PLoS ONE: Cytosoliske Hsp60 er involveret i NF-KB-Dependent Overlevelse af kræftceller via IKK Regulation

Abstrakt

Cytoplasmisk tilstedeværelse Hsp60, der som det væsentligste en nuklear gen-kodet mitokondrie chaperonin har ofte været anført, men dens rolle i intracellulær signalering er stort set ukendt. I denne undersøgelse viser vi, at den cytosoliske Hsp60 fremmer TNF-α-medieret aktivering af IKK /NF-KB overlevelse pathway via direkte interaktion med IKKα /β i cytoplasmaet. Selektivt tab eller blokade af cytosolisk Hsp60 ved specifik antisense-oligonukleotid eller neutraliserende antistof formindsket IKK /NF-KB-aktivering og ekspression af NF-KB målgener, såsom Bfl-1 /A1 og MnSOD, hvilket således forøgede intracellulære ROS produktion og ASK1 -afhængig celledød, som respons på TNF-α. Omvendt er ektopisk ekspression af cytosol-målrettet Hsp60 forbedret IKK /NF-KB-aktivering. Mekanistisk den cytosoliske Hsp60 forbedret IKK-aktivering via opregulering aktiveringen-afhængig serin-phosphorylering i en chaperone-uafhængig måde. Desuden viste transgene mus undersøgelse, at den cytosoliske Hsp60 undertrykte nedsat celledød induceret af diethylnitrosamin

in vivo

. Den cytosoliske Hsp60 er sandsynligvis en regulerende bestanddel af IKK-komplekset og det er belastende for første mitokondrie faktor, der regulerer overlevelsen cellen via NF-KB-vejen

Henvisning:. Chun JN, Choi B, Lee KW, Lee DJ, Kang DH, Lee JY et al. (2010) Cytosoliske Hsp60 er involveret i NF-KB-Dependent Overlevelse af kræftceller via IKK forordning. PLoS ONE 5 (3): e9422. doi: 10,1371 /journal.pone.0009422

Redaktør: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasilien

Modtaget: December 2, 2009; Accepteret: 18 Januar 2010; Udgivet: 23 Mar 2010

Copyright: © 2010 Chun et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af 21C Frontier Funktionel Proteomics Project (FPR08-B1-190) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab Teknologi og ved KOSEF gennem Center for Cell Signaling Drug Discovery Research (CCS DDR, R15-2006-020) ved Ewha Womans Universitet. Denne undersøgelse blev også delvist understøttet af en bevilling på National R Velfærd (0.420.190). J. N. Chun, K. W. Lee, J. Y. Lee, B. A. Choi, og H. I. Kim blev støttet af Brain Sydkorea 21 bevilling fra Korea Ministeriet for Uddannelse, Videnskab Teknologi. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mammale celler udtrykker en række overlevelse gener, der spiller roller ved inhibering caspaseaktivering, fjerne skadelige oxygenradikaler, forsvare mitokondriefunktion, og kontrol cellecyklus. Blandt de transkriptionsfaktorer ansvarlige for induktion af overlevelse gener, nuklear faktor-KB (NF-KB) er et centralt element, der orkestrerer den komplekse celle overlevelse respons [1]. Især NF-KB-afhængige overlevelse gener indbefatter anti-apoptotiske gener, såsom c-IAP og c-FLIP, og mitokondrielle beskyttelsesforanstaltninger gener, såsom mangan-superoxiddismutase (MnSOD) og Bcl-2-familiemedlemmer [2] [3], [4]. En central kinase i NF-KB-aktivering pathway er inhibitoren af ​​KB-kinase (IKB kinase eller IKK), der phosphorylerer IKB-proteinet i to aminoterminale serinrester, hvilket fører til dens ubiquitinylation og proteosomal nedbrydning og til den deraf følgende frigivelse af NF-KB proteiner [5]. De ekstracellulære stimuli at aktivere NF-KB-vejen konvergere til IKK [6]. Derfor er der foretaget en lang række bestræbelser på at afgrænse reguleringen af ​​IKK-aktivering. For det første har phosphorylering-afhængige regulering af IKK-aktivering blevet karakteriseret [7]. Phosphorylering af to serinrester (Ser 177 /Ser181 i human IKKβ) i aktivering T-sløjfe er essentiel for aktivering, mens autophosphorylering af carboxyl-terminale serin klynge slukker aktiveringen. Mange kinaser er blevet impliceret at være involveret i aktiveringen phosphorylering: NF-KB-inducerende kinase (NIK) [8], [9], mitogenaktiveret proteinkinase /ERK-kinase kinaser 1 (MEKK1) [10], MEKK2 /3 [11], [12], Hæmatopoietisk stamfader kinase-1 (HPK1) [13], Mixed-slægt kinase 3 (MLK3) [14], TGF-β aktiveret kinase 1 (TAK1) [15]. Men bortset TAK1, er det uklart, hvordan opstrømskinase aktiverer IKK-komplekset. For det andet har ubiquitin-afhængige regulering af IKK-aktivering undersøgt i mange år [15], [16]. For nylig er det regulatoriske underenhed IKKγ (eller NEMO) af IKK-komplekset vist sig at blive ubiquitineret, samt at anerkende Lys63-bundet polyubiquination kæden på receptor-interaktion protein 1 (RIP1) [17], [18]. For det tredje har reguleringen af ​​IKK-aktivering via interagerende proteiner blevet karakteriseret. De bedste eksempler er varmechokproteiner. For eksempel har Cdc37 og Hsp90 blevet rapporteret at virke som yderligere komponenter af IKK-komplekset, der stabiliserer det komplekse [19], [20]. Hsp27 har vist sig at interagere med IKKβ i en TNF-α-afhængig måde [21]. Hsp70 interagerer også med IKKγ men forstyrrer IKK-aktivering [22]. Desuden har foreningen mellem protein fosfatase 2Cβ (PP2Cβ) og IKK-komplekset blevet påvist [23], og ELKS er også blevet identificeret som en ny regulatorisk subunit af IKK kompleks, der medierer rekruttering af IKB til komplekset [24]. Der er imidlertid ingen indikation af en mitochondrial protein involveret i IKK /NF-KB-aktivering.

Vi har for nylig identificeret varmechokprotein 60 (Hsp60) som et IKK-interagerende protein. Hsp60 er den mitokondriske chaperonin der fremmer foldningen af ​​det indførte protein til nativ konformation. Ikke desto mindre har eksistensen og funktionen af ​​Hsp60 i extramitochondrial rum ofte blevet anført [25]. For eksempel kan Hsp60 være en ligand for celleoverfladereceptorer som toll-like receptor [26]. Intracellulært Hsp60 har vist sig at interagere med pro-caspase-3 eller Bax [27], [28], [29]. Imidlertid har funktionen af ​​Hsp60 relateret til celleoverlevelse signalering ikke blevet rapporteret. I denne undersøgelse blev Hsp60 fundet at mediere NF-KB-afhængige overlevelse signalering i cellerne. Specifikt Hsp60 direkte interageret med IKKα /β i cytoplasmaet og derefter fremmet phosphorylering-afhængig aktivering af kinasen i afhængighed af TNF-α. En sådan signalering funktion af Hsp60 var uafhængig af dens chaperone aktivitet, der sætter Hsp60 fra andre varme shock proteiner, der fungerer via stabilisering eller destabilisere signalering kompleks [30]. Vi viste også

in vivo

bevis for, at cytosolisk ekspression af Hsp60 beskytter leverceller mod kemisk-inducerede skader via øge IKK-aktivering. Således dette fund repræsenterer romanen pro-overlevelse funktion af cytosolisk Hsp60 og kaste lys på forståelse af funktion Hsp60 i ekstra-mitokondrie rum [25].

Resultater

Hsp60 interagerer med IKK kompleks i cytoplasmaet

for at identificere en yderligere komponent, undersøgte vi den molekylære sammensætning af den latente IKK-komplekset under anvendelse af en proteomisk teknik kombinerer immuno-affinitetsoprensning og massespektrometri. Kort fortalt blev IKK-komplekset udfældes fra lysater af ustimulerede HeLa S3-celler under anvendelse af anti-IKKα antistof-perler, og de co-udfældede proteiner blev sekventeret ved væskekromatografi-tandem-massespektrometri. Identifikationen af ​​de IKK underenheder og Hsp90 indikerede, at immunoprensning af IKK-komplekset temmelig arbejdede (fig. 1A). Som følge heraf er denne proteomik undersøgelse identificeret et varmechokprotein, Hsp60, i præcipitaterne (fig. 1A og 1B). Tilstedeværelsen af ​​IKK-underenheder og Hsp60 i præcipitaterne blev bekræftet ved immunoblotting (Fig. 1C). Derefter besluttede vi at undersøge den biologiske betydning af IKK-Hsp60 interaktion.

A. En sølvfarvet polyacrylamidgel løse affinitetsoprensede IKK-komplekset. B. MS /MS spektre af [M + 2H]

2+ ioner af peptiderne er afledt fra proteinet bånd svarende til Hsp60. C. Immunoblot (IB) analyser af IKK underenheder og Hsp60 i affinitetsoprensede kompleks. D. Interaktion af Hsp60 med IKK-komplekset. IKK kompleks blev immunpræcipiteret (IP) fra HeLa cellelysater (500 pg totalt proteiner til hver) med IKKα, IKKβ, og IKKγ-specifikke antistoffer. De IKKα /β /y-underenheder, Hsp60, Hsp90 og blev immunblottet. WCL, helcellelysat. E. TNF-α-uafhængig interaktion Hsp60 og IKK komplekset. F. Co-immunfældning af Hsp60 og IKK kompleks i cytosolisk fraktion.

Overpanel

, post-nukleare supernatant (PNS), blev cytosol (Cyto), og mitokondrier (Mito) fraktioner fra HeLa-celler immunoblottedes. COX4 og tubulin blev anvendt som mitokondrielle og cytosoliske markører hhv.

Underpanel

, Hsp60 blev immunopræcipiteret fra den cytosoliske fraktion ved hjælp af enten kontrol gede-IgG eller anti-Hsp60-antistoffer (K-19 og N-20). Repræsentative blots er vist (

n

= 3).

Det første skridt var at kontrollere den endogene samspil af Hsp60 og IKKS ved co-immunopræcipitationsforsøg. Når de heterogene IKK komplekser blev præcipiteret med antistoffer mod IKKα, IKKβ, og IKKγ, hver af IKK subunit-specifikke antistoffer ligeledes udfældede Hsp60 (fig. 1D). Derudover Hsp90 var også co-udfældet med IKK-komplekset [20], [21]. Denne interaktion blev fundet at være upåvirket af TNF-α behandling (fig. 1E), hvilket indikerer, at Hsp60 er en komponent protein af heterogene IKK komplekser. En omvendt immunpræcipitation blev derefter udført med den cytosoliske fraktion at udelukke det mitokondrielle kontaminering. De anti-Hsp60-antistoffer co-udfældet IKKγ med Hsp60, mens kontrol ged IgG ikke (fig. 1 F), bekræfter, at cytosole interaktion af Hsp60 og IKK. For at visualisere den virtuelle interaktion Hsp60 med IKKS i cytoplasmaet blev immunoguld farvning kombineret med elektronmikroskopi (EM) udføres. Immunkomplekserne af Hsp60 og IKK med deres specifikke antistoffer blev påvist forskelligt hjælp af sekundære antistoffer mærket med 20 nm- og 40 nm diameter guldpartikler hhv. Som følge heraf blev Hsp60-mærkning guldpartikler fordelt gennem de cellulære strukturer: ikke kun i matrixen og intermembrane rum af mitokondrier, men også i cytoplasmaet og plasmamembranen (Fig 2B.). I modsætning hertil blev IKKα- og IKKβ-mærkning guldpartikler hovedsageligt påvist i cytoplasmaet (fig. 2C og 2D), mens IKKα også blev påvist i kernen, hvilket er i overensstemmelse med de tidligere rapporter [31], [32] . Selvom IKK core underenheder er blevet vist at blive fundet i den mitokondriske fraktion [33], viste vores data, at IKK-mærkning guldpartikler ofte blev set i de vesikulære strukturer snarere end mitokondrier (fig. 2C og 2D). Denne uoverensstemmelse kan skyldes den tidligere undersøgelse udført med subcellulær fraktionering. Når Hsp60 og IKKS blev co-farves, direkte binding af 20 nm og 40 nm guldpartikler blev klart påvist i cytoplasmaet (fig. 2E og 2F). Det skal bemærkes, at ikke alle IKKα og IKKβ var forbundet med Hsp60. Disse resultater tilsammen indikerer, at Hsp60 direkte interagerer med IKK-komplekset i cytosolen. Salg

HeLa-celler immunreagerer med ingen primær (A), anti-Hsp60 (B), anti-IKKα (C), anti-IKKβ (D), anti-Hsp60 /IKKα (E), og anti-Hsp60 /IKKβ (F) antistoffer, og derefter mærket med de tilsvarende sekundære antistoffer konjugeret med 20 nm eller 40 nm guldpartikler som beskrevet i Forsøgsprocedure. Mærkningen blev vurderet ved immuno-guld elektronmikroskopi. Kerner (Nu) og mitochondrier (M) er vist.

Pile

indikerer direkte vedhæftning af Hsp60- og IKK-mærkede guldpartikler. Ingen immunreaktive signal blev set i prøven uden primære antistoffer (A). Forsøgene blev gentaget to gange med de samme resultater, og repræsentative resultater er vist.

Hsp60 direkte interagerer med IKKα /β, ikke IKKγ

Dernæst analyserede vi den molekylære interaktion af Hsp60 og Ikks. For at gøre dette, blev en cytosol målrettet version af Hsp60 (Hsp60c), hvor mitokondrie targeting signal sekvens slettes, konstrueret. Da Hsp60c blev co-udtrykt med hver af de IKK centrale underenheder, Hsp60c interageret med IKKα og, om end i mindre grad, med IKKβ, men ikke med IKKγ (fig. 3A). Derefter en

in vitro

bindende eksperiment under anvendelse af de rekombinante proteiner af glutathion-S-transferase (GST) -kondenseret Hsp60 og (His)

6-tagged IKK core subunits blev vurderet ved et GST pull-down assay. Resultatet, igen, indikerer, at Hsp60 binder direkte til IKKα og IKKβ, men ikke til IKKγ (fig. 3B).

A. Direkte binding af Hsp60 og IKK underenheder. De 293T-celler blev co-transficeret med Hsp60c (HA-tag), og hver af IKK subunit proteiner (Flag tag) i 24 timer. B.

In vitro

sammenslutning af Hsp60 med IKKα og IKKβ. GST-fusionerede Hsp60-proteiner bundet til glutathion Sepharose-perler blev inkuberet med lysater af Sf9-insektceller, der udtrykker hans

6-tagged IKK proteiner. Hsp60 og IKKS blev påvist ved immunoblotting for GST og HA-tags, hhv. C. Skematisk diagram, der viser deletionsmutanter af Hsp60. De formodede phosphoryleringssteder af kinaser, herunder PKA /PKG (1) og PKC (2), er vist. D og E. Interaktion af Hsp60 vildtype (WT) og deletionsmutanter med ektopisk-udtrykt IKKα i 293T-celler (D) eller til endogen IKK-komplekset i HeLa-celler (E). Kontrolvektoren (C) er indiceret. Repræsentative klatter og billeder vises (

n

= 3). N. S., uspecifik.

Den molekylære interaktion af Hsp60 med IKK blev yderligere karakteriseret ved domænenavn mapping eksperimenter. Fordi C-terminal deletion hæmmet ektopisk ekspression, en serie af N-terminale deletionsmutanter af Hsp60c blev testet for IKK binding via co-ekspression med Flag-tagget IKKα i HEK293-celler (fig. 3C). Resultaterne viste, at den N-terminale del (~160 aminosyrer fra N-terminus) af Hsp60-protein viste sig at være undværlig for interaktionen (Fig. 3D). Det samme resultat blev opnået, når endogene IKK-komplekset blev immunopræcipiteret fra HeLa-celler transficeret med de Hsp60c konstruktioner (fig. 3e). Resultaterne temmelig indikerer, at kernen bindingsdomænet ligger i midten af ​​Hsp60-protein.

Hsp60 er involveret i IKK /NF-KB-aktivering

Dernæst den biologiske effekt af cytosolisk Hsp60- IKK interaktion blev undersøgt i TNF-α-medieret NF-KB-vejen. For at nå målet, den væsentligt skridt er at manipulere niveauet af cytosolisk Hsp60 uden at påvirke den mitokondriske en fordi Hsp60-mangel er kendt for at forårsage en mitokondriske funktionel defekt [34], [35], [36]. Interessant nok har en række undersøgelser tidligere rapporteret, at et antisense oligodeoxynucleotid (AS-ODN) komplementær til en sekvens, der omgiver startkodonet af den humane Hsp60 åbne læseramme faktisk reducerer den cytosoliske Hsp60 plan [27], [37], [38] . Vi har derfor besluttet at teste dette AS-ODN (betegnet som AS-1) til en selektiv knockdown effekt. For at udelukke muligheden for ikke-specifik virkning af en bestemt ODN sekvens, valgte vi en anden AS-ODN (AS-2), som er komplementær til regionen (+ 95~ + 110 fra startkodonen) nær 5′-enden , men efter mitokondriel signalsekvenser (MTS), af Hsp60 åbne læseramme (fig. S1A). Sense-ODN (S-ODN) komplementær til AS-1 blev anvendt som kontrol-ODN. Da antisense ODN er en moderat translationel blocker, det ikke fremkalde en reduktion af den samlede Hsp60 niveau (fig. S1B). Imidlertid transfektion af AS-ODN’er faktisk reduceres selektivt cytosoliske Hsp60 niveauer sammenlignet med mock eller kontrol S-ODN uden at påvirke mitochondrial niveau (fig. 4A). For at forstå dette fænomen, vi hypotese, at halveringstiden af ​​Hsp60-protein i to rum kan være forskellige. For at bevise det, blev halveringstiden af ​​cytosolen målrettet Hsp60 (Hsp60c) vurderede efter hæmning af proteinsyntesen. Overraskende blev niveauet af cytosolisk Hsp60 protein hurtigt reduceret (beregnet

t

½ = 3,2 min), mens den samlede niveau af endogene Hsp60 og IKKα proteiner var uændret (fig. 4B). Desuden blev denne reduktion fuldstændigt blokeret ved behandlingen af ​​en proteasominhibitor MG132 (fig. 4C). Det bemærkes, at den MG132 behandling resulterede også i bemærkelsesværdig stigning af det basale niveau af Hsp60c proteinet. Således dette resultat, i det mindste delvist, forklarer, hvorfor omfanget af cytosolisk Hsp60 var mere følsom over for AS-ODN behandling, og det desuden antyder, at omfanget af cytosolisk Hsp60 kan styres ved proteasom.

A. Ablation af cytosolisk Hsp60 ved hjælp af antisense ODN’er. Den cytosoliske og mitokondriske fraktioner fremstillet af mock eller ODN-transficerede HeLa-celler immunoblottet. S, fornemmer ODN; AS-1 og AS-2, antisense ODN’er. Den mitokondriske fraktion blev indlæst ved et volumen på en femtedel af den tilsvarende cytosolisk fraktion. Især Prx III, som er en antioxidant enzym, der forefindes i den mitokondriske matrix, blev anvendt som mitokondrielle markører til at se den ikke-specifikke mitokondrie brud. B. Halveringstiden af ​​ektopisk-udtrykte Hsp60c protein (HA-mærke) efter hæmning af proteinsyntesen med cycloheximid. Intensiteten af ​​HA bånd blev målt og normaliseret for mængden af ​​IKKα band. Data i grafen er middelværdier ± standardafvigelse af to uafhængige forsøg og monteret i SigmaPlot 8.0 software. C. omsætning på cytosolisk Hsp60c protein Proteasome-afhængige. HeLa-celler blev forbehandlet med eller uden MG132 (5 uM) 30 min før cycloheximid behandling. D. TNF-α-induceret IKK og JNK1 aktivering i mock eller ODN-transficerede celler.

in vitro

kinaseaktivitet (KA) blev gennemsnit med værdierne fra to uafhængige forsøg, og den er repræsenteret som en fold forøgelse af aktiviteten versus ustimulerede og mock-transficerede celler (bane 1). E. NF-KB transkriptionel aktivering i mock eller ODN-transficerede celler. Den voksende AS-ODN (100 nM eller 200 nM) blev testet. Den relative luciferase aktivitet blev normaliseret til β-galactosidase-aktivitet og data er middelværdier ± S.D. af fire uafhængige forsøg (*

P

0,0001, **

P

0,001 versus stimulerede S-ODN-transfekterede celler).

TNF -α-induceret IKK /NF-KB-aktivering blev derefter undersøgt i AS-ODN-transfekterede celler. En

in vitro

kinaseassay viste, at transfektion af AS-ODN’er mærkbart reduceret IKK-aktivering som respons på TNF-α med 60% sammenlignet med mock eller S-ODN (fig. 4D). Men som-ODN’er havde ingen virkning på MAP-kinase-aktivering som respons på TNF-α (Fig. 4D og fig. S1c), afslører den specifikke virkning af Hsp60 AS-ODN’er på IKK-aktivering. Endvidere AS-ODN’er næsten fuldstændigt ophævede transkriptionel aktivering NF-KB som reaktion på TNF-α, hvorimod S-ODN ikke gjorde det, sammenlignet med mock-behandlede celler (fig. 4E). På grund af sin knockdown effekt, AS-1 er mere potent, at AS-2. Imidlertid har transfektion af ODN’er sig selv inducerer basal NF-KB-aktivering, hvilket indikerer ingen off-target effekt af ODN’er. Desuden den reduktive virkning fra AS-ODN’er på NF-KB transkriptionel aktivitet var også tydelig i 293T og A549-celler (fig. S1D). En ekstra kontrolforsøg viste, at AS-ODN’er ikke havde indflydelse på andet transskriptionsfaktoraktivering, såsom AP-1, NF-AT, og CRE (fig. S1E).

En lignende undersøgelse blev udført ved at blokere cytosolisk Hsp60 anvendelse af et specifikt antistof (Hsp60N), som er blevet anvendt til immunfældning og immunostaing af Hsp60 (se fig. 1). Antistoffet transduktion blev opnået ved en peptid-medieret protein delivery system [39]. Styringen ged IgG og Hsp60N antistof viste sig at blive leveret til cytoplasma, som værende ikke fusioneret med Mitotracker (fig. 5A), og Hsp60N, men ikke styre IgG, bundet til Hsp60 (fig. 5B). Dette resultat indikerer, at det leverede antistof kan fungere som en funktion blocker. Derefter blev IKK /NF-KB-aktivering undersøgt i antistof-transducerede celler. Den Hsp60N antistof åbenbart reducerede IKK-aktivering som respons på TNF-α med 50% af det niveau, der opnås med kontrol-IgG (fig. 5C). I modsætning hertil blev TNF-α-induceret JNK-aktivering ikke påvirket, hvilket igen viser, at den rolle, Hsp60 er specifik for IKK-aktivering. Konsekvent, den Hsp60N antistoffet reducerede signifikant transkriptionel aktivitet af NF-KB (Fig. 5D). Dataene kollektivt konkludere, at cytosolisk Hsp60 fremmer TNF-α-induceret IKK /NF-KB-signalering.

A. Transduktion af Hsp60-neutraliserende antistof (Hsp60N) ind i cytoplasmaet af HeLa-celler. Mitotracker Red (Molecular Probes, USA) og DAPI angiver mitokondrier og kerner, henholdsvis. B. transducerede Hsp60N antistof bundet til endogent Hsp60. Efter antistof transfektion blev HeLa cellelysater underkastes udfældning ved hjælp af protein A Sepharose-perler. De udfældede proteiner blev immunoblottedes for Hsp60. C. IKK og JNK1-aktivering som respons på TNF-α i kontrol IgG eller Hsp60N antistof-transficerede HeLa-celler.

in vitro

kinaseaktivitet (KA) blev gennemsnit med værdierne fra to uafhængige forsøg, og den er repræsenteret som en fold forøgelse af aktiviteten versus den ustimulerede og styre IgG-transficerede celler (bane 1). D. TNF-α-induceret NF-KB transkriptionel aktivering i antistof-transficerede celler (*

P

0,01 versus stimulerede IgG-transfekterede celler).

Ektopisk udtryk for cytosol -targeted Hsp60 tilstrækkeligt fremmer IKK /NF-KB-aktivering

Omvendt blev rolle cytosolisk Hsp60 i IKK /NF-KB-pathway behandlet af overekspression af cytosolen målrettet Hsp60c. Den ektopisk-udtrykte Hsp60c viste sig at associere med IKK-komplekset (fig. 6A) og markant forbedret aktiveringen IKK og NF-KB som reaktion på TNF-α (Fig. 6B og 6C). Det skal bemærkes, at ektopisk ekspression af Hsp60c marginalt inducerede den basale IKK og NF-KB-aktivering. Virkningen af ​​Hsp60c ekspression i NF-KB-aktivering blev fuldstændigt ophævet i IKKβ-manglende celler (fig. 6D), hvilket indikerer, at den regulerende aktivitet af cytosolisk Hsp60 er IKK-afhængig. Desuden har den ektopisk udtryk for Hsp60c ikke forbedre hverken JNK aktivering eller aktiveringen af ​​andre transkriptionsfaktorer såsom AP-1, CRE, og NF-AT (fig. S2). Dette resultat viser, at forøgelse af cytosolisk Hsp60 niveau forstærkes TNF-α-induceret IKK /NF-KB-aktivering.

Celler blev transficeret med enten kontrol (CGN) eller Hsp60c-kodende plasmid (HA-mærke) i 24 timer og derefter behandlet med TNF-α. A. Inkorporering af ektopisk-udtrykte Hsp60c (HA-mærke) i IKK-komplekset. B. TNF-α-induceret IKK-aktivering i HeLa-celler. C TNF-α-induceret NF-KB-aktivering i HeLa-celler (

n

= 4, *

P

0,0001 versus ustimuleret modstykke). D. TNF-α-induceret NF-KB-aktivering i transficerede IKKβ

– /- 3T3-celler (

n

= 4, *

P

0,001 versus stimuleret CGN-transficeret celler, ND ikke detekteret).

Hsp60 regulerer IKK fosforylering på aktivering T-loop

for at forstå den mekanisme ligger til grund for regulerende indgreb af Hsp60 i IKK /NF-KB-aktivering, flere eksperimentelle tilgange blev forsøgt. For at bestemme hvorvidt chaperonaktivitet af Hsp60 er påkrævet, at de to aminosyrerester, der vides at være kritisk for chaperonaktivitet af Hsp60 blev overvejet. Den ene er en lysinrest (K28), som er involveret i oligomerisering af Hsp60 protein [40], [41]. Den anden er en aspartatrest (D423), der er et aktivt sted-rest for ATPase-aktivitet [42], [43]. Således Hsp60c mutanter, hvori K28 og D423 er substitueret med glutamat og alanin henholdsvis blev konstrueret. Co-transfektion eksperiment viste, at begge mutanter interageret med IKKα og IKKβ så godt eller måske endda bedre end vildtypen (Fig. 7A). IKK-aktivering som respons på TNF-α i Hsp60 mutant-udtrykkende celler var den samme som i vild type (fig. 7B), hvilket indikerer, at sådanne tab-af-funktion-mutationer ikke påvirkede IKK-forøgende aktivitet. Endvidere blev TNF-α-induceret NF-KB transkription forstærkede endog i Hsp60 mutant-udtrykkende celler ved ca. 4-6 gange højere end i vektoren kontrol (fig. 7C). Den forstærkende virkning af mutanterne var helt IKKβ-afhængig, som prøves igen i IKKβ-deficiente 3T3-celler. Således dette forsøg ved hjælp af tab af funktion mutanter antyder kraftigt, at de cytosoliske Hsp60 fungerer uafhængigt af anstandsdame aktivitet i IKK /NF-KB-aktivering.

A. Foreningen af ​​Hsp60c vildtype (WT) og mutanter med IKKα og IKKβ. De angivne proteiner blev co-udtrykt i 293T celler som vist i fig. 3A. B og C. IKK (B) og NF-KB transkriptionel aktivering (C) i celler, der udtrykker Hsp60c vildtype og chaperone-inaktive mutanter. Kinasen og reporter aktiviteter blev analyseret som beskrevet i fig. 4 (for reporter assay,

n

= 6, *

P

0,0001 versus ustimuleret modstykke). D.

In vitro

kinaseaktiviteten af ​​IKK i nærvær af rekombinant Hsp60-protein. IKK-komplekset blev immunopræcipiteret fra HeLa cellelysater og inkuberet med eller uden de indikerede GST-proteiner (20 ug hver) i kinasereaktionspuffer i 10 min før kinasereaktionen. E. Serine phosphorylering af IKKα /β i HeLa-celler transficeret med AS-1-ODN. Data i grafen er middelværdier ± standardafvigelse (

n

= 3, *

P

0,02, *

P

0,001). F. Serin-phosphorylering af IKKα /β i Hsp60c-ekspression HeLa-celler. En repræsentativ blot vises (

n

= 3).

En af IKK-interagerende protein, ELKS, er blevet vist at mediere IKB rekruttering til IKK-komplekset [24] . For at teste denne virkningsmekanisme, blev det rekombinante Hsp60 proteinet direkte tilsat til IKK kinase reaktionen, hvor det aktiverede IKK-komplekset inkuberes med fuld-længde human IKB som substrat.

in vitro

kinaseaktiviteten af ​​den aktiverede IKK mod IKB blev ikke påvirket af tilstedeværelsen af ​​Hsp60-protein (fig. 7D), hvilket indikerer, at Hsp60 ikke er involveret i interaktionen af ​​IKK og dets substrat IkB.

Endelig en direkte inddragelse af cytosolisk Hsp60 i IKK-aktivering blev behandlet ved at undersøge aktivering-afhængige serin fosforylering i T-sløjfe af IKKα /β. AS-ODN transfektion markant afskaffede TNF-α-induceret phosphorylering af IKK ved Ser178 /181, hvilket indikerer at phosphorylering-afhængige IKK aktivering blev svækket (fig. 7E). Omvendt er ektopisk ekspression af Hsp60c resulterede i en forøgelse af IKK-phosphorylering (fig. 7F). Samlet viser dataene, at den cytosoliske Hsp60 er involveret i phosphorylering-afhængige IKK-aktivering, snarere end chaperone-afhængige stabilisering af IKK-komplekset.

Cytosoliske Hsp60 påvirker NF-KB målgenekspression og celleoverlevelse

for at bestemme betydningen af ​​cytosolisk Hsp60-medieret regulering af IKK /NF-KB-vejen undersøgte vi ekspressionen af ​​NF-KB-målgener i ODN-transficerede celler. Når ekspressionen af ​​anti-apoptotiske gener blev screenet ved en RNase- beskyttelsesbestemmelse [44], ekspressionen af ​​TRAF1, c-IAP1, og c-IAP2 ikke påvirket af AS-ODN transfektion (fig. 8A). Dette var uventet, men førte os til at postulere en mulighed, at nogle udvalgte målgener relateret til mitokondrie beskyttelse kan blive påvirket. For at teste denne, kiggede vi på induktionen af ​​flere målgener, herunder antioxidant proteiner (ferritin tung kæde og MnSOD) og Bcl-2 medlemmer (Bcl-2, Bcl-X

L, Bfl-1 /A1). Interessant nok AS-ODN afgørende formindsket induktionen af ​​kun MnSOD og Bfl-1 /A1-ekspression i respons på TNF-α (fig. 8B). Den Hsp60N antistof reducerede også signifikant induktion af disse gener (Fig. 8C). Det blev igen bekræftet, at induktionen af ​​c-IAP2 ekspression ikke blev påvirket i nogen af ​​tilfældene. Således viser resultaterne, at reguleringen af ​​IKK-aktivering af cytosolisk Hsp60 påvirker ekspressionen af ​​udvalgte NF-KB målgener.

A. RNase-beskyttelse assay for induktion af anti-apoptotiske gener i ODN-transficerede celler. Den viste autoradiogram er en repræsentant for tre uafhængige forsøg. B og C. QPCR til induktion af endogene NF-KB målgener i ODN-transficerede celler (B) og antistof-transficerede celler (C) (

n

= 3, *

P

0,001). D. TNF-α-medieret produktion af cellulær ROS i ODN-transficerede celler. De repræsentative billeder skal vises. Data er middelværdier ± S.D. af fold stigning versus ubehandlede mock celler i relative DCF fluorescens (

n

= 4, *

P

0,05, **

P

0,001). E. JNK- og p38 MAPK-aktivering i ODN-transficerede celler. Repræsentative blots er vist. Data i graferne er middel ± standardafvigelse af intensiteten af ​​phospho-JNK (P46) eller phospho-p38 bands, der var blevet normaliseret af de tilsvarende ikke-phospho-bånd (

n

= 3, *

P

0,05, **

P

0,001). F. ASK-1-aktivering i ODN-transficerede celler. Kinaseaktiviteten (KA) blev gennemsnit med værdierne fra to uafhængige forsøg, og præsenteret som en fold forøgelse af aktiviteten versus ustimulerede og mock-transficerede celler (bane 1). G. TNF-α-induceret celledød i mock eller ODN-transficerede HeLa. Data er middelværdier ± S.D. (

n

= 3, *

P

0,01). H. TNF-α-induceret celledød af coloncarcinomceller transficeret med ODN’er. Niveauet af Hsp60 i subcellulære fraktioner er vist (

Øvre

). Data i grafen er middelværdier ± standardafvigelse (

n

= 3, *

P

0,05, **

P

0,01). Celledød blev analyseret ved FACS efter farvning med annexin V-fluorescein isothiocynate og propidiumiodid.

Vi spekulerede næste om en sådan regulering af udvalgte målgener har en indvirkning på celleoverlevelse. Da der er en mulighed for, at MnSOD og Bfl-1 /A1 funktion at undertrykke mitochondriale-afledte reaktive oxygenarter (ROS) [2], [45], niveauet af cellulær ROS blev undersøgt i ODN-transficerede celler under anvendelse af et oxidations følsomme fluorescens farvestof, CM-H

2DCFDA. AS-ODN transfektion inducerede en markant forøgelse af cellulære ROS i afhængighed af TNF-α behandling i en tidsafhængig måde, sammenlignet med mock eller S-ODN transfektion (fig. 8D). Eftersom den forbedrede ROS niveau er knyttet til celledød via vedvarende JNK-aktivering [46], den vedvarende aktivering af stress-aktiverede proteinkinaser, JNK og p38 MAPK, blev undersøgt. Uventet blev fundet aktiveringen af ​​både JNK og p38 MAPK være klart opretholdt i AS-ODN-transfekterede celler (Fig. 8E). Den ASK-1 MAP3K er kendt for at være ansvarlig for den vedvarende aktivering af JNK og p38 i ROS-medieret celledød [47]. Som vist i fig.