PLoS ONE: høj ekspression af hTERT og Stemness Gener i BORIS /CTCFL Positive celler isoleret fra embryonale Cancer Cells

Abstrakte

BORIS /CTCFL er medlem af kræft testis antigen familie normalt udtrykkes i kønsceller. I tumorer, er det udtrykkes afvigende selv om dens funktioner er ikke helt veldefineret. For bedre at forstå funktioner BORIS i kræft, valgte vi de embryonale kræftceller som model. Ved hjælp af en molekylær beacon, der specifikt er rettet mod

BORIS

mRNA, viste vi, at BORIS positive celler er en lille delpopulation af tumorceller (3-5% af total). De BORIS-positive celler isoleret ved hjælp af BORIS-molekylærbeacon udtrykt højere telomerase

hTERT

, stamceller (

NANOG, OCT4, SOX2

) og kræft stamceller markørgener (

CD44

og

ALDH1

) sammenlignet med de BORIS-negative tumorceller. For at definere den funktionelle rolle af BORIS blev stabile BORIS-udtømte embryonale cancerceller genereret.

BORIS

tavshed stærkt nedreguleret ekspression af

hTERT

, stamceller og kræft stamceller celle markørgener. Desuden BORIS knockdown forøget cellulær senescens i embryoniske cancerceller, afslører en formodet rolle BORIS i senescens biologisk program. Vores data indikerer en sammenslutning af BORIS udtrykke celler delpopulation med ekspressionen af ​​stemness gener, fremhæver den afgørende rolle, som BORIS spillet i embryonale neoplastisk sygdom

Henvisning:. Alberti L, Renaud S, Losi L, Leyvraz S, Benhattar J (2014) høj ekspression af

hTERT

Stemness Gener i BORIS /CTCFL Positive celler isoleret fra embryonale kræftceller. PLoS ONE 9 (10): e109921. doi: 10,1371 /journal.pone.0109921

Redaktør: Gabriele Saretzki, University of Newcastle, England

Modtaget: Juni 20, 2014, Accepteret: 12. september 2014 Udgivet: 3 oktober 2014

Copyright: © 2014 Alberti et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Denne forskning blev støttet af den schweiziske National Science Foundation (tilskud nummer: 31003A-113.505, www.snf.ch).; og Emma Muschamp Foundation (www.s-a-v.org/-Fondations-associees-.html). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. En af forfatterne (JB) er ansat af en molekylær patologi laboratorium (Biopath Lab ). Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Brother af regulator af prægning sites (BORIS) også udformet som CTCFL, CCCTC-bindende faktor -lignende, er en DNA-bindende protein med funktioner i cancer ikke fuldt forstået. CTCF er et højt konserveret, ubikvitært, multifunktionelle kromatin faktor, der spiller en rolle som et tumorsuppressorgen [1] – [3]. BORIS er et pattedyr paralog af CTCF, de deler den samme 11 zink-finger domæne, men adskiller sig ved N- og C- Termini. Inden for denne zink-finger-domæne, BORIS og CTCF udviser 70% homologi [4]. I normale væv,

BORIS

udtryk er begrænset til kønsceller, hvor det er involveret i epigenetisk omprogrammering [4], [5].

BORIS

udtrykkes i spermatocytter løbet mandlige udvikling kønsceller, tilsyneladende i fravær af CTCF [4]. I tumorer, er BORIS afvigende udtrykt og dets transskription blev fundet på forskellige niveauer i flere cancer cellelinjer og i primære tumorer [6]. På grund af sin begrænsede ekspression i normale germinale væv og genanvendelse af ekspression i en lang række tumorer, BORIS tilhører cancer testis antigen (CTA) familie. Det er blevet vist, at BORIS inducerede ekspression af andre CTA gener, som MAGE-A1, NY-ESO-1 [7], [8] og SPANX [9], men ikke i alle tumorer [10], [11]. Derudover tidligere viste vi, at BORIS aktiveret

hTERT

ekspression ved binding til den første exon af

hTERT

telomerase-genet i embryoniske og ovarietumorceller [12]. Endvidere i undersøgelser af eksogen BORIS ekspression i normale BORIS-negative celler, vi demonstreret, at disse transficerede celler udviste høje niveauer af

hTERT

mRNA [12]. Alle disse resultater afslørede en vigtig rolle BORIS i immortaliseringen proces under tumorigenese. Interessant, aktuelle rapporter viser en sammenhæng mellem

hTERT

udtryk og stamcelletransplantation-lignende egenskaber [13] – [17]. Yderligere undersøgelser vedrørende sammenhængen mellem BORIS funktioner og de vigtigste roller hTERT i immortalisering og stemness egenskaber skal udføres. Et andet spørgsmål endnu ikke er klart besvares, er, hvor mange celler inden for en tumor cellelinie, udtrykke

BORIS

. I dette papir, vi behandle disse spørgsmål. Til dette formål valgte vi at bruge det molekylære beacon (MB) imaging teknologi, da det er en godkendt metode til at påvise og også at visualisere mRNA-ekspression [18]. MBs er oligonukleotider struktureret som hårnåle-hårnål med en fluorescensquencher den ene ende og ved den modsatte ende, et fluorescerende farvestof også kaldet fluorofor. På grund af deres særlige struktur, MBs udsender fluorescenssignaler, når binding til deres mål. At udforske hyppigheden af ​​BORIS-positive celler i tumorcellelinier, vi først designet en

BORIS

mRNA målrettet MB, og så vi analyseret

BORIS

udtryk i humane embryonale og ovarie tumorcellelinjer, henholdsvis NCCIT og OVCAR3. Efter at have kontrolleret, at BORIS-MB muliggøre FACS sortering af BORIS-positive celler, viste vi, at de isolerede BORIS-positive celler udtrykte højere mRNA niveau af

hTERT

stemness gener i forhold til BORIS-negative og ikke-sorteret NCCIT celler . Vi bekræftede yderligere dette resultat af

BORIS

lyddæmpende undersøgelser. Desuden viste vi, at BORIS beskytter mod ældning proces. Sammenlagt vores data bekræfter en direkte rolle BORIS i embryonale neoplastisk sygdom

Materialer og metoder

Celler

De humane cellelinier (BJ, forhuden fibroblast,. HeLa, livmoderhalskræft adenocarcinom, NCCIT, embryonal carcinoma, OVCAR3, ovarie carcinom) blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC). Cellerne blev dyrket ved 37 ° C med 5% CO

2 enten i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Gibco, Invitrogen) for HeLa og BJ-celler, eller i RPMI-1640-medium (Gibco, Invitrogen) for NCCIT og OVCAR3 suppleret med 10% varme inaktiveret føtalt bovint serum (Invitrogen) og 1% af penicillin-streptomycin (Gibco, Invitrogen).

Molecular beacon (MB) design

Sekvenser af BORIS-MB1 og BORIS-MB2 blev designet ved hjælp Beacon Designer (Premier Biosoft).

BORIS

mRNA sekundære strukturer blev forudsagt ved hjælp mFOLD software (mFOLD, https://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/) og specificitet blev bestemt ved BLAST-søgning (NCBI). Målet sekvens af BORIS-MB1 er placeret på exon 2, og at af BORIS-MB2 er placeret på exon 11 af

BORIS

mRNA. Disse placeringer blev valgt, fordi de ligger uden for zink-finger-domæne og ikke krydshybridiserer med CTCF homologiregioner. Desuden har tidligere undersøgelse vist, at start- og slutter regioner mRNA er mere tilgængeligt for MBs hybridisering [19]. RANDOM-MB, der blev brugt som negativ kontrol ikke passer med nogen pattedyr sekvenser [19]. Sekvenser var følgende: BORIS-MB1 5′-CGCTGTCTCTGCACACTCCGTCTTCAGCG-3 ‘; BORIS-MB2 5’-CAGCCATTCCTCTTTGACTCTGGCTG-3 ‘og RANDOM-MB 5′-CGACGCGACAAGCGCACCGATACGTCG-3′ (understregede baser indikerer de komplementære til målsekvenserne). En fluorophor (Cy3 eller ATTO647) var 5′-konjugeret og et sort hul Quencher (BHQ-2) var knyttet til 3’-enden. MBS blev indkøbt fra Sigma og de blev oprenset ved højtryks-væskekromatografi.

In vitro

bestemmelse af MB specificitet

Oligo blev designet til at være specifikke for MBs mål (BORIS-MB1 specifikt mål: 5′-AAGACGGAGTGTGCAGAGAGA-3 ‘; BORIS-MB2 specifikt mål: 5′-CAGCCAGAGTCAAAGAGGAA-3′ og RANDOM-MB specifikt mål: 5’-TATCGGTGCGCTTGTCG-3 ‘). En ikke-specifikke oligo blev anvendt til

in vitro

test af de forskellige MBs. Denne ikke-specifikke oligo, 5′-CGATGCCGAACCAATTCTCCAC-3 ‘, svarer til en udskrift variant af CTCF. For at teste specificiteten i opløsning, blev 200 nM MB blandes eller ikke med 1 uM oligo i 10 pi Opti-MEM-medium (Invitrogen).

Emissionen fluorescens-profiler blev opnået efter opvarmning af MB-target oligo mix til en progressiv temperatur elevation mellem 15 til 80 ° C ved hjælp af 1 ° C trin. Fluorescens-signalet blev erhvervet ved afslutningen af ​​hver stigende grad og registreret på Cy3-kanalen ved hjælp af en Rotor Gene 6000 Real-Time PCR-system (Corbett Life Science).

MB levering og celle fluorescensafbildning

Celler blev frigjort under anvendelse af 0,05% trypsin-EDTA (Invitrogen) og resuspenderet i serum-frit DMEM medium ved koncentrationen af ​​10

6 celler /ml. For det første blev Cy3-BORIS-MB eller Cy3-RANDOM-MB (200 nM) inkuberet ved stuetemperatur i nærvær af 1 ul /ml Lipofectamine RNAiMAX siRNA transfektionsreagens (Invitrogen) under anvendelse af Opti-MEM-medium. The Lipofectamine RNAiMAX reagens blev anvendt som leveringsvehikel siden i vores betingelser det gav mindre baggrund sammenlignet med andre reagenser, såsom Streptolysin (data ikke vist). Efter 10 min blev Transfektionsblandingen tilsættes til de suspenderede celler og sammen inkuberet i 1 time ved 37 ° C. Hoechst 33342 (Invitrogen) blev tilsat i en koncentration på 5 ug /ml i den sidste 10 minutters inkubation. Derefter blev cellerne vasket under anvendelse phosphatbufrede saltvand (PBS, Invitrogen) og resuspenderet i PBS med 5 mM EDTA. Transfekterede celler blev cytocentrifugated på objektglas ved hjælp af en cytospin centrifuge og undersøges under fluorescerende mikroskop (Axioplan2 Imaging, Zeiss). Den fluorescens signal Cy3-coniugated MB blev analyseret ved hjælp af den røde kanal og Hoechst 33342 fluorescensemission blev observeret under blå kanal.

FACS-analyse og sortering ved hjælp af MB

For FACS analyse og celle sortering, vi brugte MBs konjugeret med ATTO 647, et farvestof kendetegnet ved sin høje fotostabilitet [20]. Celler blev fremstillet og inkuberet med MBS, som beskrevet ovenfor (bortset fra at Hoechst 33342 ikke blev tilsat) og blev direkte analyseret ved anvendelse Gallios flowcytometer (Beckman Coulter). Mindst 10.000 begivenheder blev indsamlet og analyseret af Kaluza Software. De BORIS-positive og BORIS-negative populationer blev sorteret efter udelukkelse af døde celler ved propidiumiodid (PI) farvning under anvendelse FACSAria I (Becton Dickinson) instrument ved flowcytometri Facility af Unil (University of Lausanne, Schweiz). Intervaller af 2 × 10

4-9 × 10

4 BORIS-positive celler og 2 × 10

5-9 × 10

5 BORIS-negative celler blev sorteret.

BORIS knockdown af inducerbar shRNA lentiviral systemet

Stabile cellelinier med inducerbare udtrykkende shRNAs målrettet humant

BORIS

mRNA blev genereret ved anvendelse af doxycyclin-inducerbare shRNA lentiviral system pINDUCER [21]. Lentivirusvektoren pINDUCER11 konstitutivt udtrykker EGFP fluorescerende reporter protein, som gør det muligt at spore celler transduceret af virusset. Denne vektor indeholder også en kassette med en doxycyclin promotor, der styrer transkriptionen af ​​et TRFP reportergen sammen med shRNA, som muliggør påvisning af celler med doxycyclin aktiveret shRNA transkription [21]. Fire forskellige shRNAmiR (shRNA) specifikt rettet

BORIS

, og ikke dens parolog

CTCF

(BORIS-SH1: 5′-ATTCACCAAGATCAAAGAACTC-3 ‘, BORIS-SH2: 5’-GTTCTCACAGTTTCAAATTCAA-3 ‘, BORIS-SH3: 5′-TTCATCCCGACTGTTTACAAAT-3’, BORIS-sh4: 5’TCCGACAGAAGCAACTTCTAAA-3 ‘) og en kontrol shRNA med røræg sekvens (CTR sh: 5’CAGAGCTAACTCAGATAGTACT3 “blev) syntetiseret (Sigma). De blev PCR-amplificeret og klonet ind i pINDUCER11 rygraden hjælp

EcoRI

og

XhoI

restriktionsenzymer. Sekvenserne for alle konstruktioner blev verificeret ved sekventering. Lentivirus blev genereret ved co-transfektion af den passende shRNA konstruerer sammen med pakkevektorer (pMD2G-VSVG, pCMV-dR8.74) i HEK-293T-celler under anvendelse FuGENE 6 reagent (Roche Diagnostics) ifølge fabrikantens protokol. Virale supernatanter blev høstet 48 timer efter transfektion, filtreret gennem et 0,45 um pore filter, ultracentrifugated i 1,5 time ved 19.500 rpm i en Beckman SW28 rotor og genopslæmmet i RPMI-medium. Den virale suspension kombineret med 8 ug /ml polybren (Sigma) blev anvendt til at inficere målceller (NCCIT). Fireogtyve timer efter infektion blev mediet udskiftet og stabilt inficerede celler blev eGFP-sorteret under anvendelse FACSAria I instrument (Becton Dickinson) ved flowcytometri Facility of Unil. Induktion af shRNA ekspression blev opnået ved tilsætning til mediet af 2 ug /ml doxycyclin (Sigma). For at opretholde den knockdown blev doxycyclin-holdigt medium opdateres hver 3. dag.

Ektopisk BORIS ekspression i HeLa-celler

Dagen før transfektion HeLa-celler blev podet ved en densitet på 2 x 10

5 celler /brønd i 12-brønds /plader. Celler blev transficeret med 3 ug af det tidligere beskrevne pCMV-BORIS vektoren [12] ved Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Celler blev høstet 2 dage efter transfektion for celle fluorescens billeddannelse.

Kvantitativ RT-PCR

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy mini kit (Qiagen), herunder i kolonnen DNAse behandling ifølge producentens anvisninger. RNA-koncentrationen blev bestemt ved anvendelse NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) og qubit’en Fluorescent Technology (Invitrogen).

Et vigtigt begrænsende trin var den lave mængde af total RNA isoleret fra cellesortering. For at løse dette tekniske begrænsning, vi anvendte en metode allerede beskrevne og valideret [22], [23]. Først blev 200 ng af total RNA retrotranskriberet hjælp vilkårlige hexamerer og Superscript III revers transkriptase (Invitrogen) i et endeligt volumen på 20 pi. Derefter 2 pi cDNA blev anvendt til en forforstærkning reaktion bestående af en multiplex-PCR lavet med en blanding af primere (tabel S1) ved 0,1 uM slutkoncentration, 0,5 enhed af Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen), 1X PCR buffer, og 2 mM MgCl

2 i et samlet volumen på 25 pi

i preamplification, PCR cyklusbetingelser var:. et denatureringstrin ved 95 ° C i 5 minutter efterfulgt af 15 amplifikationscykler (45 sekunder ved 95 ° C , 30 sek ved 60 ° C, 1 min ved 72 ° C). Endelig for kvantitativ PCR, forstærkertrinene reaktionen var 20 gange fortyndet og 2 pi af denne fortynding blev anvendt som template. Reaktionen blev suppleret med 0,5 enheder Platinum Taq DNA-polymerase (Invitrogen), 1X PCR-buffer, 2,5 mM MgCl

2, 2,5 uM SYTO9 grøn (Invitrogen) og 0,1 pM af hvert gen-specifik primer (Sigma) i et slutvolumen på 20 pi. PCR-betingelser var: 95 ° C i 5 minutter efterfulgt af cykler (5 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 60 ° C, 45 sekunder ved 72 ° C). Smeltekurve analyser blev udført i slutningen af ​​amplificeringen at kontrollere renheden af ​​ampliconer. PCR-produkterne blev også fyldt på agarosegel for at bekræfte den korrekte størrelse af amplificerede produkter. Cykling og fluorescens erhvervelse blev udført i Rotor-Gene 6000 Real-Time PCR-system (Corbett Life Science). Dataanalyse blev udført under anvendelse Rotor-Gene 6000 software. Relative ekspressionsniveauer blev bestemt ved ΔΔCt metode med ekspressionsniveauerne normaliseret til

GAPDH

niveau. PCR effektivitet varierede fra 94 til 101%, med korrelationskoefficienten (r

2) i området fra 0,96 til 1,0, for alle de amplificerede målgener. De Ct-værdier for

GAPDH

var nogenlunde den samme (Ct = 10,07 ± 0,25) for alle de celler, der anvendes i de kvantitative RT-PCR-eksperimenter.

De humane specifikke primere (tabel S1) blev designet ved hjælp Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) og OLIGO Primer Analysis software. Specificitet blev verificeret ved anvendelse af BLAST-søgning (NCBI). De designede primerpar krydser intron-exon grænserne for at undgå genomisk DNA-kontaminering. BORIS primere blev valgt (mellem exon 8 og 9) baseret på resultater tidligere opnåede [24] med henblik på at forstærke den mest udbredte

BORIS

isoformer.

DNA methylering analyse

DNA blev ekstraheret under anvendelse DNeasy kit (Qiagen). En række 200 ng (fra sorterede celler) og 500 ng DNA blev anvendt til at bisulfitreaktion hjælp EpiTect Bisulfite (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Det modificerede DNA blev anvendt til at amplificere et 123 bp fragment af BORIS-promotoren.

methylering assay blev designet under anvendelse af PyroMark Assay Design Software 1.0 (Qiagen). Dette assay tillod sekventering af 50 bp (fra position -968 til -918) inde promotoren B

BORIS

[25] og omfattede 10 CpG. For at udføre sekventering blev 3 pi bisulfit behandlede DNA først amplificeret ved PCR. Sekvenser af PCR-primerne var: BORIS-pyro Forward 5’TGGTTTGTGGGTTTTGT 3 ‘og BORIS-pyro BIO Reverse 5’CCCTTCACCCCCCCTCTTT 3’. PCR-betingelserne var som følger: 95 ° C i 5 minutter; 45 cykler ved 95 ° C i 30 s, 58 ° C i 15 s og 72 ° C i 1 min; og en endelig udvidelse ved 72 ° C i 10 min. Derefter, oprensning og efterfølgende bearbejdning af biotinyleret enkeltstrenget PCR-fragment blev udført ifølge producentens anbefalinger. Pyrosekventering af denne PCR-fragment blev udført på en PyroMark Q24 instrument under anvendelse Pyro Gold Q24 Reagenser (Qiagen). Den pyrosekventering primer (5 ‘GTGTTGTAGTTTATAGT 3’) blev anvendt i en slutkoncentration på 0,3 uM. Resulterende data blev analyseret og kvantificeret med PyroMark Q24-softwaren (Qiagen), som beregner den procentvise methylering for hver CpG site, så kvantitative sammenligninger.

Cell proliferation assay

Cell proliferation blev vurderet ved MTT assay . MTT (3- (4,5-dimethyl-2-thiazol) -2,5-diphenyl- tetrazoliumbromid, Sigma) reagens blev anvendt ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet blev stabilt inficerede celler podet ved en densitet på 25 × 10

3 celler /brønd i 24-brønds /plader med doxycyclin-holdigt medium. Efter 3 dage blev celler inkuberet med MTT-reagens (200 ug /ml slutkoncentration) i 3 timer ved 37 ° C. Derefter blev celler lyseret tilsætning isopropanol /HCI i 10 minutter, og pladerne blev forsigtigt rystet i 5 min. Absorbansværdier blev bestemt under anvendelse af en mikropladelæser (Synergy Mx, BioTek) ved 570 nm. Hvert eksperiment blev udført tre gange og blev udført 3 uafhængige forsøg.

Apoptose analyse

Apoptose blev målt i tre eksemplarer ved anvendelse Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Bioscience) ifølge fabrikantens protokoller. Kort fortalt, 5 × 10

4 celler /brønd blev podet i 12-brønds /plader og blev dyrket i nærvær af doxycyklin indtil Confluence (5-7 dage). De flydende celler såvel som trypsinerede celler blev opsamlet, vasket med PBS og resuspenderet i 100 pi bindingsbuffer. Derefter blev 5 pi Annexin V-V500 og 5 pi 7AAD tilsat og inkuberet med cellerne i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter tilsætning af 400 pi bindingspuffer prøverne blev straks analyseret ved Gallios flowcytometer (Beckman Coulter). Mindst 5 × 10

4 hændelser blev talt for alle prøver. Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev estimeret efter gating på eGFP og TRFP (transduceres og doxycyclin-induceret henholdsvis) positive celler.

Western blot-analyse

Helcellelysater blev opnået under anvendelse RIPA puffer (Sigma ) i nærvær af protease inhibitor cocktail (Sigma) og kvantificeret under anvendelse af BCA-assayet (Thermo Scientific). Tredive mikrogram protein blev påsat på en 10% SDS-polyacrylamidgel efterfulgt af blotting på en nitrocellulosemembran under anvendelse af et overførselsapparat halvtør (BIO RAD). Ikke-specifik binding blev blokeret ved inkubation natten over i 5% fedtfri tørmælk i TBS-T buffer (0,1% Tween 20 i Tris-bufret saltvand, TBS) ved 4 ° C. Membranerne blev derefter probet med monoklonalt muse-anti-humant BORIS /CTCFL antistof (produceret og venligst tilvejebragt af Dr. Dmitri Loukinov, NIH /niaD) anvendt ved 1: 1000 fortynding i 1% blokerende buffer (1% fedtfattig tørmælk i TBS -T buffer) og inkuberet ved stuetemperatur i 1,5 timer. Som ladningskontrol, muse-anti-humant β-actin-antistof (Sigma) ved 1: 5000 fortynding i 1% blokerende buffer blev anvendt og inkuberet ved stuetemperatur i 45 minutter. Membranerne blev vasket 3 × med TBS-T og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time med peberrodsperoxidase (HRP) -mærket kanin-anti-muse-IgG (Sigma) fortyndet til 1: 5000 i 5% blokeringsbuffer. Efter 3 × vask med TBS-T, blev membranerne udviklet ved anvendelse WesternBright Quantum (Advansta) og visualiseret med Fusion FX Kemiluminescens System (Vilber Lourmat).

Ældning-associeret β-galactosidase-farvning

senescens-associerede β-galactosidase (SA-β-gal) farvning blev udført under anvendelse af β-galactosidase-farvning kit (BioVision), ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, 5 × 10

4 celler /brønd blev podet i 12-brønds /plader i nærvær af doxycyklin og blev dyrket indtil konfluens (5-7 dage). Derefter blev celler skyllet med PBS, fikseret i 15 min og inkuberet med frisk fremstillet SA-β-Gal-farvning opløsning ved 37 ° C i 24 time. Efter vask med PBS blev SA-β-gal-aktivitet observeret ved anvendelse af omvendt mikroskop (Nikon) ved påvisning af blå farvede celler. Mindst 10 separate felter blev valgt. For hvert felt af antallet af blå farvede celler og antallet af totale celler blev talt. Resultater er udtrykt som procent af SA-β-gal-positive celler beregnet som: (antal blå celler /totale antal celler) x 100.

Telomeraseaktivitet

Telomerase-aktivitet blev målt ved anvendelse TRAPEZE RT telomerase detektion kit (Millipore). Dette assay kvantificerer telomeraseaktivitet ved SYBR Green real-time kvantitativ PCR [26]. Kort fortalt blev celler lyseret i 200 pi af CHAPS puffer og proteinkoncentrationer blev bestemt med NanoDrop 2000. Portioner af cellelysat (1,5 ug protein /prøve) blev anvendt. Inaktiverede prøver, ingen-skabelon reaktioner, og positiv kontrol blev også analyseret for kvalitetskontrol. En standardkurve blev fremstillet ved seriel fortynding af TSR8 kontrol skabelon efter producentens anvisninger. Real-time amplifikationer blev udført under anvendelse Platinum Taq DNA Polymerase (2 enhed /prøve, Invitrogen). Cykling og fluorescens erhvervelse blev udført i Rotor Gene 6000 real-time PCR-system (Corbett Life Science). Telomeraseaktivitet blev beregnet ved at sammenligne de gennemsnitlige Ct-værdier fra hver prøve mod standardkurven genereret af TSR8 kontrol-template.

Statistisk analyse

Statistisk signifikans blev vurderet ved anvendelse to-halet student t-test analyse. P-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

In vitro

validering af de molekylære beacons (MBS)

To forskellige MBs specifik. til

BORIS

mRNA (BORIS-MB1 og BORIS-MB2) og en RANDOM-MB blev anvendt i dette eksperiment. Hybridiseringsbetingelserne temperaturer og specificitet MBs blev først testet i opløsning. Fluorescensemissionen af ​​disse MBs blev overvåget ved temperaturer mellem 25 til 80 ° C, under forskellige betingelser: MB alene, MB i nærvær af det specifikke mål, i nærvær af en ikke-specifikt mål eller i nærvær af et plasmid indeholdende BORIS cDNA (pCMV-BORIS). Som vist i figur S1, var mærkbar fluorescens signal registreres kun, når MBs blev blandet med deres særlige mål. Optimal fluorescensemission med acceptabelt signal-til-baggrund-forholdet ( 4) blev observeret under 40 ° C. Assayet viste også, at BORIS-MBs diskriminere enkelt- og dobbeltstrengede strukturer, da de ikke udsender fluorescens, når de inkuberes med pCMV-BORIS plasmid. Disse resultater viste, at MBs specifikt hybridiserer til deres målsekvenser og stærkt antydet, at disse MBs ville kunne specifikt at binde mRNA og ikke genomisk DNA.

Påvisning af

BORIS

mRNA under anvendelse BORIS-MB

Vi først undersøgt, om BORIS-MBs kunne være i stand til at skelne mellem positive og negative BORIS udtrykker celler i levende celler. Kvantitativ RT-PCR påvises stærke niveauer af

BORIS

mRNA i NCCIT og OVCAR3 cellelinjer, mens dette niveau var meget lavt i HeLa-celler og ikke påvises i BJ-celler (figur 1A) i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [12 ]. Derfor, for at undersøge specificiteten af ​​MBs, NCCIT blev anvendt som en positiv kontrol-celler og BJ som en negativ kontrol. NCCIT celler blev transficeret med BORIS-MB1 eller BORIS-MB2 og fluorescens-emissioner blev målt ved flowcytometri. De gennemsnitlige fluorescerende signaler fra cellerne transficeret med Boris-MBs var højere sammenlignet med den gennemsnitlige fluorescerende signal af cellerne transficeret med RANDOM-MB. En stigning på 23,2 og 4,7 blev observeret for BORIS-MB1 og BORIS-MB2 henholdsvis (Figur 1B-C). Men da BORIS-MB1 forudsat højere (5 gange) betyder, fluorescens signal i forhold til BORIS-MB2, BORIS-MB1 blev udvalgt til den efterfølgende analyse. Herfra videre BORIS-MB1 betegnes som BORIS-MB. Som forventet, da BORIS negative BJ celler blev transficeret med BORIS-MB, de udviste ikke nogen fluorescens signal (Figur 1D).

(A)

BORIS

udtryk i humane cellelinier. Totalt RNA blev isoleret fra humane tumorale cellelinier: NCCIT (embryonale), OVCAR3 (ovarie), HeLa (cervical) og normale BJ (fibroblast) celler. mRNA-niveauer af

BORIS

blev analyseret ved QRT-PCR. Resultaterne blev normaliseret til

GAPDH

og relateret til NCCIT celler. BJ og NCCIT blev betragtet som negative og positive kontroller, hhv. Fejlsøjler repræsenterer middel ± SD af 3 uafhængige forsøg. (B) Fluorescenssignaler målt ved flowcytometri af NCCIT celler transficeret med ATTO647-BORIS-MB1 (mørkegrå top) og med ATTO647-RANDOM-MB (hvid top). (C) Fluorescenssignaler målt ved flowcytometri af NCCIT celler transficeret med ATTO647-BORIS-MB2 (svag grå top) og med ATTO647-RANDOM-MB (hvid top). (D) Fluorescenssignaler målt ved flowcytometri af BJ-celler behandlet med ATTO647-BORIS-MB1 (herfra videre omtalt BORIS-MB, grå top) og med ATTO647-RANDOM-MB (hvid top). (E)

BORIS

udtryk i HeLa-celler ved hjælp af BORIS-MB. Repræsentative billeder af HeLa-celler transient transficeret med BORIS ekspressionsvektoren, pCMV-BORIS (nederst) og ikke-transficerede kontrolceller (øverst), 20 × forstørrelse. (F)

BORIS

udtryk i humane cellelinjer, som detekteres ved hjælp BORIS-MB. Repræsentative billeder af BJ, NCCIT og OVCAR3 celler, 20 × forstørrelse. Til fluorescens billeddannelse, 1 x 10

6-celler blev inkuberet ved 37 ° C i 1 time i serumfrit DMEM-medium med Cy3-BORIS-MB (200 nM). Hoechst 33342 5 ug /ml blev tilsat under de sidste 10 minutters inkubation. Slides blev analyseret ved fluorescensmikroskopi.

For yderligere at udfordre specificiteten af ​​BORIS-MB, HeLa-celler, der udtrykte

BORIS

mRNA på lavt niveau, blev forbigående transficeret med pCMV BORIS ekspressionsplasmid, der indeholder det humane BORIS cDNA fusioneret til grønt fluorescerende protein (GFP) -gen. Som forventet, de transficerede celler præsenteret høje fluorescenssignaler for både GFP og BORIS (figur 1E). Tilsammen disse resultater bekræftede kapacitet BORIS-MB til pålideligt og specifikt at påvise

BORIS

mRNA i levende celler.

Derfor blev cellelinierne transficeret med BORIS-MB at visualisere

BORIS

mRNA-ekspression ved fluorescens billeddannelse. Som det kan ses af figur 1F, fluorescenssignalet af BORIS-MB var klart synlig i NCCIT og OVCAR3 celler, i hvilke kun en delmængde af celler blev fluorescerende. Procentdelen af ​​BORIS-positive celler i disse cellelinjer blev fundet at være mellem 3 og 5%. Som forventet i BJ normal cellelinje sås ingen fluorescerende celler. I HeLa-celler, antallet af BORIS-positive celler var ekstremt lavt, mindre end 0,1% (figur 1E). disse eksperimenter viste overordnet, at inden tumorcellelinjer,

BORIS

mRNA er ikke til stede i alle celler, men snarere forekommer kun i en delmængde af celler.

Isolering af cellepopulation, der udtrykker

BORIS

mRNA under anvendelse BORIS-MB

NCCIT cellelinje blev anvendt til isoleringen af ​​BORIS-positive celler. FACS-sortering blev udført efter celletransfektion med BORIS-MB. De BORIS-positive og BORIS-negative celler (8,4 ± 1,5 og 41,5 ± 7,2% af den samlede, henholdsvis; middelværdi ± SD) blev sorteret (figur 2A)

(A) NCCIT celler blev transficeret med ATTO647-. RANDOM-MB (hvid top) og ATTO647-BORIS-MB (grå top). De to subpopulationer, BORIS-negative og BORIS-positive celler blev udvalgt ved at sammenligne det fluorescerende signal af RANDOM-MB til den for BORIS-MB. Efter udelukkelse af døde celler ved PI-farvning blev de to fraktioner sorteres. (B)

BORIS

udtryk for de isolerede BORIS-negative og BORIS-positive fraktioner blev analyseret ved QRT-PCR. Resultaterne blev normaliseret til

GAPDH

og relateret til ikke-ordnet NCCIT celler. Fejlsøjler repræsenterer middel ± SD af 3 uafhængige forsøg. Asterisk angiver statistisk signifikant forskel (p 0,05). Mellem BORIS-positive og ikke-ordnet celler

BORIS

udtryk analyse viste, at

BORIS

mRNA niveau af sorteret BORIS-positive celler var 20 gange højere sammenlignet med de ikke-sorterede celler (figur 2B). Dette resultat demonstrerede effektivitet sorteringsmetoden og den vellykkede berigelse af en cellepopulation, der udtrykte

BORIS

mRNA.

De isolerede BORIS-positive og BORIS-negative celler har lignende methylering mønster af BORIS promotor B

i en tidligere undersøgelse, har vi vist, at

BORIS

udtryk styres af tre alternative initiativtagere, svarende til transcription start sites på -1447, -899 og -658 bp opstrøms for første ATG og udpegede initiativtagere som A, B og C, henholdsvis [25]. Interessant nok er det blevet observeret, at i tumorer, demethylering af BORIS promotor B, er generelt korreleret med ekspressionen af ​​

BORIS

, hvilket ikke er tilfældet for promotorer C og A [25]. Derfor har vi afhørt den mulige sammenhæng mellem methylering af promotor B og

BORIS

udtryk i de sorterede celler. BORIS methylering niveau af denne promotor blev målt ved pyrosekventering, efter bisulfit modifikation af DNA ekstraheret fra BORIS-positive og BORIS-negative celler. Pyrosekventering resultater viste, at i begge fraktioner blev CpG’er stærkt methyleret (85-100% methylering), og der blev ikke konstateret forskelle (figur 3A). Dette bekræftede, at i NCCIT celler,

BORIS

udtryk blev ikke reguleret af promotor B og foreslog, at de forskellige udtryk for

BORIS

blandt de sorterede fraktioner var ikke styret af DNA methylering status promotor B, men snarere involveret andre niveauer af kontrol.

(A) Methylering analyse af 10 CpG øer i

BORIS

promoter region (B promotor). Det repræsentative grafiske viser procentdelen af ​​methylering af hver CpG øen for den isolerede BORIS-positive (hvid), ekskluderet (grå) og ikke-ordnet (sort) NCCIT celler. (B) Ekspression analyse af det isolerede BORIS-positive (hvid) og BORIS-negative (grå) fraktioner. De angivne gener blev analyseret ved QRT-PCR.