PLoS ONE: Stanniocalcin1 (STC1) Hæmmer Cell Proliferation og Invasion af livmoderhalskræft Cells

Abstrakt

STC1 er et glykoprotein hormon involveret i calcium /phosphat (Pi) homeostase. Der er stadig flere tegn at STC1 stramt er forbundet med udviklingen af ​​cancer. Men funktionen af ​​STC1 i cancer er ikke fuldt klarlagt. Her fandt vi, at STC1 nedreguleres i kliniske væv af livmoderhalskræft sammenlignet med de tilstødende normale cervikale væv (15 tilfælde). Efterfølgende blev ekspressionen af ​​STC1 slået ned af RNA-interferens i livmoderhalskræft CaSki celler og den lave udtryk fremmet cellevækst, migration og invasion. Vi fandt også, at STC1 overekspression hæmmede celledeling og invasion af livmoderhalskræft celler. Desuden STC1 overekspression sensibiliserede CaSki celler til lægemidler. Endvidere viste vi, at NF-KB-p65 protein direkte bundet til STC1 promotor og aktiveret udtryk for STC1 i livmoderhalskræft celler. Således er disse resultater fremlagt beviser, at STC1 hæmmede celledeling og invasion gennem NF-KB-p65 aktivering i livmoderhalskræft

Henvisning:. Guo F, Li Y, Wang J, Li Y, Li Y, Li G (2013 ) Stanniocalcin1 (STC1) Hæmmer Cell Proliferation og invasion af livmoderhalskræft Cells. PLoS ONE 8 (1): e53989. doi: 10,1371 /journal.pone.0053989

Redaktør: Soumitro Pal, Børnehospital Boston Harvard Medical School, USA

Modtaget: Juli 18, 2012; Accepteret: December 5, 2012; Udgivet: 29 Jan 2013

Copyright: © 2013 Guo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.672.352) og Innovation Project of Postgraduate Uddannelse af Central South University (nr 2340-74334000006). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Stanniocalcin1 (STC1) er et glycoproteinhormon involveret i calcium /phosphat (Pi) homeostase, som oprindeligt blev opdaget i et sekretorisk hormon af blodlegemer af Stannius, en endokrin kirtel af bony [1] fisk. Pattedyrs STC1 udtrykkes bredt i forskellige væv, herunder hjerte, lunge, lever, binyre, nyre, ovarie, prostata, colon og milt [2] – [5]. STC1 spiller mange roller i fysiologiske og patologiske processer, herunder graviditet, amning, angiogenese, organogenese, oxidativt stress, cerebral iskæmi, og apoptose [6] – [10]. En human ortolog af fisk STC1 blev fundet af mRNA differential display af kræftrelaterede gener [11]. STC1 blev oprindeligt klonet i en screening for cancerrelaterede gener. Talrige linjer af undersøgelser indikerede, at ændret ekspression af STC1 kan have en rolle i carcinogenese og udvikling. Øget STC1 genekspression er blevet fundet i hepatocellulære, colorectal, akut leukæmi, og medullære thyreoidea carcinomer, dog faldt udtryk for STC1 ekspression blev fundet i bryst- og æggestokkræft cellelinjer [12] – [19]. Men forholdet mellem det differentielt ekspression af STC1 i tumor i forhold til normalt væv og dets biologiske funktion kræver yderligere undersøgelse. Nogle undersøgelse viste, at STC1 udtryk var involveret i dannelsen af ​​tumorvaskulatur, STC1 kan fremkalde adaptive lydhøre over for hypoxi ved HIF regulering i humane cancerceller [20], [21]. Det forlyder, at histondeacetylaseinhibitoren-induceret cellulære apoptose involverer STC1 aktivering [22].

På trods af øget viden om STC1, er der lidt kendt funktion af STC1 i kræft progression. I denne undersøgelse undersøgte vi rollen som STC1 genekspression i humane cervixcancer. Vi fandt, at STC1 blev nedreguleret i kliniske væv af livmoderhalskræft. Efterfølgende fandt vi, at STC1 lav ekspression fremmet cellevækst, migrering og invasion. Vi fandt også, at STC1 overekspression hæmmede celledeling og invasion af livmoderhalskræft celler. Desuden STC1 overekspression sensibiliserede CaSki celler til lægemidler. Disse data støttede den pro-apoptotiske funktion STC1. Endvidere viste vi, at NF-KB-p65 protein direkte bundet til STC1 promotor og aktiveret udtryk for STC1 i livmoderhalskræft celler.

Resultater

STC1 blev nedreguleret i kliniske Væv af livmoderhalskræft

at udforske rolle STC1 i livmoderhalskræft, vi først undersøgte mRNA udtryk niveau i 15 par matchede cervikale væv ved RT-PCR. Ekspressionsniveauet af STC1 mRNA i livmoderhalskræft væv blev reduceret sammenlignet med de hosliggende normale dem (figur 1A og B). Derefter, immunhistokemi-analyse afslørede, at proteinniveauet af STC1 var lavt i tumorvæv, og mens forøget i tilstødende normale væv, hvilket indikerer dets potentielle rolle i udviklingen af ​​livmoderhalskræft (figur 1C og D).

(A ) ekspressionsniveauet af STC1 mRNA i kræft (T) og tilstødende normale (N) matchede cervikale væv blev undersøgt ved RT-PCR. GAPDH tjente som en belastning kontrol. (B) Box plot graf viste de kvantitative resultater af STC1 mRNA-ekspression i alle par af prøver (

s

0,05). (C) Protein niveau af STC1 i tumor og normale væv blev undersøgt ved immunhistokemi-analyse. Bar størrelse: 100 um. (D) Mængde analyse af protein niveau af STC1 ekspression. Intensiteten af ​​reaktivitet blev scoret med en tredelt systemet (

s

0,05). Dataene blev udtrykt som middelværdi ± SEM af tre adskilte forsøg. En værdi på P. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikans

nedregulering af STC1 forfremmet CaSki Cells Vækst og Invasion

For at undersøge den biologiske funktion af STC1, genereret vi RNAi vektor indeholder siRNA specifikt rettet STC1 til stabilt banke ned den endogene udtryk for STC1 i CaSki celler. Som vist i figur 2A, sammenligne med kontrollen (CaSki /NC), havde celler transficeret med siRNA -STC1 signifikant nedsatte niveauer af STC1 mRNA eller protein.

(A) Knock ned af STC1 i CaSki-celler. CaSki-celler blev transficeret ved STC1 målretning siRNA, og knockdown effektivitet blev vist ved RT-PCR og western blotting. (B) MTT-assays viste, at virkningen af ​​nedsat STC1 på CaSki cellevækst. Efter en 7-dages periode, væksten af ​​CaSki /siRNA celler var meget hurtigere end CaSki /NC-celler (*

s

0,05). (C) Kolonidannelse assay demonstrerede det store antal cellekolonier fra CaSki /siRNA-celler sammenlignet med CaSki /NC-celler (

s Restaurant 0,05). (D) sårheling analyser viste effekten af ​​STC1 for migration af CaSki celler. CaSki /siRNA celler migrerede hurtigere i forhold til CaSki /NC-celler (venstre panel). Den relative migration afstand CaSki celler blev beregnet (højre panel) (

s

0,05). Bar størrelse: 100 um. (E) Matrigel invasion assays viste virkningen af ​​STC1 på invasionen af ​​CaSki-celler. Antallet af CaSki /siRNA celler på filteret overfladen var større end CaSki /NC-celler (venstre panel) (

s

0,05). Middelværdien af ​​besatte celler blev vist i højre panel. Bar størrelse: 100 um. (F) De vækstkurver xenotransplantaterne blev bestemt ved tumor volumen (venstre panel) (*

s

0,05). De vækstrater xenotransplantaterne blev værdisættes ved tumor volumen /dag (højre panel) (*

s

0,05). CaSki /siRNA eller CaSki /NC-celler blev injiceret subkutant i nøgne mus. (G) Ved udgangen af ​​forsøgsperioden blev de endelige xenotransplantattumorer vist. (H) RT-PCR analyseret ekspressionen af ​​STC1 i repræsentative xenotransplantattumorer. (I) Repræsentative billeder af histologisk undersøgelse af xenotransplantattumorer. De dele af xenotransplantattumorer blev farvet med H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikans

Efterfølgende undersøgte vi effekten af ​​nedsat STC1 på CaSki cellevækst ved MTT-assays.. Efter en 7-dages periode, væksten af ​​CaSki /siRNA celler var meget hurtigere end CaSki /NC celler, og markant høje antal CaSki /siRNA-celler blev observeret fra dag 4 (figur 2B). Et lignende mønster af fremme effekten af ​​reduceret STC1 ekspression i CaSki-celler blev opnået i kolonidannelse assayet (figur 2C). Derfor høj aktivitet og et stort antal cellekolonier fra CaSki /siRNA-celler påvist, at nedregulering af STC1 fremmes ekspressionen cellevækst in vitro.

Cell migration og invasion er vigtig proces med tumorudvikling og metastase. Dernæst undersøgte vi effekten af ​​STC1 for migration af CaSki-celler ved sårhelende assayet i figur 2D. Efter inkubation af fysisk sårede celler i 48 timer, CaSki /siRNA-celler migrerede hurtigere i forhold til CaSki /NC-celler. Yderligere analyse af virkningen af ​​STC1 på CaSki celler invasion afslørede, at nedregulering af STC1 forbedret invasionen af ​​celler in vitro, bestemt ved matrigel invasion assay (figur 2E). Den betydeligt længere afstand på migrations- og et stort antal CaSki /siRNA celler på filteret overflade viste, at nedregulering af STC1 forbedret migration og invasion evne CaSki celler in vitro.

For yderligere at fastlægge den rolle, STC1 i tumorgenicitet og udvikling af livmoderhalskræft, blev CaSki /siRNA eller CaSki /NC celler injiceres subkutant i nøgne mus. Udviklingen af ​​tumoren blev overvåget i 40 dage. Som vist i figur 2F, STC1 Knockdown tumorer opstået tidligere og voksede hurtigt sammenlignet med kontrolgrupper tumorer. Ved udgangen af ​​forsøgsperioden, blev de endelige vægte af STC1 knockdown tumorer (1,417 ± 0,169 g) fundet at være markant højere end kontroller (0,478 ± 0,115 g) (figur 2G). RT-PCR af STC1 i repræsentative xenotransplantattumorer angivet som faldt STC1 udtryk var blevet opretholdt gennem eksperimentel tidsforløb (Figur 2H). H 0,05). (C) Kolonidannelse assay viste, at en lille mængde af cellekolonier fra CaSki /STC1 celler demonstrerede en lav aktivitet (

s Restaurant 0,05). (D) Matrigel invasion assay viste, at opregulering af STC1 afbødet invasionen af ​​celler in vitro. Bar størrelse: 100 um. (E) STC1 overudtrykt tumorer opstod senere og langsomt voksede i forhold til at styre tumorer (*

s

0,05). (F) Ved udgangen af ​​forsøgsperioden, blev de endelige vægte af STC1 overudtrykt tumorer sig at være lavere end kontroller. (G) RT-PCR af STC1 i xenotransplantattumorer angivet, at øget STC1 udtryk var blevet opretholdt gennem eksperimentel tidsforløb. (H) H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikans

Dernæst CaSki /STC1 eller CaSki /NC celler blev injiceret subkutant i nøgne mus.. STC1 overudtrykt tumorer opstod senere og voksede langsomt i forhold til kontrol tumorer (Figur 3E). Ved udgangen af ​​forsøgsperioden, de endelige vægte af STC1 overudtrykt tumorer (0,285 ± 0,057 g) var lavere end kontroller (0,523 ± 0,154 g) (figur 3F). RT-PCR af STC1 i xenotransplantattumorer angivet, at øget STC1 udtryk var blevet opretholdt gennem eksperimentel tidsforløb (figur 3G). H 0,05). (E) STC1 sensibiliseret CaSki celler til at thapsigargin. CaSki /STC1 eller CaSki /NC-celler blev behandlet med thapsigargin (3 uM) i 72 timer. MTT-assays opdaget cellevækst i CaSki /STC1 eller CaSki /NC celler i ansigtet af thapsigargin (*

s

0,05). (F) STC1 sensibiliserede CaSki celler til rapamycin. CaSki /STC1 eller CaSki /NC-celler blev behandlet med rapamycin (0,5 mg /l) i 72 timer. MTT-assays detekterede cellevæksten af ​​CaSki /STC1 eller CaSki /NC-celler i lyset af rapamycin (*

s Restaurant 0,05). Dataene blev udtrykt som middelværdi ± SEM af tre adskilte forsøg. En værdi på P. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikans

direkte binding af NF-KB-p65 protein til STC1 Promotor regionen i livmoderhalskræft celler og reguleret ekspression af STC1

nuklear faktor-kappa B (NF-KB) familien af ​​transkriptionsfaktorer regulerer ekspressionen af ​​mange gener, herunder spredning og invasion gener. NF-KB-vejen spiller en central rolle i kræft og hjertekarsygdomme. Initiativtageren til STC1 indeholder flere NF-KB p65 bindingssteder [27]. Til at begynde yderligere udforskning mekanismer mellem korrelationen af ​​STC1 og p65 blev de bindingssteder testet i CaSki celler ved kromatin co-immunpræcipitationseksperimenter. Sitet (-GGGACAAACC-) viste sig at binde til NF-KB p65 (fig. 5A). For at bestemme om STC1 ekspression i CaSki-celler blev korreleret med NF-KB, aktiviteten af ​​NF-KB blev detekteret. Ledsager med forøget aktivitet af PARP og caspase-3, aktiviteten af ​​NF-KB p65 og STC1 øgede også når CaSki-celler blev behandlet med thapsigargin (Fig. 5B). TNFa aktiverer apoptotiske veje efter samtidig induktion af NF-KB. For at bestemme om ekspression af STC1 ligeledes steget i TNFa-induceret apoptose, blev CaSki-celler behandlet med stigende tid af TNFa. Ekspressionen af ​​NF-KB p65 forøget, og aktiviteten af ​​STC1 og caspase-3 forstærkes som respons på TNFa (fig. 5C). Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC) er en effektiv inhibitor af NF-KB-aktivering og undertrykker NF-KB afhængig transkription af pro-i inflammatorisk cytokiner og chemokiner [28]. Når CaSki-celler blev behandlet med PDTC, aktiviteten af ​​NF-KB p65 faldt og ekspressionen af ​​STC1 nedreguleret med stigende tid af PDTC (fig. 5D). Desuden udviste de knockdown af p65 blev udført ved transfektion siRNA targeting NF-KB p65, den subcellulære ekspression af p65 og STC1 i CaSki-celler blev analyseret (figur 5E). Ekspressionen af ​​p65 i cytoplasmaet og kernen begge faldt, og mens den i kernen reduceres betydeligt. Den nedregulering STC1 udtryk i kernen blev også fundet efter knockdown af p65. Knockdown af p65 forårsaget ekspressionen af ​​p65 og STC1 begge faldende på mRNA-niveau (figur 5F).

(A) De bindingssteder STC1 blev testet i CaSki-celler ved kromatin co-immunpræcipitationseksperimenter. Stedet viste sig at binde til NFKB p65. (B) Western blotting detekterede aktiviteten af ​​PARP, caspase-3, STC1, og NF-KB p65 i CaSki-celler. CaSki-celler blev behandlet med thapsigargin (3 uM) i 12 timer. (C) Western blotting detekterede aktiviteten af ​​p65, STC1, og caspase-3 i CaSki-celler. CaSki-celler blev behandlet med stigende tid af TNFa (10 mg /l) i 2,5 timer. (D) Western blotting detekterede aktiviteten af ​​p65 og STC1 i CaSki-celler. CaSki-celler blev behandlet med PDTC (10 uM) i 60 minutter. (E) Subcellulær af p65 og STC1 i CaSki-celler blev analyseret ved Western blotting. CaSki-celler blev behandlet med siRNA knockdown af p65 i 72 timer. (F) Ekspressionen af ​​p65 og STC1 i CaSki blev detekteret ved RT-PCR på mRNA-niveauet. CaSki-celler blev behandlet med siRNA knockdown af p65 i 48 timer. (G) Skematisk fremstilling af nogle fund i dette arbejde.

Diskussion

Der er stigende tegn på, at STC1 stramt er forbundet med udvikling af kræft. Men ekspressionen af ​​STC1 varierede i forskellige væv og selv for det samme væv i forskellige niveauer (mRNA eller protein), og derfor funktionen af ​​STC1 kan vise forskellen [29]. I denne undersøgelse fandt vi, at STC1 inhiberede celleproliferation og invasion af cervicale cancerceller. STC1 nedreguleres i kliniske væv af livmoderhalskræft, som angivet STC1 er involveret i udviklingen af ​​livmoderhalskræft. I livmoderhalskræft, kan den lave udtryk for STC1 forårsage tumor udvikling. Efterfølgende fandt vi, at STC1 lav ekspression fremmet cellevækst, migrering og invasion efter nedregulering af STC1 ved RNA-interferens i cervicale cancerceller. Endvidere har vi også fundet, at STC1 overekspression hæmmede celle proliferation og invasion af livmoderhalskræft celler. Desuden STC1 overekspression sensibiliserede CaSki celler til lægemidler. Disse data understøtter den indstilling, der STC1 kan hæmme tumor progression for livmoderhalskræft. Den svigtende funktion STC1, som inhiberer væksten og invasion af tumorceller, kan føre til tumorprogression i livmoderhalskræft.

Promotoren af ​​STC1 genet indeholder HIF og NF-KB bindingssted. Det forlyder, at HIF-1α bundet til STC1 genpromotoren og p300 var nødvendig for en produktiv interaktion med HIF-1 og opregulering af STC1 mRNA og proteinekspression [30]. Chen et al troede at STC1 delvist blokeret NF-KB-aktivering i TNF-a-behandlede humane koronare arterie endotelceller [31]. Law et al rapporterede, at histon hyper-acetylering og ansættelse af aktiverede NFKB stimuleret STC1 genekspression i HT29-celler [22]. Forholdet mellem STC1 og NF-KB er forskellig i forskellige væv type. Vi viste, at NF-KB-p65 protein direkte bundet til STC1 promotor og reguleret ekspression af STC1 i livmoderhalskræft celler. Disse resultater har potentielle kliniske implikationer. Vores resultater tyder på, at øge ekspressionen af ​​STC1 bør være en god strategi at hæmme tumor spredning og invasion, og også kan være en mulig kombineret behandling med kemoterapeutiske stoffer i livmoderhalskræft.

Fra over disse resultater, vi fremsatte model for STC1-medieret hæmning af tumorprogression (figur 5): efter aktivering af NF-KB p65, STC1 ekspression forøget. Det forhøjede STC1 udtryk faldt tumor progression, og derfor følsomheden af ​​livmoderhalskræft celler med forhøjet STC1 udtryk til kemoterapi narkotika steget. Således yderligere undersøgelser er at belyse dybt de mekanismer, der er involveret i STC1-medieret hæmmende tumor progression og for yderligere at undersøge, hvad andre molekyler deltager i udviklingen.

Materialer og metoder

Prøver og Immunhistokemi

Tilfælde af livmoderhalskræft og tilstødende normale væv blev opnået på protokoller, der er godkendt af den sekundære Xiangya Hospital i Central South University. Clinicopathologic karakteristika for de 15 patienter med livmoderhalskræft blev viste i tabel S1. Paraffinsnit blev afparaffiniseret med xylen og rehydratiseret i gradueret alkohol. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved inkubering i 3% hydrogenperoxid ved stuetemperatur i 10 min. Ikke-specifik binding blev blokeret med PBST med 10% gedeserum i 2 timer ved stuetemperatur. STC1 antistof (Santa Cruz Biotechnology) blev tilsat til hvert objektglas og inkuberes ved 4 ° C natten over. Efter tre vaske blev objektglassene inkuberet med Envision (DAKO) i 40 minutter ved stuetemperatur. Diaminobenzidin blev anvendt som et chromogen. Snit blev modfarvet med hematoxylin, dehydreret, og monteret. Evaluering af immunhistokemiske slides blev gjort med et Nikon Eclipse E800 mikroskop ved 200 × forstørrelse. Intensiteten af ​​reaktivitet blev scoret med en tredelt systemet: 0-3 (0 = ingen farvning, 3 = 100% farvning). Det immunoreaktive resultat af prøven blev bestemt ved procentdelen af ​​positive celler. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af den etiske komité for Xiangya School of Medicine, Central South University.

Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)

RNA isoleret fra væv og celler blev omvendt transskriberet og forstærkes ved hjælp af ONE-STEP revers transkription-PCR System (Fermentas). Primer sekvenser anvendt blev vist i tabel S2. Efter opvarmning ved 95 ° C i 1 min, blev PCR’er udsat for 30 cyklusser (GAPDH, 25 cyklusser) 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, og 68 ° C i 1 min 30 s med en endelig forlængelse ved 68 ° C i 10 minutter. Den integrerede densitetsværdi (IDV) af hvert bånd blev vurderet ved anvendelse Gel-Pro Image Analyzer (Bio-Rad, Hercules, Calif), og af forholdene IDV-værdier blev beregnet for at vurdere de relative ekspressionsniveauer af mRNA’et.

Cell Culture

CaSki humane cervikale cancerceller blev opretholdt ved vores laboratorium og dyrket i Dulbecco-modificeret Eagle-medium (DMEM; Gibco) suppleret med 10% bovint kalveserum (BCS) (Gibco). Celler blev holdt ved 37 ° C i en atmosfære af befugtet luft med 5% CO2.

Vector Byggeri og Cell transfektion

For at vælte STC1 udtryk, vi brugte pRNAT-U6.1 /Neo vektor, der koder en lille hårnål RNA rettet mod målgenet i CaSki-celler. De målsekvenser for STC1 var 5’TTAGTCCAGGAAGCAATAGTA -3 «(CaSki /siRNA). Vi anvendte negativ universel kontrol som en negativ kontrol (CaSki /NC).

Til transfektion af plasmidet ekspressionsvektor, der koder humant STC1 DNA sekventering indeholdende STC1 åbne læseramme flankeret af HindIII-Xhol-restriktionssteder blev PCR amplificeret fra CaSki-celler. Primer sekvenser anvendt var sense 5’GAAAGCTTATGCTCCAAAACTCAG 3 ‘og antisense 5’TTCTCGAGTTATGCACTCTC ATGG 3’. Det resulterende fragment blev indsat i HindIII /Xhol -precut pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) til generering pcDNA3.1- STC1. Den ønskede sekvens blev bekræftet ved direkte DNA-sekventering.

I transfektion blev cervicale cancerceller dyrket til 70% konfluens og transficeret i serum-frit medium i 6 timer med lipofectamin 2000 (Invitrogen) og vektor. Efter 48 timer blev cellerne høstet, efterfulgt af begrænset fortynding i plader med 96 brønde til frembringelse af individuelle cellekloner. Tre uger senere blev niveauerne af STC1 ekspression i cellekloner, der var blevet inficeret med vektorer, kendetegnet for STC1 protein og mRNA.

MTT og kolonidannelse

MTT-assay blev udført som rapporteret tidligere [32]. For kolonidannelse assayet celler ved 100 celler per brønd i 60 mm plader blev dyrket i 10% FBS DMEM ved 37 ° C 5% CO2 i 3 uger. De cellekolonier blev vasket to gange med PBS, fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter og farvet med Gimsa i 30 min. Individuelle kloner med mere end 50 celler blev talt. Klon dannende effektivitet for individuel type celler blev beregnet i henhold til antallet af kolonier /antal inokulerede celler × 100%.

monolag Sårheling og invasion assays Salg

I monolag sårheling assay celler blev dyrket i 10% FBS DMEM i 60 mm plader. Efter at cellerne nåede sub-konfluens blev monolagcellerne såret af afskrabning af cellerne og derefter dyrket i medium i 48 timer. Den migrerede afstand af CaSki-celler blev overvåget og afbildes under et mikroskop. Afstandene for cellemigrering blev beregnet ved at fratrække afstanden mellem læsion kanter efter 48 timer fra afstanden målt ved 0 timer. Den relative migrerende afstand af celler måles ved afstanden af ​​cellemigration /afstanden målt ved 0 timer. For invasion assay celler ved 10

4 /brønd blev podet i de øvre kamre i 200 pi FBS-fri DMEM og de nedre brønde blev fyldt med 500 pi 10% FBS DMEM til induktion cellemigrering. Efter inkubation i 24 timer blev cellerne på filteroverfladen fikseret med 4% formaldehyd, farvet med 0,5% krystalviolet, og undersøgt under et mikroskop. Celler i mindst seks tilfældige mikroskopiske felter (200 ×) blev talt.

Western blot-analyse

Cellerne blev vasket med koldt phosphatbufret saltvand (PBS) og lyseret i Laemmli-puffer (62,5 mM Tris-HCI, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 50 mM dithiothreitol og 0,01% bromphenolblåt) i 5 minutter ved 95 ° C. Cellelysater blev analyseret ved SDS /PAGE og overført elektroforetisk til polyvinylidendifluoridmembran. Blottene blev probet med specifikke antistoffer ved en sekundær detektering trin. De immunreaktive proteiner blev afsløret af en ECL kit. Western blot blev udført under anvendelse af de følgende antistoffer: Rabbit anti-STC1 antistof (Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-Phospho-NF-KB p65 antistof (Cell Signaling Technology), kanin-anti-PARP-antistof (Cell Signaling Technology), kanin-anti -Caspase-3-antistof (Cell Signaling Technology).

In vivo tumorvækstassay

indflydelse STC1 på tumor udvikling af cervikal karcinom in vivo blev undersøgt. Celler på 5 × 10

6 pr mus blev injiceret subkutant i 4 uger gamle Balb /c nøgne mus (n = 4 pr gruppe, Shanghai Laboratory Animal Center, Shanghai, Kina). De eksperimentelle par blev udført i forskellige mus. Udvikling og vækst af faste tumorer blev monitoreret ved måling af tumorstørrelse under anvendelse af en skydelære i en blindet måde hver femte dag for en 40-dages periode. Tumorvolumenet blev beregnet under anvendelse af formlen: tumorvolumen (mm

3) = bredde (mm)

2 x længde (mm) x 0.5 [33]. Ved slutningen af ​​forsøget blev alle musene aflivet, og individuelle tumorvægte blev målt ved anvendelse af en balancer.

Chromatin immunopræcipitationsanalyser Salg

chip assay blev udført under anvendelse chippen assaykit ifølge producentens anvisninger (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) og antistof mod NF-KB-p65 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Chromatin immunpræcipitation primere blev udformet til at amplificere et fragment indeholdende STC1 promotor. Primersekvenserne anvendt blev vist i tabel S2.

Statistical Analysis

Data blev udtrykt som gennemsnit ± SEM. Forskellen mellem grupper blev bestemt ved ANOVA-analyse og sammenligning mellem blev analyseret af t-test ved hjælp af GraphPad Prism software version 4.0 to grupper (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). En værdi på P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikans

Støtte oplysninger

tabel S1..

Clinicopathologic karakteristika for de 15 patienter med livmoderhalskræft.

doi: 10,1371 /journal.pone.0053989.s001

(DOC)

tabel S2.

Primer for RT-PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0053989.s002

(DOC)