PLoS ONE: CXCR6, en ny defineret biomarkør for vævsspecifikke Stem Cell Asymmetrisk Self-fornyelse, Identificerer mere aggressiv Menneskelig Melanom Cancer Stem Cells

Abstrakt

Baggrund

Et grundlæggende problem i kræft forskning er at identificere den celletype, der er i stand til at opretholde neoplastisk vækst og dens oprindelse fra normale vævsceller. Nylige undersøgelser af en række forskellige tumortyper har vist, at fænotypisk identificerbare og isolerbare underfraktioner af celler besidder den tumor-dannende evne. I nærværende papir, ved hjælp af to afstamning-relaterede humane melanom cellelinjer, primær melanom linje IGR39 og dens metastatiske derivat linje IGR37, rapporteres to observationer. Den første er den første fænotypisk beviser til støtte for oprindelsen af ​​modermærkekræft stamceller (CSCS) fra muterede vævsspecifikke stamceller; og den anden er identifikationen af ​​en mere aggressiv subpopulation af CSCS i melanom, der er CXCR6 +.

Metoder /Fund

Vi definerede CXCR6 som en ny biomarkør for vævsspecifik stamcelle asymmetrisk selv -fornyelse. Således blev forholdet mellem modermærkekræft dannelse og ABCG2 og CXCR6 udtryk undersøgt. I overensstemmelse med deres ikke-metastatisk karakter, usorterede IGR39 celler dannet betydeligt mindre tumorer end usorterede IGR37 celler. Desuden ABCG2 + -celler producerede tumorer, der havde en 2 gange større masse end tumorer produceret af usorterede celler eller ABCG2- celler. CXCR6 + celler produceret mere aggressive tumorer. CXCR6 identificerer en mere diskret subpopulation af dyrkede humane melanomaceller med en mere aggressiv MCSC fænotype end celler er udvalgt på grundlag af ABCG2 + fænotype alene.

Konklusioner /Betydning

Foreningen af ​​en mere aggressiv tumor fænotype med asymmetrisk selvfornyelse fænotype afslører en hidtil ukendt aspekt af tumor celle fysiologi. Nemlig, opretholdelsen af ​​visse vævsspecifikke stamceller attributter, ligesom evnen til asymmetrisk selv forny, påvirker den naturlige historie af menneskelig tumor udvikling. Kendskab til denne nye aspekt af tumor udvikling og progression kan tilvejebringe nye mål for forebyggelse og behandling af kræft

Henvisning:. Taghizadeh R, Noh M, Huh YH, Ciusani E, Sigalotti L, Maio M, et al. (2010) CXCR6, en ny defineret biomarkør for vævsspecifikke Stem Cell Asymmetrisk Self-fornyelse, Identificerer mere aggressiv human melanom cancerstamceller. PLoS ONE 5 (12): e15183. doi: 10,1371 /journal.pone.0015183

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: August 5, 2010; Accepteret den 28. oktober 2010; Udgivet: 22 December, 2010

Copyright: © 2010 Taghizadeh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af National institues of Health direktørens Pioneer Award # 5DP1OD000805 og af National italienske tilskud COFIN 2008. finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft kemoterapi effekt ofte svækket af enten iboende eller erhvervet tumor modstand, et fænomen kaldet multiresistens (MDR) [1]. MDR kan skyldes flere forskellige mekanismer, herunder reduktion af akkumulering i tumorceller [1]. Den mekanisme, der er mest almindeligt stødt på i laboratoriet er den øgede udstrømning af en bred klasse af hydrofobe cytotoksiske lægemidler, der er medieret af en af ​​en familie af energi-afhængige transportører (ABC familie) [2]. Selv om flere medlemmer af superfamilien har dedikeret bestemte funktioner i forbindelse med transport af specifikke substrater, bliver det stadig mere klart, at det komplekse fysiologiske netværk af ABC transportører har en central rolle i vært afgiftning og beskyttelse af kroppen mod fremmedstoffer. Blandt de menneskelige ABC superfamilien, kun ABCB1, ABCC1 (MDR1) og ABCG2 har hidtil vist sig at mediere MDR, hver med forskellige overlappende efflux substratspecificiteter og væv distributionsmønstre [3]. Opfyldelse deres rolle i afgiftning, er blevet fundet flere ABC transportører skal overudtrykt i kræft cellelinjer dyrket under selektivt pres. Især er ABCB5 overudtrykt i melanom, og ABCG2 udtrykkes af en subcellulære CD133-positive melanomaceller [4], [5].

I denne rapport undersøgte vi en ny kandidat til en melanom kræft stamcelle (MCSC) markering, cytokinet co-receptor CXCR6 med hensyn til egenskaberne af ABCG2-udtrykkende MCSCs. Et vigtigt uløste problem inden for cancer stamceller (CSC) forskning, er, om der er en direkte afstamning forhold mellem CSCS og vævsspecifikke stamceller (TSSCs) fundet i de normale væv, hvorfra cancere opstår. Det er værd at identificere markører, som skelner mellem tumorigen fra ikke tumorigene celler [6]. CD133 udtrykkes af de fleste af melanomcellelinjer [4], og det synes ikke kunne skelne tumorigene fra ikke -tumorigenic celler [6]. Desuden nylig, Weissman gruppe bekræftede tilstedeværelsen af ​​en mere aggressiv subpopulation CD217 + i humant melanom [8]. Vi satte os for at kaste eksperimentel lys over dette spørgsmål ved at undersøge tidligere beskrevne melanom CSCS forbundet med etablerede melanom cellelinjer [4], [6] for tegn på asymmetrisk selvfornyelse, en specifik egenskab af TSSCs [7], [9]. For denne evaluering, vi ansat en ny biomarkør, at vi viser her at være forbundet med asymmetrisk selvfornyelse, kemokinreceptoren CXCR6. I tidligere undersøgelser blev CXCR6 identificeret som en co-receptor for human immundefekt virus-infektion af lymfocytter [10]. Lave niveauer af CXCR6 udtryk er også blevet opdaget specifikt på hukommelse /effektor Th1 celler i perifert blod [11]. For nylig blev ekspressionen af ​​CXCR6 associeret med humane tumorer, herunder melanom [12] – [14]. Heri viser vi, baseret på undersøgelser med mus cellelinjer gensplejsede at gennemgå asymmetrisk selvfornyelse ligesom TSSCs, at både mønster og niveauet af CXCR6 udtryk specifikt er forbundet med asymmetrisk selvfornyelse division.

Vi kiggede til co-sammenslutning af CXCR6 udtryk og ABCG2 udtryk med MCSC aktivitet og evidens for nedstigningen af ​​melanom CSCS fra TSSCs. Faktisk finder vi, at en stor procentdel af ABCG2-positive melanomceller med kendte CSC egenskaber, også udtrykke CXCR6. Desuden ligesom ABCG2-udtrykkende melanomceller, CXCR6-udtrykkende celler er en lille brøkdel af celler i kulturer af primære, metastatisk melanom-cellelinjer og humane melanom biopsiprøver.

In vivo

CXCR6 + melanom celler produceret en tumor på mindre tid end ABCG2 + celler og mere interessant, den negative subpopulation gav ikke en tumor. Denne fænotypiske co-associering CXCR6, en biomarkør for asymmetrisk selvfornyelse i ikke-cancerceller, med CSC aktivitet i tumorafledte celler er tegn på direkte afstamning forhold mellem TSSCs og CSCS i tilfælde af melanocytiske celler og melanom, henholdsvis .

Endelig har vi karakteriseret subpopulationen ABCG2 + /ABCG2- og CXCR6 + /CXCR6- af modermærkekræft til ekspression af melanom antigener (MAA) med henblik på en eventuel immunterapeutisk tilgang mod flere aggressive subpopulationer udtrykker ABCG2 og /eller CXCR6.

Resultater

Identifikation af CXCR6 som biomarkør for asymmetrisk selvfornyelse division

vi har tidligere rapporteret forsøg med en gensplejset dyrket celle model, der giver eksperimentelt kontrollerede asymmetriske selvfornyelse divisioner svarende til TSSCs [15], [16], [17]. Cellerne indeholder en Zn-reguleret vildtype p53 cDNA-gen. I Zn-frit medium, disse celler deler med symmetriske cellekinetikken, producerer to cykling celler fra hver division. Disse inddelinger model symmetrisk tekstilklausulen inddelinger, hvori to stamceller er produceret. I ZnC

2-suppleret dyrkningsmedium, deraf følgende normale niveauer af p53-ekspression inducerer asymmetriske selvfornyelse divisioner der er karakteriseret ved afdelinger, der producerer en cykling søster og en søster, at arrestationer på G1 /S. . Disse inddelinger model asymmetriske tekstilklausulen afdelinger, der producerer en stamcelle og en celle, der enten skelner eller tjener som stamfader for en differentierende celle afstamning

I gen microarray-analyser (NCBI-GEO database, http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=dlmlzmuowumsqxy acc=GSE25334),

Cxcr6

blev identificeret som et gen, hvis udtryk var ikke målbart i symmetrisk selvfornyende kongene p53-nul-kontrolceller dyrket i ZnC

2-suppleret medium. Det blev imidlertid induceret i p53-inducerbare celler, der undergår asymmetrisk selvfornyelse under de samme dyrkningsbetingelser. Kvantitativ RT-PCR-analyser viste, at symmetrisk selvfornyende celler gjorde udtrykkelig

Cxcr6

mRNA på et påviseligt niveau; men dens udtryk steg 8,6 ± 4,4 gange (n = 6 analyser p = 0,002). i celler induceret til at skifte til asymmetrisk selvfornyelse

Den oprindelige microarray analyser viste også, at asymmetriske selvfornyelse var obligatorisk for stigningen i

Cxcr6

udtryk; og derved indikerede, at den forøgede ekspression ikke skyldtes p53-ekspression alene.

Cxcr6

ekspression var også påvises i kongene p53-inducerbare celler gensplejset med tvungen ekspression af type II inosinmonofosfatdehydrogenase gen (IMPDH II), selv når p53-ekspression blev induceret. Angivelse af IMPDH II, det hastighedsbegrænsende enzym til cellulære guanin ribonukleotid biosyntese, forhindrer p53-induceret asymmetrisk selvfornyelse, mens p53-afhængig genregulering intakt [16], [18], [19]. Ved dette kriterium,

Cxcr6

blev defineret som en specifik “asymmetrisk selvfornyelse forbundet (ASRA)” gen.

For at undersøge ASRA biomarkør egenskaber CXCR6 protein, vi undersøgte dens mønster af udtryk bestemmes ved indirekte

in situ

immunofluorescens (ISIF) påvisning i to beslægtede encellede selvfornyelse mønster analyser. I den første, søster pair assayet (SP; [19]), celler udplades ved en tilstrækkeligt lav densitet til at tillade afgrænsning af søster celler ved deres forholdsvis tættere nærhed efter division. I det andet cellerne analyseret efter division i nærvær af cytochalasin D (CD; [20]). CD forhindrer cytokinese, men forhindrer ikke nukleare division. De binucleated celler derved producerede giver en mere sikker sammenligning af søster kerner

I tidligere anvendelser af SP (tidligere kaldet. “Datter par;” [19] og CD assays, bromdeoxyuridin (BrdU) inkorporering blev brugt som en markør for cykling S-fase celler. til de foreliggende undersøgelser anvendte vi cellecyklusfase-specifikt protein cyclin a som en indikator for cykling celler. cyclin a er en velbeskrevet markør for cykling celler, som øger gradvist i niveau fra slutningen G1-fasen til G2-fasen af ​​cellens cyklus [21]. de epifluorescens mikrografier i fig. 1 viser, hvordan indirekte ISIF kan anvendes i SP og CD-analyser til at skelne asymmetrisk selvfornyende celler (asym) fra symmetrisk fornyelse dem (SYM). Under betingelser der fremmer symmetrisk selvfornyelse, søster celle par og cd-arresteret binucleated celler viser en høj frekvens af symmetrisk cyklin a afsløring. i modsætning hertil under forhold, der fremmer asymmetrisk selvfornyelse, et asymmetrisk mønster af cyclin a udtryk er betydeligt mere hyppige.

der er vist eksempler på epifluorescens og fasekontrastmikroskopi mikrografier fra parallel SP og CD-analyser, som beskrevet i teksten. SYM, symmetrisk selvfornyelse (kongene p53-nul konstruerede cellelinier dyrket i ZnC

2-suppleret medium). Asym, asymmetrisk selv-fornyelse (Zn-afhængige, p53-inducerbare manipuleret celler dyrket i ZnC

2-suppleret medium). DNA, DAPI cellekerne-DNA fluorescens. CyA, indirekte ISIF med specifikke antistoffer for cyclin A. CXCR6, indirekte ISIF med specifikke antistoffer for CXCR6. Bemærk, at i ASYM tilstand, CXCR6 er opreguleret i cykling celle, hvilke modeller asymmetrisk selvfornyende TSSCs. Phase, Fasekontrastmikrografi. Scale bar = 50 mikrometer.

Som vist i fig. 1, detekteres CXCR6 protein i både cytoplasmaet og kernen af ​​de genetisk manipulerede celler, der anvendes til at identificere CXCR6 som ASRA biomarkør. Den nukleare ekspression er højere i celler under betingelser med asymmetrisk selvfornyelse, i overensstemmelse med mRNA-ekspression data, som blev beskrevet tidligere. I både SP og CD-analyser, under forhold med symmetrisk selvfornyelse, detekteres CXCR6 protein i begge kerner af søster celler. I modsætning hertil under forhold, der fremmer asymmetriske selvfornyelse, celler viser en højere frekvens af den asymmetriske udtryk mønster, der også direkte korreleret med den asymmetriske mønster af cyklin A. I kvantitativ CD analyser, under betingelser for symmetrisk selvfornyelse, kun 6 % af binucleated celler viste koordinere asymmetrisk ekspression af cyclin A og CXCR6; mens 27% viste denne specifikke mønster under betingelser for asymmetrisk selvfornyelse (p = 0,001). Disse resultater identificerer CXCR6 som et første beskrevne opreguleret biomarkør af celler undergår asymmetrisk selvfornyelse som TSSCs.

ABCG2 og melanom dannelse

I en nylig papir, vores gruppe offentliggjorde, at ABCG2 er udtrykkes af en subpopulation af humane melanomceller (cellelinie WM115) ekspression højt CD133 [4]. Vi udvidet denne analyse af ABCG2 til to yderligere melanom cellelinjer afledt fra den samme melanompatient:. Primær melanomacellelinie IGR39 og den tilknyttede metastatisk linje IGR37

Først som vist i tabel 1, analyserede vi tre polymorfier C /a (421 C a), C /T (S248T) og C /T (F208S) i de usorterede populationer og i ABCG2 + og ABCG2- sorteret subpopulationer afslører en heterozygot status ABCG2 for alle tre polymorfier. Disse resultater er konsistente med oprindelsen af ​​cellelinier fra den samme patient. Vi fokuserede på disse polymorfier siden SNP 421C A er mest almindelig mellem forskellige etniske grupper [22] og er blevet forbundet med nedsat ekspression af ABCG2 protein [23]. Desuden blev F208S og S248P polymorfier associeret med defekt aktiv transport af methotrexat og hæmatoporphyrin [24]; og især, F208S variant proteiner (både glycosylerede og umodne former) er anerkendt som fejlfoldede proteiner ved formodede “Check Point” systemer og let undergår ubiquination og protein nedbrydning i proteasomer [25].

henholdsvis ~11% og ~ 40% af cellerne i aktivt voksende kulturer af IGR37 og IGR39 havde påviselig udtryk for ABCG2 (fig. 2). IGR37 og IGR39 celler blev sorteret i ABCG2 + og ABCG2- subpopulationer og transplanteret ind i NOD-SCID-mus (n = 3 for hver delpopulation evalueret). Usorterede celler blev også injiceret i NOD-SCID-mus (n = 3) til sammenligning. Efter to måneder blev mus fra alle årgange ofret. Tumormasser blev udskåret, afbildet, vejet og nedbrudt til isolering enkeltcellesuspensioner til yderligere analyse. Som vist i tabel 2 og fig. 3, transplantation af ABCG2 + IGR37 celler resulterede i tumorer med 2 gange større masse i gennemsnit i forhold til tumorer, der opstod fra ABCG2- celler (p 0,01). Interessant injektion af usorterede IGR37 celler også resultere i mindre tumorer end ABCG2 + celler, der var statistisk ens i størrelser til tumorer fra ABCG2- celler (Fig 3;. Tabel 2). Usorterede IGR39 celler resulterede i mindre tumormasser, sammenlignet med usorterede IGR37 celler (0,13 gram vs 1,4 gram, henholdsvis; p 0,01) 2 måneder efter injektionen af ​​cellerne (tabel 1). ABCG2- sorteret IGR39 celler udviste ingen makroskopiske masserne på dette tidspunkterne (tabel 2), mens ABCG2 + IGR39 celler producerede tumorer med en 3,6 gange øget masse sammenlignet med usorterede IGR39 celler (tabel 2; p 0,01).

Primær melanom IGR39 celler og metastatisk melanom IGR37 celler blev inkuberet med de angivne fluorescerende FITC-konjugerede antistoffer og analyseret ved flowcytometri som beskrevet i

Materialer og

Metoder. Y-akser, side scatter; x-akserne, relative fluorescens intensitet. Venstre paneler, analyser med isotype (IgG) kontrol antistoffer midterste paneler, analyser med anti-ABCG2 FITC-konjugerede antistoffer. Efter FACS isolation baseret på den angivne port (blå omrids), blev ABCG2 + sorterede celler analyseres igen for at bekræfte berigelse (højre paneler). Numre, procent af den samlede evalueret celler.

5 × 10

5 usorteret, ABCG2 + eller ABCG2- sorteret celler blev injiceret subkutant i fem uger gamle NOD-SCID mus (3 mus for hver eksperimentel betingelse). Efter 60 dage blev tumormassen udskåret vejet og fotograferet.

Enkeltcellesuspensioner blev opnået fra alle tumorxenoplantater og analyseret efter en til to passage gennem flowcytometri at detektere ABCG2- udtrykkende celler. I overensstemmelse med tidligere observationer med WM115 humane melanomceller og melanom biopsier [4], ABCG2 ekspression var ikke påviselig i alle de tumor xenograft cellepræparater (data ikke vist).

CXCR6 og melanom dannelse

IGR37 og IGR39 cellepopulationer udstillet 10,6% og 9,6% frekvenser af udtryk for CXCR6 henholdsvis (fig. 4). CXCR6 + og CXCR6- subpopulationer af IGR37 og IGR39 celler blev sorteret og injiceret i NOD-SCID-mus (n = 3 mus pr kohorte), som det blev gjort for celler sorteret på basis af ABCG2 ekspression. Overraskende, som vist i fig. 5 og tabel 2, efter kun 21 dage fra injektion af CXCR6 + IGR37 celler, betydelige tumorer viste sig, at i gennemsnit 1,8 gange større i masse end tumorer, der opstod fra usorterede IGR37 celler (p 0,01). Desuden blev der ikke tumorer opdaget fra CXCR6- injicerede celler (tabel 2 og figur 6) efter endda 2 måneder. Desuden har de CXCR6- celler ikke nogen masse, selv efter 4 måneder. Lignende resultater blev opnået for IGR39 celler. CXCR6 + -celler producerede tumorer med 2,5 gange større masse sammenlignet med usorterede celler; og ingen masse blev påvist for de CXCR6- celler (tabel 2). Som for ABCG2, CXCR6 + -celler var også påvises i tumorxenotransplantater ved flowcytometri (data ikke vist).

Single markør CXCR6 analyser. Primære melanom IGR39 celler og metastatisk melanom IGR37 celler blev inkuberet med de angivne fluorescerende APC-konjugeret antistoffer og analyseret ved flowcytometri som beskrevet i

Materialer og fremgangsmåder

. Y-akser, side scatter; x-akserne, relative fluorescens intensitet. Venstre paneler, analyser med isotype (IgG) kontrol antistoffer midterste paneler, analyser med anti-CXCR6 APC-konjugerede antistoffer. Efter FACS isolation baseret på den angivne port (blå omrids), CXCR6 + sorteres celler analyseres igen for at bekræfte berigelse (højre paneler).

5 × 10

5 CXCR6 + sorterede celler blev injiceret subkutant i fem -Uge gamle NOD-SCID mus (3 mus for hver forsøgsgruppe tilstand). Efter 21 dage blev tumormassen skåret vejet og fotograferet.

5 × 10

5 CXCR6- sorteret celler blev injiceret subkutant i fem uger gamle NOD-SCID mus (3 mus for hver eksperimentel betingelse). CXCR6- celler gav ikke tumorer.

Endelig har vi analyseret den procentdel af CXCR6 + /ABCG2 + dobbelt-positive celler for begge cellelinier. Som vist i fig. 7, 6,7% og 3,1% af IGR37 og IGR39 celler, henholdsvis var dobbelt-positive for ABCG2 og CXCR6. Da vi injicerede ABCG2 + /CXCR6 + dobbelt positive IGR39 celler i NOD-SCID-mus, tumorer opstod, havde i gennemsnit 4 gange større masse i forhold til tumorer udviklet fra usorterede celler (p 0,01; Tabel 2). Ligesom IGR39 celler sorteres efter CXCR6 udtryk alene, tumorer fra IGR39 ABCG2 + /CXCR6 + celler kræves kun 21 dage for tumor detektion (tabel 2).

Dual markør analyser for CXCR6 og ABCG2. Primære melanom IGR39 celler og metastatisk melanom IGR37 celler blev inkuberet med de angivne fluorescerende APC-konjugeret antistoffer og analyseret ved flowcytometri som beskrevet i

Materialer og fremgangsmåder

. Venstre paneler, bivariate fluorescensintensitet analyser med respektive APC og FITC-konjugeret isotype (IgG) kontrol antistoffer midterste paneler, bivariate fluorescensintensitet analyser med respektive APC og FITC-konjugeret CXCR6-specifikke og ABCG2-specifikke antistoffer. Tal, procent af den samlede evaluerede celler.

melanom fænotype af tumorxenoplantater

multiparametric immunhistokemisk analyse af ABCG2 + IGR37 celler xenografter (tabel 3 og figur 8) viste, at tumoren stammer fra disse celler udviste en homogen ekspression af de differentierings-antigener HBM45, HMW-MAA, og af endothelin B-receptor og en heterogen ekspression af Melan-A antigen. Ingen specifik farvning for ET-1-peptid kunne dokumenteres. Alle celle associeret progression antigener evalueret blev homogent udtryk. Den ekstracellulære matrix makromolekyle tenascin blev påvist i tumoren graft et omfattende interstitielle netværk indeslutter celle reder af variabel størrelse. Blandt de føtale antigener analyserede blev ingen detekterbare niveauer af NY-ESO fundet, mens der blev observeret en svag ekspression af MAGE-antigener. er blevet opnået lignende resultater for ABCG2 + IGR39 celler (data ikke vist).

tumorcellepopulationen homogent udtrykker Melan-A (A) og HMW-MAA (B) differentieringsantigener antigener. Samme fordeling karakteriserer tumorprogression antigener HER-3 (C) og det ekstracellulære makromolekyle tenascin (D). Sidstnævnte karakteristisk afgrænser tumor områder af variabel størrelse. (160 × forstørrelse).

Den CXCR6 + /ABCG2 + fænotype i humane melanom biopsier

Selvom de evaluerede melanom cellelinjer blev afledt fra humane tumorvæv, den nyligt beskrevet CXCR6 + /ABCG2 + cellefænotype kunne have været begrænset til dyrkede tumorceller. Derfor undersøgte vi 4-dyrkede humane melanom positiv lymfeknude biopsiprøver for tilstedeværelsen af ​​celler med CXCR6 + /ABCG2 + fænotype. Alle fire biopsi speciments indeholdt en lille subpopulation af celler ABCG2 + (12,2%, 8,4%, 2,65%, 0,1%). En af disse tre indeholdt også en lille population CXCR6 + (0,25%) og en lille population dobbelt positive ABCG2 + /CXCR6 + (0,3%). Fig. 9 viser resultaterne af flowcytometrianalyse af CXCR6 + /ABCG2 + positive prøver.

Flowcytometrianalyse af en human melanom biopsiprøve for en CXCR6 + /ABCG2 + underfraktion. En metastatisk melanom biopsiprøve blev forarbejdet som beskrevet i

Materiale og fremgangsmåder

og straks analyseret ved flowcytometri. Venstre panel, bivariate fluorescensintensitet analyser med respektive APC og FITC-konjugeret isotype (IgG) kontrol antistoffer. Right panel, bivariate fluorescensintensitet analyser med respektive APC og FITC-konjugerede CXCR6-specifikke og ABCG2-specifikke antistoffer. Numre, procent af samlet vurderet celler.

CXCR6 funktion og CXCL16 niveauer i melanom-cellelinjer

I en nylig papir, binding af CXCR6 den spaltede opløselige fragment af sin membran-bundne ligand CXCL16 ( “sCXCL16”) blev vist at forøge proliferationen af ​​carcinom-cellelinier [11]. Vi undersøgte virkningerne af den frie sCXCL16 ligand på væksten af ​​IGR37 og IGR39 celler.

Niveauerne af CXCL16 i mediet ved usorterede celler af begge cellelinier og i tilsvarende CXCR6 + -celler blev analyseret under anvendelse af ELISA (fig. 10 ). Niveauet af CXCL16 detekteret var ekstremt lav (0,06 OD enheder ± 0,03, n = 8). Ingen signifikant forskel blev observeret mellem den usorterede celle og CXCR6 + sorterede celler efter 3 dages dyrkning (fig. 8).

50.000 celle /brønd blev udpladet i 24 multi-brønds plader. Når cellerne nåede -90% konfluens (~3-4 dage) blev mediet opsamlet og kortvarigt centrifugeret. En 50 pi alikvot af medium blev anvendt til CXCL16 detektion ved anvendelse af Quantikine human CXCL16 Immunoassay (R 0,01). For gennemsnitligt 1,4 gange i celleantal i afhængighed sCXCL16 tilsætning

Tyve tusinde celler blev podet natten over i individuelle brønde i 12 multi Tja plader i komplet medium vækstbetingelser. Rekombinant sCXCL16 (100 ng /ml) blev tilsat den næste dag og erstattet hver 48. time. På den 4. og 7. dyrkningsdag blev cellerne trypsinbehandlet, og antallet af levedygtige celler bestemmes. Søjlediagrammet repræsenterer middelværdien ± S.D. af tre uafhængige forsøg hver udført in triplo. *, P 0,01

vs

. ubehandlede celler (sorte søjler); **, P 0,001

vs

. ubehandlede celler (sorte søjler).

melanom associeret antigen (MAA) udtryk og ABCG2 versus CXCR6 udtryk

Udtrykket profil MAA tilhører Cancer testis-antigener (CTA) Familie ( MAGE-A1, -A2, -A3, -A6, GAGE ​​1-2, GAGE ​​1-6, SSX-2, SSX 1-5, og NY-ESO-1) og af HMW-MAA blev udført ved RT-PCR . Som vist i tabel 4, blev lignende registreringsmønstre for ABCG2 + og ABCG2- subpopulationer observeret for begge cellelinier. Derudover behandling med DNA hypomethyleringsmiddel 5-aza-2′-deoxycytidin var i stand til at inducere en

de novo

ekspression af MAGE-A3, MAGE-A4, GAGE ​​1-2, GAGE ​​1-6 og SSX 1-5 i både ABCG2

+ og ABCG2

-. IGR37 melanom-celler (tabel 5)

med hensyn til CXCR6 + og CXCR6- celle subpopulationer i IGR37 og IGR39 cellepopulationer såvel som dobbelt-positive ABCG2 + /CXCR6 + IGR37 celler, der var et overlap på CTA familie og HMW-MAA (tabel 6). Desuden er det i CXCR6 + IGR37 tumor xenograft, alle MAA familien proteiner overlappede med undtagelse af CXCR6 + IGR37 celler for tyrosinase, Mart-1, og gp100 (tabel 6).

Diskussion

Et grundlæggende problem i kræftforskning er at identificere den celletype, der er i stand til at opretholde neoplastisk vækst. Der er beviser for, at størstedelen af ​​cancerceller er kloner, og at cancerceller repræsenterer afkommet af en enkelt celle (oversigt i [6]). Det er imidlertid uklart, hvilke celler besidder den tumorfremkaldende cellefunktion og fastholde den tumorvækst. Ideen om kræft stamceller teori er, at bestemte celler (

dvs..,

Cancer stamceller, CSCS) besidder de nødvendige regenererende egenskaber, der fører til dannelse af tumorer [6]. Et andet vigtigt punkt, indtil nu uklart, er oprindelsen af ​​de formodede CSCS [6]. En vigtig måde at vise, at en bestemt delpopulation kan opretholde tumorvækst er at bruge xenograftmodeller for humane celler eller syngene modeller for murine celler. , En vigtig kritik, navnlig xenotransplantat-modellen er imidlertid, at det er en kunstig model, idet de for eksempel ved, at heterologe miljøfaktorer ikke betragtes [6]. På den anden side, en anden afgørende punkt er at identificere de markører, der er i stand til at definere en cancer /initierende stamcelle delpopulation.

I nærværende papir, vi har identificeret en ny biomarkør, der er forbundet med asymmetrisk selv- fornyelse, chemokin co-receptor CXCR6. Desuden til rollen som CXCR6 i immunresponset [10], [12], for nylig, CXCR6 ekspression er blevet rapporteret i nogle humane tumorer, herunder melanom [12]. Sammenligne to parentale humane melanomcellelinier, IGR39 (primær) og IGR37 (metastatisk), sidstnævnte var mere aggressiv for tumor xenograft dannelse sammenlignet med primær melanom IGR39 celler. Denne forskel i tumorigent potentiale blev afspejlet i CXCR6-sorteres subpopulationer. Faktisk CXCR6 + -celler resulterede i større tumormasse i en signficantly kortere tid sammenlignet med usorterede celler. Desuden har CXCR6- celler ikke resultere i nogen væsentlig, observerbar tumor masse. Da CXCR6 ekspression viste sig at være forbundet med asymmetrisk selvfornyelse der er typisk for TSSCs, MCSCs synes at være derivat af vævsspecifikke melanocyt stamceller. Selv om det postuleres, at asymmetrisk selvfornyelse af TSSCs skal poleres for dem at blive tumor forstadier [9], [15], sådanne muterede celler kan stadig bevare markører associeret med deres tidligere evne til asymmetrisk selvfornyelse, selv efter dette TSSCs funktion ændres ved mutationer.

Adskillige ABC transportører har vist sig at være overudtrykt i cancercellelinier dyrket under selektivt tryk [6]. Især i forhold til melanom, er ABCB5 overudtrykt i melanom og ABCG2 udtrykkes af en sub-brøkdel af CD133-positive melanom cellepopulation [4], [5]. Heri viser vi, for første gang, et forhold mellem ABCG2 og asymmetrisk selvfornyelse. Faktisk ABCG2 + celler gav en større tumor masse end ABCG2- celler i immunsvækkede mus. Imidlertid CXCR6-udtrykkende celler var mere aggressive for tumordannelse end ABCG2-udtrykkende celler, hvilket antyder, at subpopulationen CXCR6 + /ABCG2 + celler kan være de mest potente MCSCs.

På den anden side, et interessant spørgsmål er, hvorfor hverken ABCG2 + eller CXCR6 + -celler blev detekteret i tumor-xenotransplantater. De kan være alt for sjældent, eller de måske ikke får den nødvendige miljømæssige input til ekspression i immunsvækkede mus. Faktisk, hvis vi dyrket tumorer afledt af ABCG2 + eller CXCR6 + -celler deres ekspression returneres i kultur efter et til to passager [4] (data ikke vist). I denne forbindelse er det vigtigt at understrege, at vores analyse af humane melanoma biopsier bekræftede tilstedeværelsen af ​​en ABCG2 + /CXCR6 + underfraktion i humane væv. Denne konstatering er vigtig for at udelukke den mulighed, at ABCG2 + /CXCR6 + cellefænotype eksisterer kun i cellekultur. Således forekommer det mere sandsynligt, at ekspressionen af ​​proteinerne forhindres af nogle ukendt mekanisme i immunsvækkede mus, eller andre arter i almindelighed dens.

Målretning af MCSCs kan udgøre en hidtil ukendt og mere effektiv klinisk tilgang til human melanom behandling. Dog kan deres specifikke antigen profil hæmmer det kliniske resultat af immunterapeutiske strategier for disse patienter. I den forbindelse undersøgte vi omfanget MCSCs profil for specifikke tumorassocierede antigener (TAA’er) i øjeblikket anvendes som terapeutiske mål i det kliniske miljø. Faktisk kan manglen på passende terapeutiske mål på MCSCs faktisk resultere i langvarig modstandsdygtighed over for behandling, påført udvækst af TAA-negative melanom celle kloner. I den forbindelse har fremkomsten af ​​TAA-negative celler i stand til at unddrage sig immune kontrol blevet rapporteret i melanom patienter i immunologisk behandling [26]. [15].