PLoS ONE: En omfattende panel af tre-dimensionelle modeller for Studier af prostatakræft Vækst, Invasion and Drug Responses

Abstrakt

Prostata epitelceller fra både normale og cancer væv, der dyrkes i tre-dimensionelle (3D) kultur som sfæroider, repræsenterer lovende

in vitro

modeller til studiet af normale og cancer-relevant mønstre af epitelial differentiering. Vi har udviklet den mest omfattende panel af miniaturiserede prostata cellekulturmodeller i 3D til dato (n = 29), herunder mange ikke-transformerede og mest øjeblikket tilgængelig klassiske prostatacancer (PRCA) cellelinier. Formålet med denne undersøgelse var at analysere morfogenetiske egenskaber PRCA modeller i 3D, for at sammenligne fænotyper, genekspression og metabolisme mellem 2D- og 3D-kulturer, og vurdere deres relevans for præklinisk lægemiddelforskning, sygdom modellering og grundforskning. Primære og ikke-transformerede prostata epitelceller men også flere PRCA linier, der dannes veldifferentierede runde sfæroider. Disse viste stærke celle-celle-kontakter, epitelial polarisering, et hult lumen og var omfattet af en komplet basale lamina (BL). De fleste PRCA linjer imidlertid dannet store, dårligt differentierede sfæroider eller aggressivt invaderende strukturer. I PC-3 og PC-3M-celler, veldifferentieret sfæroider dannet, som blev derefter spontant omdannes til stærkt invasive celler. Disse cellelinier kan tidligere har undergået en epitel-til-mesenchymal overgang (EMT), som er midlertidigt undertrykkes til fordel for epitelmodning af signaler fra den ekstracellulære matrix (ECM). Induktion af lipid og steroid metabolisme, epigenetisk omprogrammering, og ECM remodellering repræsenterer en generel tilpasning til 3D kultur, uanset transformation og fænotype. I modsætning hertil blev der PI3-kinase, AKT, STAT /interferon og integrin signalveje særligt aktiveres i invasive celler. Specifikke småmolekyleinhibitorer målrettet mod PI3-kinase blokeret invasiv cellevækst mere effektivt i 3D end i 2D monolagskultur eller væksten af ​​normale celler. Vores panel af cellemodeller, der spænder over et bredt spektrum af fænotypisk plasticitet, støtter undersøgelse af forskellige former for cellevandring og tumor morfologier, og vil være nyttige for prædiktiv test af anti-cancer og anti-metastatiske forbindelser.

citation: Härmä V, Virtanen J, Mäkelä R, Happonen A, Mpindi JP, Knuuttila M, et al. (2010) En omfattende panel af tre-dimensionelle modeller for Studier af prostatakræft vækst, invasion og Drug Responses. PLoS ONE 5 (5): e10431. doi: 10,1371 /journal.pone.0010431

Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA

Modtaget: Januar 24, 2010; Accepteret: 31 marts 2010; Udgivet: 3 maj 2010

Copyright: © 2010 Härmä et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling på det finske akademi til MN (nr 111.597). Yderligere finansiering til OK og JV blev leveret af FP6 og FP7 integrerede projekter PRIMA og EPITRON af den europæiske kommission. De finansieringsorganer havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Indledning

To-dimensional (2D) monolag cellekulturer repræsenterer meget reduktionistiske modeller af epitelceller og epitelcancer, på grund af tabet af fysiologisk ekstracellulær matrix (ECM) på kunstige plastoverflader, og høje serumkoncentrationer. Følgelig celler mister relevante egenskaber, såsom differentiering, polarisering, celle-celle-kommunikation og ekstracellulære matrix kontakter, mens sårheling, inflammatoriske processer, og hyper-proliferation er kunstigt fremmes. I monolagskultur af prostatacancer (PRCA) linjer og homøostase af udifferentierede tumor stamceller gennem basal, transit-forstærker- og terminalt differentierede, hormon-følsomme luminale celler afhænger af celledyrkningsbetingelser, calcium og serum-koncentration [1], [2] og kun dårligt betegner tumor cellebiologi in vivo. Manglen på en relevant basal lamina (BL), defekt ECM deposition, og manglende stromale eller myoepithelial komponenter [3] yderligere bidrager til en kunstig natur. Som følge heraf er de mest effektive småmolekylære inhibitorer i monolagskulturer er kemoterapeutiske lægemidler, der er målrettet proliferation og mitose. Denne ubalance bidrager til den dårlige prædiktive værdi af sammensatte effektiviteter mellem

in vitro

og

in vivo

eksperimenter. Drug handling, der vedrører celle-celle interaktion, modning, epitelial til mesenkymale overgang (EMT) og cancer stamceller (CSC) er tilbøjelige til at gå uopdaget. Både 3D arkitektur og ECM udøve stærke virkninger på lægemiddeleffektivitet [4]. Glandulær epitelial kræftceller hurtigt tilpasse sig forskellige mikromiljøer og kan dynamisk skifte mellem alternative veje, der regulerer proliferation, differentiering og overlevelse.

Udviklingen af ​​resistens eller manglende reaktion på kemoterapeutiske stoffer kræver også passende cellekultur modeller. Lægemiddelresistens tilskrives ofte kræft stamceller (CSC) hypotese: antimitotiske cancerlægemidler skåne langsom prolifererende, tumor-regenererende stem- eller progenitorceller [5] – [7], som i sidste ende igen udgør tumormassen. Dette kan være samtidig med EMT [7] – [10] og forøget metastatisk potentiale [8]. Søgningen efter anti-cancer medicin har således indgået en ny fase, hvor forskerne i stigende grad udnytter organotypiske modelsystemer til mere direkte udforske drug mål for flercellede organoids, ofte beriget for stamceller [11]. Passende

in vitro

forsøgsmodeller egnede til analyse af CSC homeostase, EMT, invasion og metastase, bliver stadig mere relevant for kræft lægemiddelforskning. Disse bør også være omkostningseffektive og give tilstrækkelig kapacitet til højt indhold screening.

Den kultur af kirtel epitelial (kræft) celler i renset ECM, såsom collagen, hydrogeler eller Matrigel, blev etableret i løbet af to årtier siden [12 ]. Matrigel betegner en rekonstitueret, laminin-rige basalmembran, der understøtter processer såsom cellepolaritet, celle-celle- og celle-matrix-vekselvirkning, og re-ekspression af differentieringsmarkører selv i transformerede linjer [13]. Mammae og prostata epitelceller danner sfæroider, benævnt mammospheres [14] eller prostaspheres [15], hhv. Normale prostata epitelceller differentierer til brønd-polariserede hule sfæroider, et kendetegn for funktionelle, glandulær epitelceller. Den samme mikromiljø understøtter også cellemigrering, forgrening og dannelsen af ​​karakteristiske acini [16], [17]. I modsætning hertil tumorceller viser normalt en defekt differentiering program, og danner atypiske spheroids med uorganiseret arkitektur, som påvist mest fremtrædende for brystkræft [18] – [20]. Gene ekspressionsmønstre af sfæroider blev påvist at korrelere med de karakteristiske fænotyper dannet i 3D kulturer [19], [20] og overordnet differentiering og aggressive potentiale kræft [21], [22]. Svarende til normale epitelceller, kan PRCA celler også aktivt invadere omgivende matrigel, selv om deres tilstand af migration er forskellig fra de normale, kollektive ark eller rør migrationsmønstre observeret i forgrening af normale celler. Fænotypen af ​​kræft invasion afhænger af sammensætning og tæthed af ECM, og kan variere fra amoeboid blæredannelse, mesenkymale fibroblastlignende motilitet og flercellede streaming eller kæde migration [23], [24]. Naturligvis den invasive potentiale afhænger også af den genetiske baggrund af PRCA celler og deres (normalt kompromitteret) evne til at indgå i strenge epiteliale celle-celle-kontakter. Mamma og andre epitelcancerceller formning af cylindriske, spindel-lignende celler med potentiale til at trække sig sammen og langstrakte, støtte migration gennem den omgivende ECM mesh. Meget mindre vides om PRCA. Invasion bistås af proteolytiske processer og proteaser såsom cathepsin [25], matrixmetalloproteinaser (MMP’er [24]), opløselige faktorer der udskilles af fibroblaster eller tilstedeværelsen af ​​fibroblaster selv [26], [27], og andre faktorer, såsom fibronectin og lysyl oxidaser [26]. I denne henseende 3D-modeller af tumor-celleinvasion [28] repræsenterer cellulære dynamik og arkitektur af tumorer langt bedre end 2D monolagskulturer hvor celler spredt og glide hen plastoverfladen. Potentialet til at undergå en EMT og erhverve mesenchymale migration tilstande er en anden parameter, påstås at medvirke bryst-og PRCA invasion og motilitet [29].

Desuden er det uklart, om PRCA sfæroider, især ved dyrkning i lrECM , show berigelse af CSC populationer (som er ofte forbundet med en EMT), eller udvikle resistens mod kemoterapeutiske midler og ioniserende stråling [30], [31]. I det mindste, ville forventes inddragelse af CSCs eller EMT at vise en meget forskellig dynamik i differentiere 3D kulturer i LrECM, sammenlignet med flydende prostaspheres og 2D monolag betingelser [32]. Sidste ikke mindst, er cellekultur modeller for tumorceller invasion i øjeblikket begrænset til nogle få udbredte, potentielt kunstige assays (Transwell invasion analyser, scratch-sår migration assays). Da invasionen er fundamentalt anderledes under 3D betingelser, eventuelle repræsentative 3D invasion-modeller repræsenterer en veritabel nyhed [26, 28, og 33].

Vi rapporterer her udvikling og morfologiske karakterisering af miniaturiserede 3D model cellekultur systemer, udnytte et panel af 29 prostatacellelinjer. Et udvalg af de mest repræsentative linjer blev derefter yderligere karakteriseret ved genom-dækkende transkriptom analyser og systembiologi til at identificere de vigtigste veje, signalmolekyler, gen netværk og formodede drug targets kritiske for vækst og invasion af maligne PRCA celler. Desuden til bioinformatiske billede analyseværktøjer kvantificere dynamiske fænotypiske funktioner såsom invasive strukturer, klumpformet form eller narkotika reaktioner er blevet udviklet.

Materialer og metoder

cellelinjer og monolag kulturer

Cellelinjer blev købt fra ATCC eller anmodet fra den oprindelige laboratorier (tabel S1). Normale epitelceller og derivater (Prec, EP156T, RWPE-1, RWPE-2, RWPE-2 /VV99, WPE1-NB14, PWR-1E, PZ-HPV-7 og CA-HPV-10) blev dyrket i keratinocyt serum- frit medium (KSFM, Gibco), suppleret med 12,5 mg /l oksehypofyseekstrakt og 1,25 ug /l EGF. Til 3D-kulturer, blev 2% føtalt bovint serum (FBS, Gibco) tilsat. De fleste PRCA linjer blev dyrket i RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), suppleret med 10% FBS. MDA-PCA-2b og NCI-H660-celler blev dyrket i Hams F12-medium (Gibco) med 20% FBS, 25 ng /ml choleratoxin, 10 ng /ml EGF, 5 pM phosphoethanolamin, 0,1 ng /ml hydrocortison, 45 nM selensyre og 5 ug /ml insulin (alle fra Sigma). Alle celler blev opformeret ved 37 ° C i standard cellekultur betingelser (5% CO2, 95% luftfugtighed). Identitet af cellelinjer blev bekræftet af arrayCGH (komparativ genomisk hybridisering) på Agilent 244 k menneskelige genom arrays, efter 10-15 passager celler blev indstillet.

miniature 3D kulturer.

Cellerne blev indlejret mellem to lag Matrigel på uovertrukne Angiogenese u–slides (Ibidi GmbH, Tyskland): bundbrønde blev fyldt med 10 pi Matrigel /dyrkningsmedium (01:01; 50%) og polymeriseret ved 37 ° C i 30 minutter. Celler blev derefter podet ved 20.000 celler /ml densitet (~1000 celler /brønd). Efter fastgørelse (1-2 timer ved 37 ° C) blev celler dækket med et andet lag af Matrigel /dyrkningsmedium (1:04, 25%), fik lov til at polymerisere natten over ved 37 ° C. Celledyrkningsmedium blev ændret hver anden dag.

3D bulk-kulturer til RNA-ekstraktion.

Prostaspheres blev dyrket i Millicell hængende cellekultur indsætter med 1,0 um PET gennemsigtige membraner (Millipore) på 6 brønde plader (Costar). Membraner blev præ-coatet med Matrigel /medium (1:01) og inkuberet ved 37 ° C i 1 time, for at forhindre vedhæftning til membranen. Cellesuspensionen blev blandet 1:04 med Matrigel, overført til den coatede brønd, og polymeriseret natten over ved 37 ° C. Celler blev fodret hver anden dag med frisk medium nedefra.

Cell fiksering, immunofluorescens mærkning og billeddannelse.

miniature 3D kulturer blev fastsat inden mikrobrønde, hjælp 4% paraformaldehyd, suppleret med 0,8% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 5 mM EGTA og 1 mM MgCl

2 for 15-20 min ved stuetemperatur. Faste kulturer blev vasket 3 gange med PBS og blokeret i 1 time med 20% hesteserum. Kulturer blev inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer (listet i tabel S2), vasket med PBS og inkuberet ved stuetemperatur i 4 timer med sekundære antistoffer og Hoechst nuklear farvning (1:5000).

3D strukturer blev farvet med calcein AM levende celle farvestof (Invitrogen). Konfokal tredimensionelle billeder blev taget ved hjælp af Zeiss Axiovert 200 M med spinning disc konfokal enhed Yokogawa CSU22 og en Zeiss Plan-Neofluar 5 × mål. Z-stakke er erhvervet med en trin-størrelse på 19 um. Intensitet fremskrivninger blev skabt af SlideBook 4.2.0.7 og NIH ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/), yderligere analyseret med VTT Acca software (følsomhed 10; tærskel 5, strukturer mindre end 500 pixels i området /størrelse filtreret ud). Box plots blev visualiseret med R. 20x fase-kontrast tid bortfalder billeder blev erhvervet med Incucyte (Essen instrumenter), præ-behandlet med ImageJ og analyseret med VTT Acca (følsomhed 30; tærskel 5, strukturer mindre end 1000 pixels i området filtreret) .

RNA-ekstraktion og mikroarrays.

3D bulk-kulturer blev vasket med iskold PBS, membraner udskåret med en skalpel, og sfæroider overført til plader med 6 brønde. Geler blev blandet kraftigt med 9 ml af 5 mM EDTA i PBS, overført til 15 ml Falcon-rør og inkuberet på en bordplade rocker i 45 minutter for at løsne sig fra Matrigel. Prostaspheres blev sedimenteret ved centrifugering og lyseret med RLT-buffer (Qiagen). Celler opformeret i monolag blev lyseret ved 90% sammenløb, direkte fra 10 cm cellekultur retter med RLT buffer. Total RNA (fra biologisk replikater) blev ekstraheret med RNeasy Mini kit (Qiagen) ifølge producentens protokol. 300 ng RNA blev amplificeret med Ambion s Illumina TotalPrep RNA Amplification kit. IVT reaktionen blev udført natten over (~16 timer) til opnåelse tilstrækkelig biotinyleret cRNA. RNA- og cRNA koncentrationer blev målt med et NanoDrop ND-1000, blev den samlede kvalitet overvåget med BioRad s Experion elektroforese station. 750 ng cRNA blev hybridiseret på Illumina s Sentrix HumanRef-8 v3 BeadChips, ved 58 ° C natten over. Hybridiseret cRNA blev påvist med 1 mg /ml Cyanine3-streptavidin (GE Healthcare Biosciences), og arrays scannet med Illumina BeadArray Reader. Data blev kvalitet kontrolleres og udvindes ved hjælp af Illumina GenomeStudio software, uden normalisering eller baggrund subtraktion.

Microarray dataanalyse.

Rå mikroarraydata var fraktil-normaliseret, ved hjælp af biologisk leder R pakken “beadarray”. Normaliserede data blev yderligere bearbejdet ved anvendelse af en varians og intensitet filter. Statistisk analyse af differentiel genekspression blev udført under anvendelse af limma og lumi R /BioConductor pakker. Tærsklen for differentiel ekspression var q 0,05 efter en Benjamini-Hochberg multiple test korrektion. Normaliseret Illumina genekspression data for hele panelet af eksperimenter er blevet forelagt for GEO (Genekspression Omnibus) som studie GSE19426

Data blev derefter anvendt i to forskellige tilstande:. At vurdere relative ændringer i genekspression mellem 2D og 3D eksperimenter eller forskellige tidspunkter i 3D kultur, mener normaliserede værdier i 3D blev trukket fra middelværdier af gentagelser i 2D monolayerkultur og nøgletal beregnet. Log (2) omdannes 2D /3D-forhold blev derefter anvendt til klyngedannelse og Heatmap generation (Cluster 2.11 og TreeView 1,60, Stanford University), og gen-ontologi analyse (GO, DAVID, https://david.abcc.ncifcrf.gov/) . K-Midler klyngedannelse blev brugt til at tegne repræsentative heatmaps baseret på 2D /3D-forholdet data genererer 12 knuder (100 iterationer). Gene Set Analysis (GSA) pakke i R blev anvendt til at definere væsentligt beriget gen kategorier, her de “Maxmean” statistik blev anvendt til at beregne berigelse scorer, og permutation baseret p-værdier blev afledt fra 1000 bootstrap replikater. En falsk opdagelse sats (FDR) korrektion blev også anvendt som et mål for relevans. Gensæt anvendes til analyse blev opnået fra Molecular signaturer Database (MSigDB, Broad Institute), herunder positionelle, kurateret, co-ekspression kvarter, GO, og evolutionært konserverede transkription-faktor mål.

andet normaliseret men ellers un-forarbejdede genekspression data blev anvendt til at definere gen signaturer, der korrelerer med fænotypiske egenskaber (runde /normal, masse, stjerneformet fænotype). Principal komponent analyse (PCA) og plotning af informative gener korrelerer med kugleformede morfologier blev udført på grundlag af specialiserede R scripts. Gener, der repræsenterer den største procentdel af varians blev udvalgt på grundlag af ANOVA.

Ingenuity Pathway Analysis (IPA) og sammensatte udvalg.

differentielt udtrykte gen klynger (2D /3D-forhold) blev uploadet til IPA til udføre gen netværk analyser og identificering af potentielt informative central “hub” gener. Specifikke småmolekyleinhibitorer mod visse hubs eller hub gener og veje blev erhvervet fra Tocris og SIGMA-Aldrich (se nedenfor). Yderligere og uafhængige kilder til lægemiddel /målrette information blev også brugt til det samme formål (DrugBank, https://www.drugbank.ca, Matador https://matador.embl.de)

RT-PCR. validering.

2 ug totalt RNA blev revers transkriberet med Invitrogen Superscript II revers transkriptase i 50 pi. cDNA’er blev fortyndet 1/10. QRT-PCR blev udført i triplikater med 7900HT Hurtig Sequence Detection System (Applied Biosystems) i 96-brønd eller 384-brønds pladeformat, 8 pl /brønd. PCR-primere og prober blev designet baseret på Roche Universal probebibliotek blev oligonucleotider bestilt fra Sigma-Aldrich. Primere blev anvendt ved 300 nM, prober ved 100 nM koncentration; med 2x TaqMan® Universal PCR Master Mix. PCR kørsler blev analyseret ved hjælp af Applied Biosystems SDS software

Protein lysat microarrays (LMA)

Prostaspheres blev indsamlet på dag 3, 6, 8, 10 og 14..; ifølge den følgende protokol: mikrobrønde blev vasket med PBS, Matrigel blandet med iskold 5 mM EDTA i PBS, overført til V-bundplade med 96 brønde (Greiner), og inkuberet på is i en bordplade-ryster i 30 minutter. Sfærer blev sedimenteret ved centrifugering og lyseret i LMA-puffer (0,2% SDS, 100 mM Tris, 10 mM DTT). Monolag celler blev høstet i LMA-buffer ved 90% konfluens i 10 cm plader. For hvert tidspunkt blev to biologiske replikater trykt på et enkelt array. Udskrivning, farvning, scanning, baggrund subtraktion, at normalisering i forhold p-actin signal, og data blev udført som beskrevet tidligere [34].

Western blotting.

Protein prøver fra kultur brønde var opsamlet som beskrevet fra mikrobrøndsplader, og lyseret i WB-buffer (25 mM Hepes pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA pH 8,3, 0,5% Triton X-100, 20 mM β-glycerophosphat, 100 uM orthovanadat, 0,5 mM PMSF og 1 mM DTT). Proteinkoncentrationen blev målt ved Bradford-assay, og proteiner separeret ved SDS-PAGE med færdigstøbte personsøger geler (Lonza), overført på Protran nitrocellulose transfer membran (Whatman), og blottet med de primære antistoffer, der er anført i tabel S3. Multiplex inkubering med tre antistoffer blev anvendt til at rumme for den lille totale mængde af proteiner ekstraheret fra miniaturiserede kulturer. Antistoffer blev påvist med Alexa infrarøde farvestof-konjugeret sekundære antistoffer (Invitrogen), og membraner, der er scannet med Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR).

Drug behandlinger i 3D.

forbindelser blev beordret fra Sigma eller Tocris Inc., og opløst i den passende vehikel (DMSO, ethanol, 1 x PBS) ifølge producentens instruktioner. Rekombinante humane kemokiner, cytokiner og funktionsrelaterede blokerende antistoffer blev bestilt fra R dannelse af relevante flercellede strukturer er understøttet. Klumpformet dannelse i Matrigel blev typisk initieret af enkelte celler. Sfæroiderne dannet i Matrigel generelt faldt i fire morfologiske kategorier, tilpasset fra [19], [35] (Figur 1, Figur S2).

De fleste strukturer faldt i kategorierne runde, masse, stjerneformet eller grape- synes om. Nogle cellelinjer ikke danne sfæroider i Matrigel men fortsatte som enkelte levende celler i op til to uger (enkelt fænotype). De fleste sfæroider blev afbildet på dag 9-10 efter inokulering. PC-3 sfæroider, vist som runde fænotype på dag 9, underkastes en metamorfose til invasiv /stellat fænotype på dag 13. Det samme sker for PC-3M på et tidligere tidspunkt (dag 5-8).

Forgrening /Round fænotype.

Normalt primær prostata epitel (PrECs) og ikke-transformerede linjer såsom RWPE-1 og EP156T celler dannede runde sfæroider efter 6-10 dage i kultur (figur 1). Normale PrECs og in-vitro immortaliserede cellelinjer, såsom RWPE-1 og PWR-1E celler samtidigt dannede forgrening acinære og runde sfæroide strukturer, aktivt migrere ind i det omgivende ECM i form af store celleaggregater (figur 2a-d). EP156T celler viste ingen eller få forgrenede strukturer. Runde strukturer generelt udviklet en robust basale lamina (BL), som indkapsler både sfæroider og acinære strukturer (figur 2, figur S2, figur 3g-m). Overraskende, tumorlinjer DU145, PC-3 og PC-3M-celler dannede også runde og godt differentierede, polariserede sfæroider (figur 2e), omgivet af et komplet BL, og ofte indeholder et lumen (PC-3, figur 3e + r) . Derudover PC-3 sfæroider ofte indeholdt en intern cellemasse minder om strukturer set i PIN (prostata intraepitel neoplasier). Immunfarvning for stram-junction proteiner, såsom ZO-1 (ikke vist) og F-actin (figur 3a-c) viste generelt meget robust celle-celle-kontakter og celle polarisering i runde sfæroider dannet af både normale og tumorceller.

A) fase kontrast billede af forgrening strukturer dannet af RWPE-1-celler, B) acinar struktur dannet af RWPE-1 farvet med et antistof mod laminin B1. C) Forgrening eller klynge-lignende strukturer dannet af primær prostata epitelceller (Prec). D). Blandet forgrening og masse fænotype strukturer, der dannes ved PWR-1E celler. E) Runde strukturer dannet af PC-3-celler på dag 9, levende cellefarvning med calcein. F) Morfologisk transformation af runde sfæroider i invasive strukturer på dag 13. G) Fase-kontrast billede af invasive PC-3 strukturer omkring dag 13. H). Farvning af PC-3 filopodia med et antistof specifikt for den aktive form af integrin beta 1 (ITGB1), der illustrerer tætte udsmykning af spindel-lignende cellestrukturer.

Alexa488-mærket phalloidin blev anvendt til at detektere F actin og Hoechst stain at mærke nuclei (blå). RWPE1, DU145 og PC3 celler viser ekspressionen af ​​EMT-relaterede mesenkymale markører, uanset fænotype (PC-3 celler rundt på dag 9, stjerneformet på dag 14)

Mass fænotype

..

størstedelen af ​​PRCA (LNCaP, 22rV1, MDA-PRCA 1, UM-SCP1, CWR-r1, LAPC-4) og to

in vitro

transformerede linier (PWR-1E, RWPE-2) genereret store, uregelmæssige sfæroider med ofte ufuldstændige eller mangler BL, også mangler en hule lumen (figur 3d + k). PWR-1E var den eneste masse-fænotype cellelinie stand til forgrening /acinære morfogenese (figur 2d). Den luminale keratiner KRT8 og KRT18 var altid udtrykkes kraftigt (tabel S3). Celle-celle-kontakter, modning og polarisation var generelt mindre udtalt sammenlignet med runde sfæroider, afspejles i de ofte nyreformet uregelmæssige sfæroider (figur 1). Masse fænotype strukturer gjorde normalt ikke vise invasion af lrECM; Men dannelsen af ​​filopodia eller pseudopodia konsekvent observeret i 22rV1 og lejlighedsvis i LNCaP og RWPE-2-cellelinjer. I LNCaP sfæroider blev cellerne ofte observeret at forlade sfæroide strukturer på steder af ufuldstændig BL dækning (Figur S2).

Grape-lignende fænotype.

Kun én cellelinje, 1013L, konsekvent dannede løse klynger af celler med særligt dårlige celle-celle kontakter, mangler enhver BL. LAPC-4 celler dannes både masse og drue-lignende strukturer. Ingen invasive egenskaber blev observeret i disse cellelinjer.

Stellate “invasiv” fænotype.

in vitro transformerede cellelinier RWPE-2 /VV99, WPE-1 /NB14, og tumor linier ALVA-31 og ALVA-41 dannet stjerneformige eller invasive strukturer, kendetegnet ved spindel-lignende filopodia (figur 2g) og den hurtige migration af kæder af celler gennem den omgivende ECM. Invasive strukturer dannet var næsten udelukkende flercellede og viste en kædelignende invasion tilstand. Fibroblast-lignende, blev mesenkymale invasion af enkelte celler observerede kun lejlighedsvis.

in vitro

transformerede linier RWPE-2, RWPE-2 /VV99 og WPE1 /NB14 samtidigt dannede stjerneformige strukturer og runde sfæroider, indikerer heterogene sammensætning af disse cellelinjer. Af disse RWPE-2 /VV99 repræsenteret cellelinjen med den mest konsekvente stjerneformet fænotype, og blev udvalgt til yderligere forsøg. Immortaliserede prostata stromale celler (WPMY-1) og tumorafledte, primære stromaceller (ikke vist) udformet også stjerneformige-lignende strukturer, men mangler hurtig motilitet og invasive egenskaber.

Invasive switch.

Rund og godt differentierede, polariserede sfæroider blev dannet ved PC-3 og PC-3M celler, men undergik en spontan transformation mod invasiv morfologi omkring 10-13 og 6-8 dage i 3D, (figur 2e + f, supplerende invasion Movie S1). Starten af ​​morfologisk transformation i stjerneformet invasive fænotype var afhængig af celledensitet. Transformation kan midlertidigt forsinket og endda delvist vendt på fodring frisk medium, men i sidste ende fortsat fremskridt indtil alle strukturer blev grundigt transformeret og kun stjerneformige strukturer forblev (Figur 2g). Invasive strukturer og filopodia dannet endda før invasionen kraftigt udtrykte aktive form af lamininer-receptor integrin beta 1, hvilket indikerer stærke kontakter til den ekstracellulære matrix som en forudsætning for invasive processer (Figur 2h). Samtidig BL af transformerede strukturer bliver stadig fuzzy og desintegrerede (fig 3m). Stærk udtryk for mesenkymale markører Vimentin VIM og Fibronektin fn1 (Figur 3o-y), observeret i ikke-invasiv RWPE-1 (heterogen) og DU145, men også i PC-3 celler, ikke korrelerer med stjerneformet fænotype. Desuden blev udtryk for VIM og FN1 ikke steget efter invasive transformation af PC-3 og PC-3M celler (figur 3s + y)

“Single” fænotype.

Nogle kræft linjer ( VCAP, DuCaP, NCI-H660 og MDA-PCa 2b) undlod at danne sfæroider, men fortsatte som enkelte celler ( “single” eller “ental fænotype”) i op til 2 uger. Interessant, alle disse cellelinjer var positive for ETS-transkriptionsfaktor fusionsbegivenheder eller omlejringer (TMPRSS2-ERG i H660, VCap og DuCaP, en afbalanceret ETV1 omlejring i MDA-PCa 2b). Genekspression analyser af VCap celler i Matrigel viste, at celler kan undergå terminal differentiering eller senescens når indlejret i Matrigel (data ikke vist). Ekspression af TMPRSS2-ERG fusion gen- og spredningsfølsomme relevante gener blev reduceret i Matrigel. Men væksten i VCAP og DuCaP var ikke begrænset i kollagen type I geler; og genekspressionsmønstre i Col jeg var begrænset (ikke vist).

Dynamiske ændringer i genekspression som reaktion på Matrigel korrelerer med normale, transformeret og invasive egenskaber

LrECM og dannelsen af ​​sfæroider fremkalde grundlæggende ændringer i cellebiologi, protein og mRNA genekspression af PRCA celler. Omkring 3400 mRNA blev differentielt udtrykt mellem 2D- og 3D betingelser, men ikke konsekvent på tværs af alle cellelinjer og alle tidspunkter. Tre generelle mønstre af ændret genekspression blev observeret på tværs af panelet af cellelinier (figur 4a + b). Ændret ekspression af udvalgte gener blev valideret af QRT-PCR (figur 4c). Faktorer af differentieret udtryk, hvilket bekræftes af QRT-PCR, var generelt større i forhold til de array-data. GO analyser og GSEA afsløret meget betydelige berigede funktionelle gen kategorier for de fleste af de klynger (tabel S4, S5 og S6).

A) Heatmap, illustrerer 12 klynger genereret af K-betyder algoritme. Klynger 1 + 2 repræsenterer gener udelukkende påvirket i normale celler (Prec, EP156T). Klynger 6-8 repræsenterer gener ligeledes induceres eller undertrykkes i alle cellelinier som reaktion på 3D-cellekultur i Matrigel 3D, uanset fænotype, eller transformation. Klynger 9-12 indeholder gener karakteristiske for stjerneformige /invasive typen cellelinier (ALVA31, PC3, PC3M, RWPE2 /VV99), eller som er fremkaldt under den spontane konvertering af runde til stjerneformige strukturer (fx PC3, dag 13 og 15).