PLoS ONE: Lewisy Fremmer Migration af Oral Cancer Cells ved Glycosylering af epidermal vækstfaktor receptor

Abstrakt

Afvigende glycosylerings ændringer normale cellefunktioner og repræsenterer en specifik kendetegnende for kræft. Lewis

y (Le

y) kulhydrat opregulering er rapporteret i mange forskellige cancere, herunder oral pladecellecarcinom (OSCC). Et højt niveau af Le

y-ekspression er forbundet med dårlig prognose for patienter med oral cancer. Men det er uklart, hvordan Le

y medierer oral cancer progression. I denne undersøgelse blev rollen som Le

å i OSCC udforsket. Vores data viser, at Le

y blev opreguleret i HSC-3 og OC-2 OSCC cellelinier. Især glycosylering af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) med Le

y blev fundet i OC-2-celler, og denne modifikation var fraværende ved inhibering af Le

y syntese. Fraværet af Le

y glycosylering af EGFR svækket phosphorylering af AKT og ERK som reaktion på epidermal vækstfaktor (EGF). Endvidere blev EGF-udløst migration celle reduceret, men celleproliferation blev ikke påvirket. Le

y modifikation stabiliseret EGFR ved ligand-aktivering. Omvendt fravær af Le

y glykosylering accelereret EGFR nedbrydning. Sammenfattende indikerer disse resultater, at øget ekspression af Le

å i OSCC celler er i stand til at fremme cellemigration ved at modificere EGFR som igen stabiliserer EGFR og nedstrøms signalering. Målretning Le

y på EGFR kunne have en potentiel terapeutisk effekt på kræft i mundhulen

Henvisning:. Lin WL, Lin YS, Shi GY, Chang CF, Wu HL (2015) Lewis

y Fremmer Migration af Oral Cancer Cells ved Glycosylering af epidermal vækstfaktor receptor. PLoS ONE 10 (3): e0120162. doi: 10,1371 /journal.pone.0120162

Academic Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, UNITED STATES

Modtaget: 13. oktober 2014 Accepteret: 23 januar 2015; Udgivet: 23 marts 2015

Copyright: © 2015 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Science Rådet, Taiwan [(NSC 99-2320-B-006-008-MY3 (modtaget af HLW), NSC 99 -2628-B-006-003-MY3 (modtaget af GYS), og NSC 100-2325-B-006-003-MY3 (modtaget af GYS)] (URL: https://www.most.gov.tw/.) de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

oral cancer er en type af hoved- og halscancer, som kan opstå fra alle dele af mundhulen. Tobak [1] og alkohol [2] anvendelse er de største risikofaktorer for kræft i mundhulen, som er en førende dødsårsag blandt midaldrende mennesker. Oral cancer kan være helbredes med tidlig diagnose og behandling; imidlertid overlevelsesraten faldet i de avancerede-stadier. [3] Afhængigt af væv oprindelse, er der flere typer af oral cancer. Oral pladecellecarcinom (OSCC), som forekommer i foring slimhinde i munden og læberne, er den mest almindelige og er blevet en epidemiologisk problem i hele verden. [4]

Tumor progression er ofte forbundet med atypisk glycosylering af celleoverfladeproteiner. [5] Lewis

y (Le

y, Fucα1-2Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAcβ1-R) er et difucosylated oligosaccharid, der har vist sig at være overudtrykt i en række tumorer, især i epithelium- afledte cancere. [6] Desuden er Le

y udtryk i forbindelse med den kliniske fase og progression af tumorer. [7,8] Den opregulering af Le

y i tumorer fremmer celleadhæsion [9,10], proliferation [11,12], migration [13], og resistens mod kemoterapi. [13-15] Hæmning af Le

y med antistoffer [13,16] eller undertrykkelse af Le

y syntese effektivt kan hæmme væksten og migration af tumorceller. [17] Den rigelige ekspression af Le

y precursor i udvækst af epitelet blev fundet i humant mundslimhinden med en tre-dages sår [18], hvor den øgede ekspression af Le

y precursor er relateret til øget cellemotilitet. Derudover steg Le

y-ekspression er signifikant relateret til dårlig prognose i orale kræftpatienter. [19] Imidlertid funktionen af ​​Le

y i oral cancer er ikke helt forstået.

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), et medlem af ErbB-familien, regulerer mange cellulære funktioner gennem aktivering og phosphorylering af dens iboende tyrosinkinasedomæne og nedstrøms signaleringsmolekyler. [20] EGFR overekspression er blevet observeret i oral cancer [21], hvor det kan fremme kræft progression. Derfor er EGFR foreslås at være et mål for anticancerterapi i oral cancer. [22] Endvidere glycosylering af EGFR er afgørende for dens normale funktioner, såsom ligand-binding, dimerisering, signaltransduktion, og internaliseringen-genvinding pathway. [23] Le

y glycosylering af EGFR har vist sig at modulere funktionen af ​​EGFR. [12,16,24] Men om udtrykket af Le

y i oral cancer ville regulere EGFR funktioner ved glycosylering er ukendt. Således er formålet med undersøgelsen var at undersøge den funktionelle rolle af Le

y og sammenslutningen af ​​Le

y med EGFR i oral cancer. Heri viser vi, at Le

y ændring af EGFR stabiliserer EGFR og nedstrøms signalering og fremmer migration i OSCC celler. Vores resultater giver indsigt i, hvordan Le

y glykosylering manipulerer EGFR-signalering i kræft i mundhulen og viser, at Le

y er en potentielt vigtig biomarkør og behandling mål i Le

y-overudtrykkende oral cancer.

Materialer og metoder Salg

Cell Culture

Tre humane OSCC cellelinier, OC-2, OEC-M1, og HSC-3, og en immortaliserede humane keratinocytter gingiva, SG, blev anvendt i foreliggende undersøgelse. Alle disse celler blev venligst stillet til rådighed af professor Dar-Bin Shieh og Yuh-Ling Chen (National Cheng Kung University). OC-2, som er afledt af en primær tumor af mundslimhinden af ​​en kinesisk mand med en historie af rygning og betel-møtrik tygge [25], og OEC-M1, som er afledt af en primær tumor af gingiva af en voksen mand OSCC patient fra Taiwan med en historie af betel-quid tygge [26], blev dyrket i RPMI1640. HSC-3, som er afledt af den menneskelige tunge karcinom med lymfeknude metastaser [27], blev dyrket i MEM. SG, en immortaliseret human gingival epitelcellelinie afledt fra klinisk normal human gingiva voksen, blev dyrket i DMEM. Alle dyrkningsmedierne (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 2 mmol /L L -glutamine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 500 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Celler blev dyrket i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO

2. Salg

Western Blotting

Celler blev vasket med iskold phosphatbufret saltvand (PBS) tre gange og behandlet med cellelyse-buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Total proteinkoncentration cellelysat blev kvantificeret under anvendelse af en bicinchoninsyre proteinanalyse. Prøver blev ligeledes indlæst og underkastet elektroforese. Efter elektroforese blev SDS-PAGE-gel blottet på en nitrocellulosemembran (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland) og inkuberet med primære antistoffer, som blev påvist under anvendelse peroxidasekonjugerede sekundære antistoffer. Signaler blev visualiseret under anvendelse forøget kemiluminescens.

Kvantitativ realtids-PCR

Totalt celle-RNA blev ekstraheret ved anvendelse af et Total RNA-ekstraktion mini kit (RBC Bioscience, Taiwan) ifølge producentens instruktioner. To mikrogram isolerede RNA blev revers-transkriberet til cDNA. Reaktionerne for real-time PCR blev udført ved anvendelse af et ABI 7500 Detektionssekvensen systemet (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), som tidligere beskrevet. [28] Det relative mRNA-ekspression blev beregnet ved anvendelse af 2

-ΔCT metode. [29] glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (

GAPDH

) blev anvendt som reference-genet. Primere sekvenser er anført i tabel 1.

Lentiviral Levering af Short Hårnål RNA

Alle lentivirusvektorer og den virale delivery system blev oprettet ved og fås fra National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taipei, Taiwan). Kort fortalt blev rekombinante lentivira fremstillet ved cotransfektion af HEK293T celler med pMD.G, pCMVΔR8.91, og pLKO.1-puro vektorer indeholdende respektive korte hairpin RNA’er. At knockdown af fucosyltransferase 1 (FUT1) ekspression, FUT1-specifikke korte hårnål RNA (shFUT1) med den målsøgende sekvens af 5′-ACTTGAGAGATCCTTT-3 ‘blev anvendt. Luciferase-specifikke korte hårnål RNA (shLuc) med den målsøgende sekvens af 5’-TCACAGAATCGTCGTATGCAG-3 ‘blev anvendt som en negativ kontrol. De rekombinante virus indeholdende medier blev høstet 24- og 48-h efter transfektion, og den virale belastning blev titreret ved infektion A549-celler med seriefortyndinger. For infektion, OC-2-celler blev udsået og dyrket i 24 timer, efterfulgt af udskiftning af dyrkningsmediet med det rekombinante virus indeholdende medium (infektionsmultiplicitet på 10) og dyrkning natten over. Inficerede celler blev selekteret under anvendelse af puromycin (2 ug /ml) og forberedt til yderligere forsøg.

Immunopræcipitation

Samlede cellelysater (500 ug) blev inkuberet med primære antistoffer (1 ug) ved 4 ° C i 8-12 timer, efterfulgt af udfældning med protein-G agaroseperler (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 4 ° C i 4 timer. Efter vask blev bundfaldene adskilles ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev blokeret med 5% mælk i PBS /0,01% Tween 20 og blottet med de relevante antistoffer.

Assay af AKT og ERK Phosphorylering

Celler blev sultet i 24 timer og behandlet med EGF (ProSpec, Ness-Ziona, Israel) under de angivne betingelser. Cellelysater blev fremstillet til Western blotting for phosphoryleret AKT (klon sc-7985-R; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) eller phosphoryleret ERK (klon sc-7383; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).

celleproliferationsassay

Celler (3 × 10

3 /brønd) blev podet i medium indeholdende 2% FBS på en plade med 96 brønde og dyrket i 24 timer. Derefter blev celler behandlet med EGF som indikeret ved 37 ° C, efterfulgt af inkubering med WST-1-reagens (Roche, Indianapolis, IN, USA). Efter 2 timers inkubation blev celleproliferation bestemt ved at måle absorbansen ved 450 nm.

Scratch Wound Healing Assav

Celler (2 x 10

6 /brønd) blev podet på en 6-brønds plade og dyrket til sammenflydning i medium indeholdende 10% FBS. En ridse blev introduceret til sammenflydende cellelag med et 200-pi pipettespids. Efter vask med PBS blev cellerne behandlet med EGF under de angivne betingelser, og fik lov til at migrere i 10 timer. Migreringen af ​​cellerne blev registreret hver 30 min ved tidsforskudt mikroskopi.

Fremstilling af cellemembranproteiner Salg

EGF-behandlede celler blev høstet i homogeniseringsbuffer [20 mM Tris-HCI (pH 7,5 ), 2 mM EDTA (pH 8,0), 5 mM EGTA (pH 8,0), 10% glycerol og protease-inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)] og lyseret på is ved anvendelse af en ultralyds-homogenisator. Cellerester blev fjernet ved centrifugering (2.500 x

g

, 10 min). Supernatanten blev opsamlet og centrifugeret ved 15.000 ×

g Salg i 30 min. Pelleten blev opsamlet og suspenderet i 100 pi af homogeniseringsbuffer indeholdende 1% NP-40. Proteinkoncentrationen blev kvantificeret under anvendelse af bicinchoninsyre proteinassay.

EGF bindingsassay

Celler blev inkuberet med serum-frit medium indeholdende Alexa Fluor 488 konjugeret EGF (Molecular Probes, Grand Island, NY, USA ) i 1 time ved 4 ° C for at forhindre EGF /EGFR-kompleks internalisering. Efter vask med iskold PBS blev celler høstet i celle dissociation buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved forsigtigt at skrabe på is. Celler blev derefter fikseret i 4% formaldehyd i 15 minutter, og den overfladebundne Alexa Fluor 488 konjugeret EGF blev analyseret ved anvendelse af FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Fluorescensintensitet blev analyseret under anvendelse FlowJo software (FlowJo LLC, Inc., Ashland, OR, USA). For at bestemme EGF bindingsspecificiteten blev en 10 × koncentrationen af ​​umærket EGF tilsat til at konkurrere med mærket EGF.

EGFR Dimerisering Assay

Celler blev sultet med serum-frit medium i 24 timer og behandlet med EGF i 1,5 min. Efter vask med iskold PBS blev 3 ml BS3 forbindelse (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) tilsættes og inkuberes med celler på is i 2 timer for at tværbinde med EGFR. Reaktionen blev standset ved stuetemperatur i 15 min ved behandling med Tris-HCI (50 mM, pH 7,5). Efter vask med iskold PBS blev cellerne høstet og lyseret for western blotting for EGFR. Den dimeriserede EGFR viste en omtrentlig molekylvægt på 340 kDa.

Statistik

Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM. Statistisk signifikans mellem to grupper blev analyseret under anvendelse af en uparret Student

t

-test. Sammenligning af gruppe på tre eller flere blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA med en post test af Tukey korrektion. En P-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Le

y Expression i Human OSCC cellelinier

Vi bestemt udtryk for Le

y syntese enzymer, FUT1 , 2, og 4 [30], i tre humane OSCC cellelinjer, HSC-3, OC-2, og OEC-M1, og en udødeliggjort menneskelige gingivale keratinocytter, SG, ved hjælp af real-time PCR. Resultaterne viste, at mRNA-niveauet af FUTs var højere i HSC-3 og OC-2 end i OEC-M1 og SG-celler (Fig. 1A). Derudover Le

y-ekspression blev vurderet ved Western blotting, og den mest rigelige ekspressionsniveauet af Le

y blev observeret i OC-2-cellelinje (fig. 1B).

(A) Analyse af FUT1, FUT2 og FUT4 mRNA-ekspression i fire mundtlige cellelinier som bestemt ved anvendelse real-time PCR. Den relative overflod af udskrifter blev opnået ved normalisering til GAPDH. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM (n = 3). Den relative forekomst vist i y-aksen var 100 gange resultaterne. n.s .: ikke signifikant, #

P

0,05 og

P

0,001 sammenlignet med HSC-3. *

P

0,05, *

P

0,01 og ***

P

0,001. (B) Repræsentant Western blot af Le

y og α-tubulin i fire mundtlige cellelinjer.

Le

y er glykosyleret af EGFR i OC-2 Celler

Overekspression af EGFR i OSCC patienter er blevet rapporteret. [21] Ligeledes i den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at de OSCC cellelinjer, HSC-3 og OC-2, udviste højere EGFR end de andre to orale cellelinjer (Fig. 2A). For yderligere at undersøge, om Le

y kunne glycosyleres af EGFR, vi udførte immunopræcipitation i HSC-3 og OC-2 celler. Som vist i fig. 2B, Le

y blev udtrykt på EGFR i OC-2-celler, men ikke i HSC-3. Vi undertrykte Le

y udtryk ved hjælp shRNA udtømning af FUT1, som er nøglen enzym til Le

y syntese i OC-2 celler. Efter transduktion med lentivirale shRNA vektorer, blev ekspressionsniveauet af Le

y og ændring af EGFR held undertrykt. Der var ingen ændringer i Le

y og ændring af EGFR i kontrol (shLuc) transducerede celler (fig. 2C, D).

(A) repræsentative Western blot af EGFR og α-tubulin i fire orale cellelinier. (B) Samlet cellelysater blev anvendt til immunpræcipitering (IP) med anti-EGFR og isotypekontrolantistoffer og immunblottet (IB) under anvendelse af anti-Le

y og anti-EGFR-antistoffer. (C) Repræsentant Western blot af Le

y og α-tubulin i OC-2-celler transduceret med FUT1 (shFUT1) og kontrol shRNA (shLuc). (D) Total cellelysater fremstillet ud fra OC-2-celler med FUT1 (shFUT1) og kontrol shRNA (shLuc) transduktion blev anvendt til immunpræcipitering (IP) med anti-EGFR og isotypekontrolantistoffer, efterfulgt af immunoblotting (IB) med anti-Le

y og anti-EGFR-antistoffer.

EGF-induceret Phosphorylering og Migration er svækket ved Undertrykkelse af Le

y Expression

for at karakterisere effekten af ​​EGFR aktivering i OC-2 celler, vi stimulerede celler med EGF og analyseret phosphorylering af downstream signalmolekyler AKT og ERK. Dataene viste, at AKT og ERK blev phosphoryleret med EGF-stimulering i en tidsafhængig måde (fig. 3A), hvorimod, forbehandling med tyrosinkinaseinhibitoren, AG1478, dosisafhængigt reducerede signal transduktion (fig. 3B). Dernæst udførte vi spredning og migration assays til at undersøge funktioner EGFR i OC-2 celler. Resultaterne viste, at der var ingen tydelige forskelle i proliferation af EGF-behandlede OC-2-celler sammenlignes med den i kontrolgruppen (S1A Fig.). Tilsvarende forbehandling med AG1478 havde ingen signifikant virkning på celleproliferation (S1B Fig.). I modsætning hertil blev cellemigration forstærket af EGF-stimulering, hvilket blev inhiberet af AG1478 (fig. 3C). Disse observationer indikerer, at overekspression af EGFR i OC-2-celler kan forøge cellemigrering.

(A) Celler blev stimuleret med EGF for det angivne varighed, og totale cellelysater blev anvendt til Western blotting under anvendelse af de angivne antistoffer. (B) Celler blev stimuleret med (+) eller uden (-) EGF i 5 minutter i nærvær af forskellige doser af AG1478 (EGFR-inhibitor), og totale cellelysater blev anvendt til Western blotting under anvendelse af de angivne antistoffer. (C) Efter præinkubation af forskellige doser af AG1478 (EGFR-inhibitor) i 30 minutter blev celler såret og stimuleret med EGF. Forløbet af cellemigrering blev registreret ved anvendelse af time-lapse mikroskopi, og procentdelen af ​​sårlukning blev beregnet. Repræsentative billeder demonstrerer sårlukning med EGF og EGFR-inhibitor behandling som angivet. er vist kvantitative data. Data er præsenteret som den middel ± SEM (n = 3). *

P

0,05 og ***

P

0,001 versus EGF alene. #

P

0,001.

Glycosylering fører til konformationel ændring som er kritisk for aktiviteten af ​​EGFR. [23] Vi bestemmes virkningerne af Le

y modifikation på funktionen af ​​EGFR i OC-2-celler ved at behandle kontrol og FUT1 knockdown OC-2 celler med serielle gange eller flere doser EGF og analysere phosphorylering af AKT og ERK. Dataene viste, at 5 min af EGF stimulering i kontrol- celler resulterede i -80% og -50% stigninger i Pakt og kvikke niveauer, hhv. Den samme behandling resulterede i 50% og 10% stigninger i Pakt og Perk niveauer i FUT1 knockdown-celler, (fig. 4A). Ligeledes den gennemsnitlige fold ændringer i Pakt og Perk var lavere i Knockdown celler end i kontrol (-20% versus -60% stigning i Pakt og -30% mod -150% stigning i pERK) på den ultimative dosis EGF (Fig . 4B). Desuden blev EGF-medieret cellemigrering faldt i Le

y-deficiente celler (fig. 4C), hvorimod celleproliferation viste ingen signifikant forskel i sammenligning med den i kontrolceller (fig. 4D). Derfor Le

y kan være involveret i EGFR-medieret signaltransduktion og celle migration.

Celler blev stimuleret med EGF for de angivne varigheder (A) eller med forskellige doser af EGF til 1,5 min (B) . Totale cellelysater blev anvendt til Western blotting under anvendelse af de angivne antistoffer. Western blots fra tre uafhængige forsøg blev analyseret ved densitometri. De angivne fold ændringer repræsenterer densiteten i forhold til kontrol (-). (C) Efter præinkubation af AG1478 (EGFR-inhibitor) i 30 minutter blev hver celler såret og stimuleret med EGF. Forløbet af cellemigrering blev registreret ved anvendelse af time-lapse mikroskopi, og området af sårlukning blev beregnet. Repræsentative billeder demonstrerer sårlukning med EGF og EGFR-inhibitor behandling som angivet. er vist kvantitative data. Data er præsenteret som den middel ± SEM (n = 3). *

P

0,05, **

P

0.01, og ***

P

0,001. (D) OC-2-celler transduceret med shLuc eller shFUT1 blev stimuleret med EGF i nærvær eller fravær af AG1478 (EGFR-inhibitor), og cellevækst blev analyseret hver 24 h under anvendelse af WST-1 reagens. Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3).

Le

y Glycosylering Stabiliserer EGFR Expression, men har nogen virkning på ligandbinding og EGFR Dimerisering

For yderligere at undersøge hvordan Le

y modifikation påvirket aktiviteten af ​​EGFR, ligandbinding og dimerisering af EGFR efter aktivering blev testet. Hverken begivenheder blev ændret ved FUT1 knockdown (S2 Fig.). Efter EGF-EGFR binding, den komplekse undergår internalisering og nedbrydning. [31] Denne proces fører til clearance af de aktiverede receptorer fra celleoverfladen og derved afslutning signaltransduktion. Således har vi næste spørgsmålstegn ved, om knockdown af FUT1 ville påvirke nedbrydning af komplekset. Efter behandling EGF blev EGFR stabilt udtrykt i 120 minutter i kontrol celler. I celler transduceret med shFUT1, blev niveauerne af total og overflade EGFR faldt betydeligt på samme tidspunkt (Fig. 5). Dette tyder på, at ekspressionen af ​​Le

å i OC-2-celler modificeret EGFR at opretholde sin aktivitet, hvilket fører til øget celle migration.

Efter 24 timers serum-udsultning, blev cellerne behandlet med 40 ng /ml EGF til de angivne varigheder, og totale cellelysater (A) eller celle membranfraktioner (B) blev anvendt til Western blotting under anvendelse af anti-EGFR-antistof.

Discussion

Forhøjede Le

y-ekspression er blevet rapporteret i mange typer af tumorer, og det er blevet forbundet med aggressivitet af tumorcellerne. I den aktuelle undersøgelse, vi demonstreret, at Le

y udtrykkes kraftigt i HSC-3 og OC-2 OSCC cellelinjer (fig. 1). Le

y modifikation bæres af EGFR i OC-2-celler (Fig. 2B). At udforske rollen som Le

y glycosylering i EGFR-medieret funktioner og sammenhængen med tumor malignitet, OC-2 celler med FUT1 knockdown blev produceret for analyser af signaltransduktion, celledeling, og migration. Vores resultater viste, at EGFR-aktivering fremmer cellemigration, men ikke proliferation, i OC-2-celler (fig. 3), hvori Le

y er nødvendig for opretholdelse af EGFR funktioner. Tab af Le

y dæmper fosforylering af AKT og ERK i nedstrøms EGFR signalvejen og resultater i reduktionen af ​​celle migration (fig. 4). Vi belyst yderligere, at Le

y kan stabilisere EGFR (fig. 5). Dette fund antyder, at overekspression af Le

y er forbundet med malignitet ved at ændre EGFR, hvilket vil styrke kræftcelle migration.

overekspression af EGFR detekteres i forskellige tumorer og augmented aktivering af EGFR udløser flere cellulære virkninger, der fremmer tumorprogression. [32] Le

y-regulerede EGFR-signalvejen er blevet påvist i andre typer cancer, herunder ovariecancer [12], brystcancer [16,24], og epidermoid carcinom. Ved manipulation af ekspressionen og aktiviteten af ​​Le

y, disse undersøgelser beskrevet, at modifikationen af ​​Le

y i EGFR forøger aktiveringen af ​​downstream signaler til at mediere celleproliferation. I den aktuelle undersøgelse, fandt vi, at Le

y blev glycosyleret af EGFR i OC-2-celler, og det modulerede AKT og ERK signalveje at lette celle migration. Dette fund giver en anden dokumentation for den pro-tumorale rolle Le

y. Især Le

y kan ikke være i stand til at kontrollere væksten af ​​OC-2 celler via regulering af EGFR, da vi fandt, at spredning af OC-2-celler ikke blev ændret som reaktion på EGF eller AG1478 behandling. Tidligere undersøgelser afslørede, at den endogene phosphorylering af aurora kinaser, som er mitose regulatorer, detekteres i OC-2-celler. [33] Dette antyder, at OC-2-celler er i stand til at øge cellecyklusfremadskriden i fravær af yderligere vækstfaktor behandling, og som kan forklare, hvorfor EGF ikke udløste højere celleproliferation i sammenligning med den med kontrolbehandling.

Efter EGF binding til EGFR, er den endocytiske proces aktiveres for at nedregulere EGFR gennem nedbrydning eller genanvendelse. [31] Antistoffer direkte mod Le

y er blevet karakteriseret til at have inhibitoriske virkninger på ErbB1 (EGFR) og ErbB2 signalveje gennem påvirker intracellulære routing af ErbB-receptorerne, men ikke ved ophævelse EGF-binding til receptorer. [16] Her vi demonstreret, at mængden af ​​EGFR som reaktion på EGF blev reduceret i fravær af Le

y modifikation. Disse observationer indikerer, at Le

y struktur på EGFR væsentlige fastholder receptor stabilitet ved aktivering, og om Le

y ville udvise den tilsvarende funktion på andre kinase receptorer bør yderligere undersøges.

HSC-3 celler er afledt fra metastatiske tunge cancervæv og anses stærkt invasiv. [27] Trods den foreslåede teori, at Le

y ville korrelere positivt med malignitet af oral cancer, HSC-3 udtrykt mindre Le

y end OC-2-celler, og EGFR blev ikke ændret med Le

y i disse celler. Derudover niveauerne af FUT2 var højere i HSC-3 end i andre perorale celler, mens OC-2 udtrykte mest FUT1 af alle de testede cellelinjer. Variansen af ​​Le

y og FUT udtryk observeret her viser, at der er fremtrædende glycosylerings profiler blandt typer af OSCC. Denne observation kræver yderligere bekræftelse af storstilet analyse. Som tidligere nævnt, Le

y korrelerer signifikant med dårlig prognose i orale kræftpatienter. Her har vi yderligere identificeret, at Le

y udtryk er celletype-afhængig. Således Le

y kan tjene som en glycan markør udnytte til diagnose og behandling

Anti-EGFR-behandling er ved at blive en standard strategi for kræftbehandling.; men der er nogle bivirkninger forårsaget af anti-EGFR midler på grund af skader på EGFR udtrykkende normale væv. [34] Omvendt Le

y ofte overudtrykt på epithel-afledte kræftformer [6] med begrænset eller ingen udtryk i voksne sunde væv. [35] Derfor Le

y kan være et alternativt mål at afskaffe EGFR funktion i tumorvæv specifikt. Vigtigst, blev ingen signifikante bivirkninger observeret i forsøg med anti-Le

y antistof behandling. [36]

Alle disse undersøgelser understreger, at orale kræftceller med Le

y overekspression udviser forbedret celle mobilitet. Rolle Le

y er at stabilisere EGFR og opretholde EGFR-udløst signaleringsveje. Vores resultater giver også indsigt i, hvordan Le

y glykosylering manipulerer EGFR-signalering i kræft i mundhulen. Derfor Le

y kan blive en biomarkør eller behandling mål i Le

y-overudtrykkende oral cancer.

Støtte Information

S1 Fig. EGF behandling har ingen effekt på OC-2 spredning.

Celler blev stimuleret med forskellige doser af EGF (A) eller 20 ng /ml EGF i tilstedeværelsen af ​​forskellige doser af AG1478 (EGFR inhibitor) (B), og celle væksten blev analyseret hver 24 timer ved hjælp af WST-1 reagens. Dataene repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 3)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120162.s001

(TIF)

S2 Fig. Virkningerne af Le

y Modifikation om ligandbinding og ligand-induceret Dimerisering EGFR.

(A) binding af Alexa-EGF på celleoverfladen blev analyseret ved anvendelse af flowcytometri. Umærket EGF (2 ug /ml) blev anvendt til at konkurrere med Alexa-EGF til at bestemme bindingsspecificiteten. Gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) på Alexa-EGF-binding er vist. Data er præsenteret som den middel ± SEM (n = 3). (B) Celler blev sultet og stimuleret med EGF (40 ng /ml) i 1,5 min, og dimeriseringen af ​​EGFR blev analyseret. De kvantitative data viser forholdet mellem dimer og monomer dannelse efter de angivne varigheder af EGF (40 ng /ml) behandling. Data er præsenteret som den middel ± SEM (n = 3). n.s .: ikke signifikant

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120162.s002

(TIF)