynligvis gennem inaktivering af transkription af AR målgener. Men svar på denne behandling er ofte forbigående og mange mænd udvikler tilbagevendende androgen-uafhængig prostatacancer, som har en meget dårlig prognose, fordi ingen effektiv behandling er i øjeblikket tilgængelig (se [2] til gennemsyn).

For nylig, en ny klasse af små RNA’er er blevet beskrevet, betegnet microRNA, som findes til at regulere mRNA-funktion ved at modulere både mRNA-stabilitet og translation [3], [4]. MiRNA er små, ikke-kodende, enkeltstrengede RNA’er af -22 nucleotider, der negativt regulerer genekspression på post-transkriptionel niveau, primært gennem baseparring til den 3 ‘utranslaterede region (UTR) af target mRNA’er. Voksende beviser indikerer, at miRNA styrer basale cellefunktioner, der spænder fra spredning til apoptose [5], [6], [7]. Ca. 50% af miRNA gener er placeret i cancer-associerede genomiske regioner eller i skrøbelige steder [8], og nogle af dem har vist sig at være direkte involveret i udviklingen af ​​kræft og progression [9]. MicroRNA udtryk profiler klassificere også tumorer ved udviklingsmæssige afstamning og differentiering tilstand [10]. Flere microRNA har vist sig at have oncogene egenskaber eller virker som tumorsuppressorgener [9], [11]. Dette er tilfældet for MIR-15A og MIR-16-1, hvilken ekspression er tabt i fremskreden prostatacancer. Disse to miRNA viser anti-onkogen aktivitet gennem målretning af cyclin D1 og Wnt3a, som er mediatorer af cancercelleproliferation og overlevelse [12]. Nedsat ekspression af andre miRNA, såsom MIR-23b, -100, -145, -221 og -222 er også dokumenteret. Endvidere ektopisk ekspression af disse miRNA resulterer i prostatacancer celle inhibition [13]. I modsætning til disse anti-onkogene miRNA, onkogen MIR-106b eller MIR-32 er blevet identificeret i prostatacancer. Disse miRNA support celledeling og overlevelse af kræftceller trug målretning af p21 /WAF1 og Bim proteiner henholdsvis [14]. Mest interessant er den iagttagelse, at nogle miRNA, såsom MIR-141 udskilles af cancerceller, og findes i serum hos prostatacancerpatienter. Disse resultater fastslår målingen af ​​tumorafledte miRNA i serum eller plasma som en ny diagnostisk værktøj til en ikke-invasiv metode til påvisning af human cancer [15].

Vi har tidligere vist, at en kombinationsbehandling ved anvendelse af PPARy agonister og HDAC-inhibitorer resulterer i inhibering af prostatacancer cellevækst hos mus [16]. Global analyse af mikro-RNA-ekspression i disse behandlede celler korrelerede forøget miR-143 med vækst anholdelse. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af ​​MIR-143 i prostatacancer og fandt, at ekspressionsniveauet af MIR-143 blev signifikant reduceret. Endvidere blev ekspressionsniveauet omvendt korreleret med histopatologisk klasse i human prostatacancer. Transfektion af LNCaP og c4-2 celler in vitro med precursor MIR-143, eller elektroporering af MIR-143 i prostatacancer-xenotransplantater i mus viste, at MIR-143 bidrager negativt til prostatakræft cellevækst. Endelig bioinformatik analyser identificeret ERK5 som et potentielt mål gen for mir-143. ERK5 er kendt for at fremme cellevækst og proliferation som reaktion på vækstfaktorer og tyrosinkinaseaktivering. Derfor vedholdende nedsatte niveauer af mir-143 i cancerceller kan være direkte involveret i carcinogenese gennem aktivering af mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) kaskade via ERK5. Tilsammen tyder disse resultater på, at mir-143 kunne være en tumor suppressor og et potentielt nyt diagnostisk eller prognostisk markør i prostatakræft.

Resultater

miR-143 udtryk faldt i prostatakræft progression

En første indikation af deltagelse miR-143 i prostatakræft blev observeret nedsat udtryk for denne miRNA i LNCaP, og c4-2 prostatakræft, sammenlignet med normale epitel cellelinjer, som analyseret ved kvantitativ RT-PCR (fig. 1A). I overensstemmelse med denne observation, ekspressionen af ​​MIR-143 var stærkt reduceret i human prostatacancer, sammenlignet med normale prostatavæv (fig. 1b). Endvidere niveauer af transskriberet MIR-143 blev omvendt korreleret med histopatologisk klasse i human prostatacancer, nå grænsen for detektion i high-grade kræft (Gleason 7;. Figur 1B). Til mere præcist analysere ekspressionen af ​​miR-143,

in situ

hybridisering blev udført i high-density væv arrays, som indeholder 40 prostatakræft væv vs. 10 normale prostata væv. MIR-143-ekspression kunne ikke detekteres specifikt i prostatacancerceller med høj Gleason score, hvorimod MIR-143 blev udtrykt i normal prostata epitel, og prostata kirtler (Fig. 1C). Disse resultater antydede, at nedregulering af miR-143 udtryk kunne være en nødvendig begivenhed for udvikling af kræft eller progression.

En

, Kvantitativ real-time PCR (QPCR) af miR-143, normaliseret til mængden af ​​RNU48 mål i prostata cancercellelinier. De relative niveauer af miRNA ekspression blev målt ved bestemmelse af ACt-værdier i den angivne cellelinie versus PNT2 celler. Data er middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikans, her og i de efterfølgende figurer, * 0,05; ** 0,01; *** 0001.

B

, QPCR af miR-143, normaliseret til mængden af ​​RNU48 mål i prostata vævsprøver. De relative niveauer af miRNA ekspression blev målt ved bestemmelse af ACt-værdier i den angivne Gleason prostatacancer versus normal prostata. Data er middelværdier ± SEM af elleve prostata prøver for hver gruppe.

C

, repræsentant

in situ

hybridisering farvning af miR-143 i human ikke-tumor og tumor prostata væv. TMA præsenterer 40 prostatakræft væv vs. 10 normale prostatavæv. (TMA, forstørrelse, 400 ×).

Nedsat proliferation og øget apoptose i miR-143-udtrykkende prostatakræftceller

Nedsat udtryk i prostatakræft foreslog, at miR-143 kunne have anti-proliferative virkninger. For at teste denne hypotese miR-143 blev ektopisk udtrykt i c4-2 og LNCaP prostatakræft-cellelinier. MIR-143 blev udtrykt 5- og 12-fold højere i transficerede LNCaP, og c4-2 celler, sammenlignet med kontrolceller transficeret med enten ikke-relevante miRNA, eller med anti-MIR-143, som er en MIR-143-inhibitor (fig. 2A). Der blev ikke observeret forskelle i celleantal, når ikke-relevante miRNA eller anti-MIR-143 blev anvendt i disse celler. I skarp modsætning hertil blev celleantal omvendt korreleret til ekspressionsniveauerne af MIR-143 i både LNCaP og c4-2 cellelinjer (fig. 2B-C). Dette antydede, at MIR-143 negativt regulerer celleproliferation. I overensstemmelse hermed BrdU-inkorporering eksperimenter vist, at miRNA ekspression resulterer i inhibering af DNA-syntese, og derfor ophævelsen af ​​celleproliferation i disse cancercellelinier (Fig 2D). Interessant nok blev disse cytostatiske virkninger også korreleret med forøget celledød i miRNA udtrykkende prostatacancerceller, som evalueret af blå trypan eksperimenter (fig. 2e). Endvidere viste cellecyklusanalyse en stigning i G

0-G

1 befolkning, samtidig til et fald i S-fase i MIR-143 udtrykkende celler (fig. 2F). Interessant, FACS-analyse viste en forøgelse i celledød (Fig. 2G). Apoptose blev dog ikke ændret i MIR-143, sammenlignet med kontrolceller, som vurderet ved annexine inkorporering eksperimenter (data ikke vist), eller ved caspase 3-niveau 48 timer efter transfektion (fig. 2H). Dette antydede, at den observerede celledød er ikke afhængig af apoptose, men snarere nekrose begivenheder. Foreslået i alt disse data, at miR-143 negativt styrer celledeling og positivt styrer celledød af prostata kræftceller.

En

, qPCR af miR-143 i c4-2 celler (hvide bjælker ) og LNCaP-celler (sorte søjler), normaliseret til RNU48 48 timer efter transfektion med scrambled miR (kontrol), miR-143 forløber eller antimiR-143. Data er middelværdier ± SEM for fem uafhængige forsøg.

B-C

, cellevækst i LNCaP (B) eller c4-2 (C) celler under 48 timer efter transfektion med scrambled miR (sort rhombe), MIR-143 precursor (sorte kors) eller antimiR-143 (hvid trekant). Data er middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg.

D

, Kvantificering af BrdU-inkorporering 48 timer efter transfektion i c4-2 og LNCaP-celler i fravær af MIR-143 (top), i nærværelse af MIR-143 (i midten) eller antimiR-143 (nederst). Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

E

, Blå trypan indbygning i c4-2 (hvide søjler) og LNCaP (sorte søjler) celler 48 timer efter transfektion i fravær eller tilstedeværelse af miR-143 eller ved tilstedeværelse af antimiR-143.

F

, Procent af celler i forskellige faser af cellecyklus i LNCaP og c4-2 cellelinjer 36 timer efter transfektion med kontrol 5 (ikke relevant), miR-143 eller antimiR-143. Lignende resultater blev opnået i to uafhængige forsøg. Resultater udtrykkes som gennemsnit ± SEM (n = 2-4).

G

, FACS-analyse af apoptose i c4-2 (hvide søjler) og LNCaP (sorte søjler) celler 48 timer efter transfektion i fravær eller nærvær af MIR-143 eller i nærværelse af antimiR-143.

H

, Relativ aktiv caspase 3 koncentration i c4-2 (hvide søjler) og LNCaP (sorte søjler) celler 48 timer efter transfektion i fravær eller tilstedeværelse af miR-143 eller ved tilstedeværelse af antimiR-143. Koncentrationen af ​​aktive caspaser 3 normaliseres med den globale protein koncentration.

ERK5 er en miR-143 målgen

Vi ønskede at identificere miR-143 mål, der kunne impliceret i prostatakræft progression. Bioinformatik analyse viste, at 3′-UTR af det humane ERK-5-gen huser en formodet konsensus site for MIR-143 binding (nucleotiderne 2917-2932) (fig 3A). Til eksperimentelt validere dette mål, vi først analyseret ERK5 udtryk i prostata cancer cellelinjer. ERK5 protein blev stærkt forøget i LNCaP, og c4-2 prostatacancerceller, sammenlignet med ikke-kræft PNT2 prostataepitelceller (fig. 3B). Interessant nok blev ERK5 ekspression omvendt korreleret med MIR-143-ekspression i disse cellelinier (fig. 1A). Yderligere analyse i human prostatacancer i high-density vævsarrays viste, at ERK5 ekspression, som analyseret ved IHC var stærkt forøget i cancer, sammenlignet med normale prostatavæv (fig 3C, underpanel). Påfaldende blev ERK5 ekspression omvendt korreleret med MIR-143-ekspression, som analyseret ved in situ hybridisering, antyder, at ERK5 kunne være en

bona fide

MIR-143 target (fig. 3C, sammenlign øvre til nedre paneler). For at bevise denne hypotese overekspression blev udført. Ektopisk ekspression af MIR-143 i LNCaP, og c4-2 prostatacancercellelinjer resulterede i et signifikant fald i ERK5 proteinekspression, sammenlignet med celler transficeret med ikke-relevante miRNA, eller med antisense MIR-143. (Fig. 3D). Nedsat ERK5 ekspression korrelerede med nedsat proliferation i disse cellelinier efter ekspression af MIR-143 (fig. 2). Desuden faldt ERK 5 ekspression i mir-143 behandlede celler også korrelerede med nedsat ekspression af Jun, der er et kendt ERK5 mål (fig. 3E).

A

, Skematisk afbildning af forudsagt målsted af mIR-143 i 3’UTR af ERK5 mRNA. Seed-matching sekvens er angivet. H.s ERK5 3’UTR er Homo Sapiens 3’UTRsequence.

B

, Western blot-analyse af endogen ERK5 ekspression i prostata normale og cancer-cellelinjer. De relative udtryk, normaliseret til GAPDH, blev målt af Image J software som en fold af den angivne situationen versus scrambled miR. Data er middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg. C, Repræsentant immunhistokemisk farvning af ERK5, og in situ hybridisering af miR-143 i træk sektioner af high-density væv array.

D

, Western blot-analyse af endogen ERK5 ekspression i c4-2 og LNCaP-celler 48 timer efter transient transfektion af det angivne MIR-143. Relativ udtryk, kvantificeret af Image J software er normaliseret til GAPDH, og målt ved fold af den angivne situationen versus scrambled miR. Data er middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg.

E

, Måling af luciferaseaktiviteten i COS-celler transficeret med et reporter-luciferasegenet pGL3 fusioneret til ERK-5 3’UTR muteret eller ikke med stigende koncentrationer eller MIR-143 (0, 25, 50; 100 nM). Værdier er normaliseret til beta-galactosidase-aktivitet og udtrykkes i fold versus fravær af MIR-143. Sorte bjælker, ERK5 3’UTR, hvide barer, mutant 3’UTR; data er gennemsnit ± SEM for fire eksperimenter udført i triplikat.

F

, Western blot-analyse af endogent c-Jun-ekspression i LNCaP-celler 48 timer efter transient transfektion af det angivne MIR-143. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

G

, QPCR af ERK5 i c4-2 celler (hvide søjler) og LNCaP celler (sorte søjler), normaliseret til 18 s gen 48 timer efter transfektion med pSUPER-shNeo (kontrol) eller pSUPER-shERK5. Data er middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg.

H

, Kvantificering af BrdU inkorporering i c4-2 celler (hvide søjler) og LNCaP celler (sorte søjler) 48 efter transfektion med pSUPER-shNeo (kontrol) eller pSUPER-shERK5. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Næste, for yderligere at demonstrere den hypotese, at de observerede virkninger på proliferation er resultatet af ERK5 hæmning, blev udført dæmpende eksperimenter. shRNA ekspression rettet mod ERK5 resulterede i et signifikant fald i celleproliferation i LNCaP og c4-2, sammenlignet med celler transficeret med ikke-relevante shRNA (fig. 3F). ERK5 ekspressionsniveauet blev reduceret ca. 90% i begge cellelinier transficeret med specifikke shERK5 (fig. 3G).

Endelig, for yderligere at bevise, at ERK5 er udførtes en MIR-143 målgenprodukter forbigående transfektionsforsøg under anvendelse af 3’UTR region ERK5 indeholdende det formodede mIR-143 matching site, muteret eller ej, nedstrøms for luciferase åbne læseramme. Luciferaseaktivitet af 3’UTR ERK-Luc konstruktion blev reduceret i nærvær af MIR-143, hvorimod luciferaseaktivitet af muteret -Luc konstrukt ikke var påvirket, hvilket antyder, at MIR-143 modulere ERK5 ekspression ved binding til ERK5-3’UTR ( figur 3F).

redning af miR-143 udtryk nedsætter tumor progression i mus

for at undersøge effekten af ​​miR-143 på tumorvækst blev atymiske nøgne mus subkutant podet med prostatakræft LNCaP og c4-2 celler. To uger efter podning af cellerne, når tumorerne nåede en gennemsnitlig volumen på 392 mm

blev udført 3, MIR-143 redningsforsøg. Intratumoral injektion af MIR-143, efterfulgt af elektroporering som beskrevet i materiale og metoder sektion resulterede i ophævelsen eller et fald i tumorvækst i mus podet med LNCaP og c4-2 celler (fig. 4A og 4B), hvorimod elektroporering af kontrol ikke -relevant miR havde ingen virkning på tumorvækst (fig. 4A og 4B). Til trods for den forventede MIR-143 hurtig nedbrydning in vivo, forblev ekspression af MIR-143 signifikant forøget i MIR-143 elektroporerede tumorer (fig. 4C). I overensstemmelse med den observerede nedgang i tumorvækst, spredning forholdet LNCaP og c4-2 tumorer blev også reduceret, som kvantificeret ved PCNA farvning i tumorer elektroporeret med MIR-143 (Fig. 4D). Endelig analyse af ERK5 proteinniveau ved immunhistokemi indikerede, at ERK5 ekspression blev reduceret i nærvær af MIR-143 i LNCaP og c4-2 tumorer (Fig. 4E). Tilsammen disse resultater viste sig at MIR-143 fungerer som en tumorsuppressor i prostatacancerceller. Salg

A-B Salg, tumorvækst af LNCaP (A) eller c4-2 (B) celler injiceres subkutant og elektroporeret tre gange med ikke-relevante miR (kontrol, kvadreret hvid) eller miR-143 forløber (sort rhombus). Data er middelværdier ± SEM for syv mus analyseret for hver gruppe.

C

, QPCR analyse af miR-143-ekspression i c4-2 (hvide søjler) og LNCaP xenografter (sorte søjler), normaliseret til RNU48. Data er middelværdier ± SEM for syv mus analyseret for hver gruppe.

D

, Analyse af celledeling af PCNA farvning på xenograft sektioner af atymiske Nude mus injiceret subkutant med c4-2 (hvide søjler) eller LNCaP (sorte søjler) celler efter tre elektroporeringer med røræg miR eller miR-143 forløber . Data er middelværdier ± SEM for syv mus analyseret for hver gruppe.

E

, Repræsentant immunhistologisk farvning af ERK5 i c4-2 og LNCaP tumorer. Nude mus injiceret subkutant med c4-2 (hvide søjler) eller LNCaP (sorte søjler) celler efter tre elektroporeringer med røræg miR eller miR-143 forløber. Data er repræsentative for syv mus analyseret for hver gruppe. (Forstørrelse, 400 ×).

Diskussion

Vi har analyseret udtrykket og virkningerne af miR-143 om prostatakræft udvikling og progression. Nogle undersøgelser har tidligere vist, at MIR-143 kunne spille en rolle i tumorigenese siden dets ekspression er nedsat hos flere kræftformer [19]. Vi rapporterer to vigtigste resultater i denne undersøgelse. Først viser vi, at miR-143-ekspression tydeligt nedreguleres under prostatakræft progression. Screening strategier har medført påvisning af prostatakræft ved progressivt tidligere stadier og lavere niveauer af prognostisk risiko [20]. I mange mænd, prostatakræft har en lang naturhistorie, mens andre vil udvikle sig til metastatisk stadie og dør af deres sygdom (gennemgået i [21]). Trods den accepterede værdi måle prostata-specifkke antigen (PSA) niveauer for at screene for prostatakræft diagnose, dens værdi som en prognostisk markør er stadig et spørgsmål om forhandling. Andre tumor-relaterede parametre, herunder klinisk iscenesættelse hjælp af TNM-systemet, Gleason biopsi score og forbehandling serum prostata-specifikt antigen (PSA) niveau i øjeblikket anvendes til at klassificere patienter som værende i lav-, mellem- eller høj-risiko for udvikling af aggressiv kræft [22] – [24]. Ingen enkelt analyse kan dog på hensigtsmæssig vis identificerer alle patienter med lokaliseret prostatacancer, der har en høj sandsynlighed for progression efter behandling. Vores fund, at miR-143 er på detektionsgrænsen i aggressiv prostatakræft kunne bidrage til at identificere sådanne patienter. I overensstemmelse med vores fund ekspression af MIR-143 har vist sig at også være nedsat i andre cancere, såsom coloncancer [25], B-celle-maligniteter [26], prostatacancer [27], hypofysetumorer [28], eller cervikal kræft [29]. Denne nedregulering af MIR-143 i prostatacancer prøver er blevet foreslået for lavere differentiering fase af tumorvævet sammenlignet det normale væv [30]. Yderligere prospektive undersøgelser for at validere miR-143 som en prædiktiv mål for prostatakræft progression er berettiget.

Det andet store fund af vores undersøgelse er den observation, at redningen af ​​miR-143-ekspression i prostatakræft celler resulterer i ophævelsen af cancercellevækst, både in vitro og i mus. Vi beviste, for første gang, at MIR-143 er en tumorsuppressor i mus. Andre undersøgelser har peget på en tumor suppressor rolle miR-143 i tyktarmen og andre kræftceller [26], navnlig gennem hæmning af KRAS, og ERK5 proteiner [26], [31]. Det har vist sig, at ERK5 kan være en direkte eller indirekte mål for miR-143 [32]. Vi viser nu, og vi giver nok beviser for, at ERK5 er et direkte mål for miR-143 i prostatakræft. Dette understøttes af tilstedeværelsen af ​​MIR-143 bindingssted i 3’UTR af ERK5 mRNA. Endvidere MIR-143 inhiberer ekspression af et reporter-protein, når dette bindingssted erstatter 3’UTR af luciferase mRNA. Endelig er ekspressionen af ​​ERK5 protein omvendt korreleret til MIR-143 ekspression i humane prostatakræft. ERK5 har været impliceret i reguleringen af ​​celledeling, og er den mest nyligt identificerede MAPKK [33]. Aktiviteterne af flere transkriptionsfaktorer, hovedsagelig er impliceret i cancer er blevet vist at være reguleret af ERK5, herunder MEF2, c-Fos og Fra1, Sap-1, c-myc og NF-kappaB [34] – [37]. I overensstemmelse med vores resultater ERK5 overekspression er associeret med metastatisk prostatacancer og inducerer proliferation, motilitet og invasion i prostatacancerceller [38].

Sammenfattende har vi vist, at MIR-143 er en tumorsuppressor miRNA i prostatacancer , der styrer celledeling og overlevelse gennem modulering af, i det mindste delvist ERK5 ekspression. Redning af miRNA udtryk i prostata tumorer bør derfor betragtes som nyt mål for prostatakræft behandling.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle humane prøver blev købt. Vores udbydere Biochain (Hayward, CA), cytomix (Lexington, MA) har de nødvendige tilladelser.

Kliniske prøver

Syvogtredive ikke-parret (13 normal og 24 tumor RNA fra forskellige patienter ) og en parret prostata tumor og dens omgivende upåvirkede væv RNA’er blev opnået fra Biochain (Hayward, CA), cytomix (Lexington, MA).

Dyr., og in vivo elektroporation

Male athymiske nøgne mus (Foxn1 nu /nu) (Harlan, Grannat, Frankrig) blev anvendt i en alder af 7 uger. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med den europæiske konvention om beskyttelse af hvirveldyr, der anvendes til forsøg og godkendt af Comité d’Ethique du IRCM de Montpellier, som er den lokale etiske komité. Xenografter blev oprettet ved subkutan injektion 2 × 10

6 LNCaP eller c4-2 celler i 100 ul af en Matrigel løsning. målinger tumorvolumen blev taget hver to dage lige før elektroporering. Ved eutanasi blev tumorer udskåret og enten frosset til RNA-ekstraktion eller fikseret i 4% formalin i immunhistologisk analyse. For intra-xenotransplantat elektrotransfer blev mus bedøvet ved intraperitoneal injektion af en ketamin (30 mg /kg) og xylazin (10 mg /kg) opløsning. 500pmole af miR-143 forløber eller krypteret miR blev injiceret i 100 pi PBS i xenograft. Før injektioner blev ekkografisk gel påført, transkutane elektriske impulser blev påført ved anvendelse af to specialfremstillede rustfri stålplade elektroder placeret på hver side af xenograft som tidligere beskrevet (Takei et al., 2008). Kort fortalt blev 8 firkantet bølge elektriske pulser af 50 ms længde, og en udgangsspænding på 100 V /cm genereret af en elektropulsator ECM-830 (BTX, San Diego, CA, USA).

Cell kultur og transfektioner

PNT2 prostata epitelial cellelinje blev opnået fra ECACC (Sigma-Aldrich, Lyon, Frankrig). Androgen-sensitive LNCaP og androgen-uafhængige c4-2 humane prostata carcinom-cellelinier blev indkøbt fra ViroMed Laboratories (Minnetonka, MN). Disse cellelinier blev opretholdt som tidligere beskrevet [16]. Transfektioner med MIR-143 precursor, anti-miR 143 (HSA-mir-143, Ambion) blev udført ved koncentration på 50 nM med Dharmafect 2 (Dharmacon, Lafayette, CO). Kontrollen er et ikke-relevant miR precursor, som vil blive lagret i en stabil form af RNAi maskiner. Den anti-MIR-143 er i stand til at inhibere MIR-143 til stede i celler ved hybridisering. At knockdown ERK5 proteinniveau transfektioner blev udført med 2 ug plasmid pSUPER-shERK5 eller med en negativ kontrol, pSUPER-shNeo med JetPEI transfektant. Efter 48 timer blev celler behandlet med BrdU og derefter fikseret med 4% paraformaldehyd til yderligere analyse.

RNA-isolering, revers transkription og kvantitativ real-time PCR blev udført

Total RNA og qPCR forsøg som beskrevet [17] .De oligonucleotidsekvenser anvendt til forskellige eksperimenter i dette manuskript er tilgængelige efter anmodning.

Kvantitative Real-Time PCR for modent microRNA

cDNA blev revers transkriberet fra 10 ng af den samlede RNA-prøver ved anvendelse af specifikke primere fra Taq Man miRNA tests og reagenser fra Taq Man MicroRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). Det resulterende cDNA blev amplificeret ved PCR under anvendelse af Taq Man MicroRNA Assay primere med Taq Man universal PCR Master Mix og analyseret med et 7300 ABI PRISM Sequence Detector System ifølge producentens instruktioner (Applied Biosystems). Brug af den sammenlignende CT-metoden anvendte vi endogen kontrol (RNU48) for at normalisere ekspressionsniveauerne af miRNA. De assay navne for miR-143 og U48 var som følger:. HSA-mir-143 for miR-143 og RNU48 for U48-RNA

MicroRNA target forudsigelse

Vi brugte miRBase Mål (http: //microrna.sanger.ac.uk/targets/v5/) og Targetscan (https://www.targetscan.org/) for microRNA target forudsigelse.

MIR Reporter luciferaseassays

3’UTR eller mutant 3’UTR af ERK5 blev klonet i Xbal-stedet i pGL3-Control Vector, umiddelbart nedstrøms for stopkodonen af ​​luciferase kodende sekvens. COS-celler blev co-transficeret med 0,5 ug pGL3-baserede vektorer og forskellige koncentrationer af MIR-143-precursor som indikeret ved hjælp af Lipofectamine 2000. Luciferase aktivitetsmålinger blev normaliseret til β-galactosidaseaktivitet for at korrigere for forskelle i transfektionseffektivitet.

Immunoblots

Protein ekstraktion, og Western blot analyser blev udført som tidligere beskrevet [18]. Filtrene blev inkuberet natten over ved 4 ° C med kanin-anti-ERK5 antistof (Cell Signalling Technology, Danvers, MA) og derefter i 1 time ved stuetemperatur med et anti-kanin peroxidase-konjugat sekundært antistof. Komplekset blev visualiseret med forøget kemiluminescens (Interchim, Montluçon, Frankrig).

Immunhistokemi af ERK5

Tissue Arrays (TMA) Accumax Array indeholder 7 normal og 39 adenocarcinom pletter fra forskellige patienter blev opnået fra Alphelys (Plaisir, Frankrig). Til immunhistokemisk farvning blev TMAs depleteret af paraffin med xylen, rehydreret og kogt (95 ° C, 30 min) i 0,01 M natriumcitratbuffer. Efter blokering af Fc-receptorer med PBS indeholdende 5% gedeserum blev snit inkuberet med anti-ERK5 kanin-polyklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) natten over ved 4 ° C. Immunfarvning blev afsløret under anvendelse af peroxidase-konjugeret anti-kanin eller anti-muse-sekundært antistof (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) og diaminobenzidin chromogen (Dako, Carpinteria, CA) som et substrat. Snit blev modfarvet med hematoxylin (Vector, Burlingame, CA). Monteringsløsning (Dako) og dækglas blev sat til afsnittene.

BrdU farvning

prolifererende c4-2, LNCaP og PNT2 celler blev inkuberet i 6 timer med BrdU. Celler dyrket på dækglas blev fikseret med 4% formaldehyd i PBS i 15 minutter ved 4 ° C og derefter vasket i PBS og permeabiliseret i 10 minutter i 0,25% Triton X-100 i PBS. Efter permeabilisering blev DNA denatureret i 2 N HCI i 10 minutter, og celler blev inkuberet med blokeringsbuffer (PBS-1% BSA). BrdU blev derefter detekteret med anti-BrdU-monoklonalt antistof (Dako, Carpinteria, CA) og visualiseret med et FITC anti-mus sekundært antistof (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA).

In situ-hybridisering

LNA-modificerede prober (Exiqon) var 3′-enden mærket med digoxigenin-ddUTP med terminal transferase hjælp af Dig-3′-enden mærkning kit (Roche Diagnostics, Frankrig). 5 um-tynde snit blev udtømt for paraffin med xylen og rehydreret i en seriel fortynding af ethanol (2 x 100%, 75%, 50%, 25%). Objektglas blev vasket med PBS, spaltet med proteinase K (10 ug /ml) i 5 minutter ved 37 ° C, skyllet i 0,2% glycin /PBS derefter i PBS, og postfikseret med 10% formaldehyd i PBS (10 min). Objektglas blev derefter skyllet med PBS (2 X). Objektglas blev derefter præhybridiseret ved 54 ° C i 2 timer i hybridiseringspuffer (50% formamid, 5 x SSC, 0,1% Tween-20, indstillet til pH 6,0 med 9,2 mM citronsyre, 50 ug /ml heparin, 500 ug /ml gær-tRNA) . Derefter blev objektglassene hybridiseret i inkubationstider kamre natten over ved 54 ° C i en ovn med konstant bevægelse, ved hjælp af 2 pi probe i -200 pi forvarmet hybridiseringspuffer. Snit blev skyllet to gange i 2xSSC, efterfulgt af 3 vaske på 30 minutter ved 54 ° C i 50% formamid /2 x SSC. Sektioner blev derefter skyllet 5 gange i PBS /0,1% Tween-20 (PBST), og blokeret i 1 time i blokerende opløsning (2% fåreserum, 2 mg /ml BSA i PBST).