PLoS ONE: The Long-kodende RNA MALAT-1 udtrykkes kraftigt i kræft i æggestokkene og inducerer cellevækst og Migration

Abstrakt

Baggrund

Metastase forbundet i lunge adenocarcinom udskrift-1 (MALAT- 1) overudtrykkes under cancer progression og fremmer cellemigration og invasion i mange faste tumorer. Dog forbliver sin rolle i kræft i æggestokkene dårligt forstået.

Metoder

Udtryk af MALAT-1 blev påvist i 37 normale æggestokkene væv og 45 ovariecancer væv ved revers transkription polymerasekædereaktion (RT PCR). Celleproliferation blev observeret ved CCK-8 assay; Flowcytometri blev anvendt til måling cellecyklus og apoptose; Cellemigrering påvist ved transwell migration og invasion assay. For at evaluere funktionen af ​​MALAT-1, shRNA kombineret med mikromatrice og Functional berigelse analyse blev udført for at bestemme de transkriptionelle virkninger af MALAT-1 silencing i OVCAR3 celler. RNA og protein-ekspression blev målt ved QRT-PCR og Western blotting, henholdsvis.

Resultater

Vi fandt, at opregulering af MALAT-1 mRNA i kræft i æggestokkene væv og forbedret MALAT-1-ekspression var forbundet med FIGO stadium. Knockdown af MALAT-1-ekspression i OVCAR3 celler hæmmede celleproliferation, migration og invasion, hvilket fører til G0 /G1 cellecyklusstop og apoptose. Overudtrykt MALAT-1-ekspression i SKOV3-celler fremmes celleproliferation, migration og invasion. Nedregulering af MALAT-1 resulterede i signifikant ændring af genekspression (mindst 2 gange) i 449 gener, som regulerer proliferation, cellecyklus, og adhæsion. Som en konsekvens af MALAT-1 knockdown, MMP13 proteinekspression faldet, mens ekspressionen af ​​MMP19 og ADAMTS1 blev øget.

Konklusioner

Den foreliggende undersøgelse viste, at MALAT-1 er stærkt udtrykt i æggestokkene tumorer. MALAT-1 fremmer væksten og migration af æggestokkene cancerceller, hvilket tyder på, at MALAT-1 kan være en vigtig bidragyder til æggestokkene udvikling af kræft

Henvisning:. Zhou Y, Xu X, Lv H, Wen Q, Li J , Tan L, et al. (2016) The Long-kodende RNA MALAT-1 udtrykkes kraftigt i kræft i æggestokkene og inducerer cellevækst og Migration. PLoS ONE 11 (5): e0155250. doi: 10,1371 /journal.pone.0155250

Redaktør: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institut, KINA

Modtaget: Januar 4, 2016 Accepteret: April 26, 2016; Udgivet: May 26, 2016

Copyright: © 2016 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra videnskab og informationsteknologi agentur Guangzhou (nr 2010GNE00221) og mekanismen for undersøgelse af MALAT1 Fremme invasion og Metastase af Kræft i æggestokkene ved målrettet Regulering STAT3 signalvejen (nr 2014A020212517)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer ( EOC) er den mest dødelige gynækologiske malignitet, der tegner sig for en betydelig kræft død hvert år [1]. og [2]. På grund af uspecifikke symptomer i den tidlige fase af sygdommen og manglen på effektive screening teknikker i klinikken, de fleste (op til 75%) af patienterne diagnosticeret i fremskredne stadier, når sygdommen allerede har spredt sig ud over bækken, hvilket resulterer i en dårlig prognose [3,4]. Trods vedvarende bestræbelser på at forbedre EOC diagnose og behandling, tumor tilbagefald og metastaser stadig væsentlige hindringer for en vellykket behandling af EOC patienter [5]. Således er et presserende behov for forskning på kræft i æggestokkene tidlig påvisning og forbedring af de nuværende behandlingsstrategier.

Det er almindeligt accepteret, at udviklingen af ​​kræft er et resultat af ændret genekspression og /eller strukturelle ændringer af protein-kodende gener. Imidlertid afslørede genom-dækkende sekventeringsdata, at tusinder af gener mangler protein-kodende kapacitet, der spiller vigtige roller i reguleringen af ​​cellevækst, overlevelse og apoptose og tumorigenese eller andre sygdomme [6]. Vores forskning er fokuseret på MALAT-1, oprindeligt identificeret i ikke-småcellet lungekræft, er et stort ikke-kodende RNA, som er tæt forbundet med tumormetastase og regulerer ekspression af forskellige metastase-associerede gener [7]. MALAT-1 er placeret på kromosom 11q13.1, spænder over en 8.7kb genomiske region, og er bredt udtrykt i normale væv, især i lungen og bugspytkirtel [8] ,. MALAT-1 specifikt tilbageholdt i de nukleare prikker [9], hvor præ-mRNA-splejsning faktorer er beriget og således kan fungere som en samling, lagring og /eller ændring rum [10]. MALAT-1 har også været impliceret i tumorudvikling [11]. Data er angivet, at MALAT-1 var involveret i udviklingen af ​​kræft gennem regulering af alternativ splejsning af sit mål gener [12] eller genekspression [13,14]. MALAT-1 ekspression er blevet fundet at være opreguleret i mange faste tumorer, såsom lunge- [8], lever [15], og prostatacancer [16] og har en tumorfremmende funktion. I denne undersøgelse, vi målte MALAT-1-ekspressionsniveauer i primære normale æggestok og æggestokkene tumorvæv og undersøgte den biologiske rolle MALAT-1 i æggestokkræft patogenese.

Materialer og metoder

2.1 Tissue prøver

37 epitel eksemplarer af normal ovarie og 45 eksemplarer af kræft i æggestokkene væv blev opnået fra The Third Tilknyttede Hospital i Guangzhou Medical University i løbet af 2009-2013. Alle æggestokkene kræfttilfælde ikke modtog behandling før operation og blev diagnosticeret histologisk ifølge WHO bog gynækologisk patologi (tabel 1). Disse vævsprøver blev lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Denne undersøgelse blev godkendt af institutionelle gennemgang af bred af Guangzhou Medical University og en skriftlig informeret samtykke blev opnået fra alle patienter før deltagelse i denne undersøgelse.

2.2 Cell linje og kultur

ovariecancer cellelinie OVCAR3, SKOV3 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% streptomycin /penicillin ved 37 ° C i 5% CO

2. Celler blev høstet i logaritmisk vækstfase for alle nedenfor beskrevne eksperimenter.

2.3 RNA-isolering og QRT-PCR

Totalt cellulært RNA blev isoleret fra væv og cellelinje under anvendelse af Trizol-reagens (Takara Bio, Inc., Shiga, Japan) og derefter omvendt transkriberet til cDNA ved anvendelse PrimeScript RT Master Mix (Takara) ifølge producentens instruktioner. qPCR blev udført for at bestemme ekspressionen af ​​MALAT-1, MMP-13, MMP-19, ADAMTS1, og β-actin-mRNA under anvendelse af en SYBR GREEN MIX kit fra Promega (Madison, WI, USA) i overensstemmelse med producentens protokoller. Primere sekvenser er vist i tabel 2. Ø-actin mRNA niveauer blev anvendt som en intern slutning.

2.4 Design og konstruktion af MALAT-1vectors og gen transfektion

For at vurdere, hvilken rolle af MALAT-1 i kræft i æggestokkene, vi bankede ned MALAT-1-ekspression ved hjælp shRNAs og overudtrykt MALAT-1-ekspression ved hjælp pcDNA3.1 (+) – MALAT-1 (a-MALAT-1). Vi har designet og bygget fire sæt MALAT-1 shRNA oligonukleotider (shM1-M4) og klonet dem i pGPU6 /GFP /Neo vektor (Jima, Shanghai, Kina). Sekvenserne var MALAT-1-shM1, 5′-GCCGAAATAAATGAGAGAT GA-3 ‘; shM2, 5’-GG CAGCTGTTAACAGATAAGT-3 ‘; shM3, 5’-GCTGTGGAGTTCTTA AATATC-3 ‘; shM4, 5’-GGGCTTCAGTGATGGGATAGT-3 ‘. Den pGPU6 /GFP /Neo-vektoren, der indeholder en tilfældig DNA-sekvens blev anvendt som en scramble-kontrol (shNC). Efter kloning amplifikation og DNA-sekventering, transficerede vi disse vektorer i OVCAR3 celler. Kort fortalt blev celler podet i en 6-brønds plade og dyrket natten over, da den nåede 70-80% konfluens. OVCAR3 blev transficeret med shM1, shM2, shM3, shM4 eller shNC anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. SKOV3 blev transficeret med pcDNA3.1 (+) – MALAT-1 og pcDNA3.1 (SKOV3-NC). Celler blev undersøgt 48 timer efter transfektion under et inverteret fluorescensmikroskop at vurdere transfektionseffektiviteten. Celler blev derefter høstet og underkastet QRT-PCR-analyse af MALAT-1-ekspression. Fordi MALAT-1 shM3 var mest effektive til at opnå knockdown af MALAT-1-ekspression, blev udført alle efterfølgende eksperimenter ved hjælp af denne shRNA.

2,5 Cell proliferation assay

For at vurdere virkningerne af MALAT-1 i ovariecancerceller, vi først podet celler i 96-brønds plader med 5 x 10

3cells /brønd og dyrket natten over. Celler blev derefter transficeret med MALAT-1-shM3, shNC, aMALAT-1 og SKOV3-NC. Celleproliferation blev målt ved anvendelse af CCK-8 assay (Biyuntian, Shanghai, Kina) i intervaller 24T i op til 96 timer. Kort fortalt blev 10 pi CCK-8-opløsning tilsat til hver brønd af cellekultur, og pladerne blev yderligere inkuberet i yderligere 2,5 timer. Den optiske densitet blev derefter målt ved FACS-analyse ved absorbans 450 nm. Eksperimenter blev udført tre gange og gentages mindst tre gange uafhængigt af hinanden.

2.6 Transwell tumorcellemigration og invasion assay

Transwell kamre med 8 um porer blev indhentet fra Corning (Corning, NY, USA ). Celler transficeret blev høstet, resuspenderet i DMEM uden FBS i en koncentration på 1 x 10

6 celler i 100 pi, og derefter podet i de øvre kamre i 24-brønds plade. De nedre kamre blev fyldt med 600 pi DMEM indeholdende 10% FBS. Celler blev derefter inkuberet i 24 timer. Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev celler, som vandrede ind i bagsiden af ​​Transwell membran fikseret med methanol, farvet med krystalviolet, og derefter talt under et lysmikroskop ved x100 forstørrelse. Et gennemsnit på fem visuelle felter blev undersøgt. For tumorcelleinvasion assay Transwell membran blev præ-coatet med 30 pi Matrigel (1: 3 blandet med PBS; BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland) og fortsatte de samme som beskrevet ovenfor

2.7 Cell. cyklus og apoptose flowcytometri assay

celler blev høstet og resuspenderet ved en densitet på 5-10 x 10

6 celler /ml og derefter fikseret med 75% iskold ethanol og farvet med 400 pi propidiumiodid (PI) opløsning (BestBio, Shanghai, Kina) i 30 minutter og derefter udsat for cyklusanalyse med et flowcytometer (BD). For apoptose analyse blev celler farvet med 5 pi Annexin V-FITC (BD Biosciences) i 15 minutter og 5 pi PI i yderligere 5 minutter, inden de blev udsat for flowcytometrianalyse.

2.8 profilering differential gen udtryk efter MALAT-1 knockdown i æggestokkene cancerceller

Total RNA blev udtrukket med TRIZOL reagens og kvantificerede af NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific). Integriteten af ​​RNA’er blev vurderet ved anvendelse Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). cDNA biblioteker blev konstrueret fra prøver med en RNA integritet nummer (RIN) ≥7.0. Totale RNA’er blev transskriberet til dobbeltstrengede cDNA og derefter syntetiseret cRNA’er. Derefter blev 2. cyklus cDNA’er syntetiseret fra cRNA’er. Fulgt fragmentering og biotin mærkning, blev 2. cyklus cDNA’erne hybridiseret på microarray. Efter vask og farvning blev arrays scannes af Affymetrix Scanner 3000 (Affymetrix)

2.9 genanalyse

Genespring software (version 12.5, Agilent Technologies). Blev brugt til at fuldføre genekspression analyse. Differentielt udtrykte gener (DEG) blev identificeret under anvendelse gange ændring samt P-værdi beregninger. Tærsklen til valg differentielt udtrykte gener var en fold ændring 2.0 og en P-værdi 0,05. Kegg og GO-analyse blev udført for at bestemme de veje og GO vilkår forbundet med differentielt udtrykte mRNA. Hierarkisk Clustering (HCL) blev udført for at vise skelnes gen ‘udtryk mønster blandt prøver.

2.10 Analyse af mRNA ekspressionen af ​​DEGS ved QRT-PCR

For at verificere microarray resultater, tolv anderledes udtrykt gener blev valgt til QRT-PCR validering ved hjælp af en SYBR GREEN MIX kit (Promega, USA) og en FAST 7500 Real-Time PCR-system efter producentens anvisninger, usingβ-actin som en intern kontrol. Sammenlignende kvantificering blev bestemt ved 2-ΔΔCt beregningsmetoden. Kandidatgener andβ-actin genet, blev amplificeret i den samme reaktion og udføres tredobbelt. PCR-primer-sekvenser blev anført i tabel 2.

2.11 Protein ekstraktion og Western blot

Totalt cellulært protein blev ekstraheret fra transficerede celler og proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af et BCA proteinassaykit (Beyotime, Beijing , Kina). Disse proteinprøver blev løst i 10% SDS denatureret polyacrylamidgel og overført til PVDF-membraner med en porestørrelse på 0,45 um (Millipore, Billerica, MA, USA). Efter blokering i 5% skummetmælk i Tris-baseret saltopløsning-Tween 20 (TBST) i 60 minutter ved stuetemperatur blev membranerne inkuberet med muse /kanin-anti-humane antistoffer i den anbefalede fortynding [ADAMTS1 og MMP19 ved en fortynding på 1: 1000, MMP13 ved 1: 500 (alle fra ABCAM, Cambridge, MA, USA)] natten over ved 4 ° C. Efter vasket i TBST blev membranerne inkuberet yderligere med et sekundært anti-muse (1: 2500) eller anti-kanin (1: 10000) antistof i 1 time. Forøget kemiluminescens (ECL) opløsning blev tilføjet på membranerne og proteinekspression blev kvantificeret under anvendelse af laboratoriearbejdet Image Acquisition og Analysis Software (UVP, Upland, CA, USA). Glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en loading kontrol.

2.12 Statistisk analyse

Alle data blev udtrykt som middel ± SD. Forskelle mellem to grupper blev vurderet ved anvendelse af Fisher eksakt test eller Students

t

test, mens forskellen mellem flere grupper blev analyseret ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni multiple sammenligninger test. Differentielt udtrykte gener efter knockdown af MALAT-1-ekspression blev vurderet ved hjælp af cDNA microarray (Affymetrix HTA 2.0), er identificeret som fold ændringer og analyseret ved hjælp af Students

t

test. p. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

3.1 Differentiel udtryk for MALAT-1 mRNA i æggestokkene kræft vævsprøver

MALAT-1 mRNA-ekspression i kontrol normal æggestok og primære ovariecancer væv blev vurderet ved QRT-PCR og normaliseret til en intern kontrol (β-actin). Ekspression af MALAT-1 i ovariecancer væv er betydeligt højere end den for i normalt ovarie (figur 1). Desuden er MALAT-1-ekspression signifikant associeret med Figo stadier, men ingen sammenhæng blev identificeret mellem MALAT-1-ekspression og alder, histologisk type, kvalitet, eller forekomst af ascites (tabel 1). Disse data tydede på, at høje MALAT-1-ekspression var forbundet med ovariecancer progression.

MALAT-1-ekspression er betydeligt højere i kræft i æggestokkene væv. *

s

0.05.

3.2 MALAT-1 er forbundet med spredning, migration og invasion af ovariecancerceller

Dernæst vi konstrueret fire shRNAs målrettet MALAT-1. shRNA3 var den mest effektive i silencing MALAT-1 ekspression i OVCAR3 celler (fig 2A). Derfor brugte vi denne shRNA i alle de følgende eksperimenter. MALAT-1 knockdown betydeligt reduceret æggestokkræft celledeling begynder på dag 2 nåede de højeste niveauer ved dag 5 (Fig 3A). Desuden MALAT-1 knockdown også signifikant undertrykt OVCAR3 migration og invasion kapacitet (fig 3C og 3E). SKOV3 blev højt udtrykt ved transficeret ved pcDNA3.1 (+) -. MALAT-1 og opregulering af MALAT-1-induceret SKOV3 proliferation, migration og invasion (figur 3B og 3D og 3F)

(A) qRT- PCR-analyse af MALAT-1-ekspression efter shRNA knockdown. OVCAR3 celler blev dyrket og transficeret med fire forskellige MALAT-1 shRNA vektorer (shM1 til shM4) og derefter underkastet QRT-PCR-analyse. *

s

. 0,05 versus kontrol grupper (B) SKOV3-celler blev dyrket og transficeret med pcDNA3.1 (+) – MALAT-1 og pcDNA3.1 (NC) og underkastet QRT-PCR-analyse, *

s Restaurant 0,05 versus kontrolgrupper.

(A) og (B) Celleproliferation CCK-8 assay. Ovariecancerceller blev dyrket og transficeret og derefter underkastet CCK-8 assay. *

s

0,05 versus kontrolgrupper. (C) og (D) Transwell tumorcellemigration assay. Ovariecancerceller blev dyrket og transficeret og derefter underkastet Transwell tumor cellemigrationsassay. (E) og (F) Transwell tumorcelleinvasion assay. Æggestokkene cancerceller blev dyrket og transficeret og derefter underkastes Transwell tumor celle invasion assay **

s

0,0001 versus kontrolgrupper.

3.3 Knockdown af MALAT-1-ekspression inducerer apoptose og arrestationer cellecyklus ved G0 /G1 fase

Da knockdown af MALAT-1 hæmmede celleproliferation (Fig 3A ), vi derefter undersøgt MALAT-1 funktion i reguleringen ovariecancer cellecyklusprogression og apoptose. Vores data viste, at de apoptotiske celler i OVCAR3-shM3 celler markant blev øget til 17,8% mod 0,03% i OVCAR3-shNC celler og 0,02% i forældrenes OVCAR3 celler (p 0.001, Fig 4A og 4C). Endvidere cellecyklusanalyse ved flowcytometri viste, at knockdown af MALAT-1-ekspression anholdt OVCAR3-shM3 cellerne på Go /G1-fasen af ​​cellecyklussen og de procentdele af celler i S og G2 /M-faser blev også reduceret (P 0,0001 versus kontroller. (D) Kvantificering af data i B, * p 0,05 versus kontroller.

3.4 nedregulering af MALAT-1 påvirkninger udtrykket af et stort antal gener

De genekspression profiler af OVCAR3-shNC og OVCAR3-shM3 celler blev analyseret ved microarray analyse, og 449 signifikant differentielt udtrykte gener ( 2 gange) blev identificeret. Blandt dem, blev 206 gener nedreguleret, mens 243 gener var opreguleret i ovariecancerceller med shRNA-medieret MALAT -1-silencing sammenlignet med kontrollen OVCAR3 celler. En distinkt liste af gener reguleres af MALAT-1 som påvist ved ukontrollerede hierarkiske clustering (Fig 5A). Vi derefter udført QRT-PCR for 12 tilfældigt udvalgt genesto bekræfte microarray resultater. De QRT-PCR-resultater er meget sammenlignelige med resultaterne fra cDNA microarray analyse, hvor

FRK

,

MUC16

,

MAP2K6

,

FXYD3

,

FDCSP

,

MAOB

,

GBP2

, og

TNFSF10

blev ned- reguleret,

NEXN

,

TSPAN2

,

ANKRD1

, og

BHLHE41

blev opreguleret i OVCAR3-shM3 celler sammenlignet med de shNC celler (fig 6). Desuden GO og Kegg berigelse analyse af de mest op- og ned-regulerede gener henholdsvis identificeret betydeligt overrepræsenteret funktioner fremhæve en rolle MALAT -1 vedrørende invasion og metastase af kræft i æggestokkene celler. Desuden regul ation af transskription, positiv regulering af celledeling, cellecyklus, cellevækst og celleadhæsion af MAPK signalering eller P53 signalveje var påvirket af MALAT-1-ekspression. (S1-S4 figurerne).

Unsupervised hierarkiske clustering analyse af de globale udtryk profiler af de forskelligt udtrykte gener. Kolonne repræsenterer Sampl, og række repræsenterer gen, grøn repræsenterer et lavere niveau genekspression og rød repræsenterer en relativ højere af genekspression.

Grafen viste den gennemsnitlige fold forskel, FRK, MUC16, MAP2K6, FXYD3 , FDCSP, MAOB, GBP2, TNFSF10 blev nedreguleret, NEXN, TSPAN2, NKRD1, BHLHE41 var opreguleret i OVCAR3-shM3 celler. (P 0,05)

3.5 MALAT-1 kan involveret i kræft i æggestokkene ved at regulere ekspressionen af ​​

MMP13

,

MMP19

,

ADAMTS1

Blandt disse DEGS, blev 79 gener betydeligt opreguleret eller nedreguleret med mindst 3 gange. Ifølge de seneste undersøgelser,

MMP19

,

ADAMTS1

MMP13

gener er tæt forbundet med metastaser og udvikling af maligne tumorer. Vi udførte derefter QRT-PCR og vestlige blotting for at bekræfte ekspressionen af ​​

MMP19

,

ADAMTS1

MMP13

gener mellem OVCAR3-shM3 og OVCAR3-shNC celler. MRNA udtryk for

MMP13

nedreguleres i shM3 celler, mens ekspressionen af ​​

MMP19 og ADAMTS1

blev øget (** P 0,01, figur 7A). Proteinekspression stemte overens med mRNA resultater (figur 7B). Undertrykkelse af MALAT-1 resulterede i nedregulering af ekspressionen af ​​

MMP13

og opregulering af ekspressionen af ​​

MMP19 og ADAMTS1

gener, hvilket indikerer, at MALAT-1 kan involveret i ovariecancer ved at regulere ekspressionen af

MMP13

,

MMP19

,

og ADAMTS1

gener.

(A) mRNA ekspressionen af ​​ADAMTS1, MMP13 og MMP19 er reguleret af MALAT -1. * P 0,05 versus kontrolgrupper. (B) ADAMTS1, MMP13, og MMP19 proteinekspression er ændret som følge af MALAT-1 knockdown. (C) Kvantificering af B. * p 0,05 versus kontrol.

Diskussion

I det menneskelige genom, har DNA-sekventering data vist, at selv om tusinder af gener mangler protein-kodende kapacitet, kunne de alligevel spiller en vigtig rolle i regulering cellevækst, overlevelse, apoptose, og tumorigenese [6]. Ikke-kodning RNA kan klassificeres efter deres størrelse i miRNA (22 nt), piRNAs (18-30 nt), korte translationelle-regulerende RNA (100-200nt), og meget længere ncRNAer (op til 10.000 nt) [17] . Den lange ikke-kodende RNA med en længde på 200 nt fået betydelig opmærksomhed for nylig. I den aktuelle undersøgelse undersøgte vi MALAT-1-ekspression i epitelovariecancer væv og undersøgt den rolle, MALAT-1 ved regulering af tumorcellemigration og invasion in vitro. Vi fandt, at MALAT-1 mRNA blev overudtrykt i tumor tissuesand MALAT-1-ekspression var forbundet med ovariecancer progression. Knockdown af MALAT-1-ekspression undertrykte tumorcelleproliferation, migration og invasion, arresterede celler ved G0 /G1 fasen af ​​cellecyklus, og induceret apoptose. Vi yderligere identificeret 79 gener, hvis udtryk blev væsentligt ændret ( 3 gange) følgende MALAT-1 knockdown. Interessant, tre af disse gener,

MMP19

,

ADAMTS1

, og

MMP13

, tidligere har været impliceret i reguleringen af ​​angiogenese, ekstra-cellulære matrix, celleadhæsion, og cancer progression. Således er vores data tyder på, at overekspression af MALAT-1 kan fremme kræft i æggestokkene progression ved at regulere ekspressionen af ​​

MMP19

,

ADAMTS1

MMP13

gener.

Metastase er den vigtigste årsag til dødelighed hos cancerpatienter. Den underliggende mekanisme for tumor metastase og tilbagefald er meget kompleks, herunder tumorcelleadhæsion, invasion, intravasation, omsætning, ekstravasation, og væksten i fjerne organisationer [18]. Ændringer i intracellulære signalveje, der kontrollerer celleproliferation og apoptose samt ekstracellulær sekretion af proteiner, som er involveret i celleadhæsion, migrering og proteolyse er af afgørende betydning for cancermetastase [19]. For nylig, er funktionen af ​​ikke-kodende RNA, såsom MALAT-1, under metastase begynder at blive værdsat [8, 14]. I gynækologiske maligniteter, er ovariecancer normalt diagnosticeres som en metastatisk sygdom. Vores nuværende undersøgelse viser, at opregulering af MALAT-1 er associeret med ovariecancer progression. Faktisk har tidligere undersøgelser vist, at MALAT-1 var signifikant opreguleret i flere typer af cancere, herunder lunge, lever, pancreas, og prostatacancer. Desuden har MALAT-1 fungerede som en metastatisk og gentagelse biomarkør for ikke-småcellet lungekræft og hepatocellulær cancer [15]. Imidlertid fremtidige undersøgelser med større prøvestørrelse er nødvendige, for at bekræfte vores resultater.

Tidligere studier viste, at tumorceller var i stand til at producere faktorer, som inducerer tumorangiogenese samt metalloproteinaser og beslægtede molekyler til at nedbryde ekstracellulære matrix [20 ]. Vores nuværende undersøgelse viste MALAT-1 knockdown modulerede ekspressionen af ​​MMP13 og MMP19, medlemmer af matrixmetalloproteinase (MMP) -familien af ​​proteiner, som er involveret i ændret ekstracellulær matrix metabolisme, tumorprogression og metastase [21, 22]. Nogle tidligere undersøgelser viste, at MMP13 unormalt udtrykkes i nogle faste tumorer, såsom papillær thyreoideakarcinom og kolorektal cancer og er forbundet med progression og metastase [23,24]. I modsætning hertil MMP19, som viser unikke strukturelle karakteristika, spiller en dobbelt rolle i væv. På den ene side, MMP19 mangel øget tidlig angiogene respons, som en negativ regulator af invasion. Imidlertid MMP-19, som er opreguleret i forskellige cancervæv, letter tumorinvasion [25]. I overensstemmelse med den antiangiogene virkning af MMP19, har adskillige rapporter vist, at metallopeptidase med thrombospondin type 1-motivet (ADAMTS1), som blev opreguleret i MALAT-1-silencing celler til at inhibere angiogenese [26-28]

, og faldt ADAMTS1 stimuleret migration og invasion af brystkræftceller [29].

til dato er der ingen rapport implicerer MALAT-1 i reguleringen af ​​MMP eller ADAMTS1 udtryk i kræft i æggestokkene. Ikke desto mindre, er baseret på vores nuværende data, vi hypotesen, at effekten af ​​MALAT-1 i at fremme kræft i æggestokkene progression kunne være medieret af opregulering af MMP13 og nedregulering af MMP19 og ADAMTS1.

For yderligere at belyse molekylære mekanismer i MALAT-1-induceret metastase, vi identificeret gener reguleret af MALAT-1-ekspression, ved at sammenligne shRNA-inhiberet versus kontrol ovariecancerceller. Yderligere udforskning af target gener og signalvejen vil give ny indsigt i de molekylære mekanismer i MALAT-1 involveret i kræft i æggestokkene progression og vil støtte i opbygningen af ​​et stærkere forudsigelse og forebyggelse regel i kræft i æggestokkene.

Støtte Information

S1 fig. GO berigelse analyse af biologisk proces på op-regulerede og ned-regulerede gener

doi:. 10,1371 /journal.pone.0155250.s001

(JPG)

S2 Fig. GO berigelse analyse af cellulære komponent på op-regulerede og ned-regulerede udskrifter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0155250.s002

(JPG)

S3 Fig. GO berigelse analyse af molekylære funktioner i up-reguleret og ned-regulerede udskrifter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0155250.s003

(JPG)

S4 Fig. Kegg berigelse analyse (pathway analyse)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0155250.s004

(JPG)

Tak

Vi takker Jiachun Lv for nyttige råd med eksperimenter .