PLoS ONE: Apigenin sensibiliserer Prostata Cancer Cells til Apo2L /TRAIL ved Targeting adeninnukleotid translokase-2

abstrakt

Apo2 ligand (Apo2L) /tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) er et lovende cancer terapeutisk middel. Rekombinant human Apo2L /TRAIL har været under kliniske forsøg, mens forskellige former for maligne tumorer har resistens mod Apo2L /TRAIL. Vi og andre har vist, at adskillige anticancermidler og flavonoider overvinde modstand mod Apo2L /TRAIL ved opregulering dødsreceptor 5 (DR5) i maligne tumorceller. Imidlertid er de mekanismer, hvorved disse forbindelser inducerer DR5 ekspression forbliver ukendte. Her viser vi, at kosten flavonoid apigenin binder og inhiberer adeninnukleotid translocase-2 (ANT2), hvilket resulterer i forbedring af Apo2L /TRAIL-induceret apoptose ved opregulering af DR5. Apigenin og genistein, som er vigtige flavonoider, forstærket Apo2L /TRAIL-induceret apoptose i cancerceller. Apigenin induceret DR5 udtryk, men genistein ikke. Ved hjælp af vores fremgangsmåde identificere de direkte mål for flavonoider, sammenlignede vi bindende proteiner af apigenin med dem af genistein. Vi opdagede, at ANT2 var et mål på apigenin, men ikke genistein. I lighed med apigenin, knockdown af ANT2 forbedret Apo2L /TRAIL-induceret apoptose ved at opregulere DR5 ekspression på post-transkriptionel niveau. Desuden nedregulering af ANT2 svækket forøgelsen af ​​Apo2L /TRAIL-induceret apoptose ved apigenin. Disse resultater antyder, at apigenin opregulerer DR5 og forbedrer Apo2L /TRAIL-induceret apoptose ved binding og inhibering ANT2. Vi foreslår, at ANT2 hæmmere kan bidrage til Apo2L /TRAIL terapi

Henvisning:. Oishi M, Iizumi Y, Taniguchi T, Goi W, Miki T, Sakai T (2013) Apigenin sensibiliserer Prostata Cancer Cells til Apo2L /TRAIL ved Målretning adeninnukleotid translokase-2. PLoS ONE 8 (2): e55922. doi: 10,1371 /journal.pone.0055922

Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA

Modtaget: 9. oktober, 2012; Accepteret: 3 Januar 2013; Publiceret: 19 feb 2013

Copyright: © 2013 Oishi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en Grant-in-Aid for Unge Forskere (Start-up, 21890223) og (a, 20.533.178) fra Japan Society for fremme af Science (JSP’er). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den anden almindeligt diagnosticeret kræft og den sjette hyppigste årsag til mandlig kræft-relaterede dødsfald i verden [1]. Selvom androgenfjernelse terapi er effektive til behandling af fremskreden prostatacancer, de fleste patienter udviser resistens over for denne terapi [2]. Det blev rapporteret, at docetaxel plus prednison var effektiv til hormon-refraktær prostatacancer [3]. Men resultatet af denne behandling er stadig utilstrækkelig [4]. Derfor er der behov nye strategier til behandling af hormon-refraktær prostatacancer.

Apo2 ligand (Apo2L) /tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) er et cytokin, der hører til tumornekrosefaktor familie. Apo2L /TRAIL binder til dødsreceptor 4 (DR4) og død receptor 5 (DR5) og selektivt inducerer apoptose i forskellige ondartede tumorer, men ikke i normale celler [5], [6]. For nylig blev flere rekombinant human Apo2L /TRAIL og agonistiske anti-DR5 antistoffer udviklet, og klinisk fase I /II forsøg er udført hos patienter med mange slags ondartede tumorer [7]. Men en række af tumorer udvise resistens over for Apo2L /TRAIL og overvinde denne modstand er væsentlig for kemoterapi under anvendelse af Apo2L /TRAIL pathway [8]. Vi og andre har screenet kosten forbindelser sensibiliserende kræftceller til Apo2L /TRAIL og identificeret flere polyfenoler som DR5 inducere [9] – [14]. Men de mekanismer, hvormed disse polyphenoler opregulerer DR5 er ukendte.

adeninnukleotid translocases (myrer) er vigtige transportører i den indre mitokondrielle membran og spille en rolle i udvekslingen mellem ADP og ATP [15]. Myrer har fire isoformer i mennesker og hver isoform udviser en anderledes vævsfordeling. ANT2 overudtrykkes i mange maligne tumorceller og har anti-apoptotiske egenskaber [16], [17]. For eksempel er knockdown af ANT2 vist sig at forøge apoptose ved lonidamin, et antitumormiddel målretning mitochondrier [17], og inducerer apoptose i humane brystcancerceller med inhibering af tumorvækst

in vivo

[18]. Endvidere knockdown af ANT2 sensibiliserer brystkræftceller til Apo2L /TRAIL via opregulering af DR5 [19]. Derfor er ANT2 anses for at være en lovende anticancer mål [20], [21].

For at belyse de præcise mekanismer, hvorigennem flavonoider fremkalde DR5 udtryk, vi udnyttet magnetiske FG perler, som for nylig afslørede målet for thalidomid og mekanismen af ​​thalidomid teratogenicitet [22], [23]. Vi identificerede ANT2 som en bindende protein af kosten flavonoid apigenin som opreguleret DR5. Som med behandling af apigenin, knockdown af ANT2 forbedret Apo2L /TRAIL-induceret apoptose ved opregulering DR5. Desuden knockdown af ANT2 svækket forøgelsen af ​​Apo2L /TRAIL-medieret apoptose af apigenin. I den foreliggende undersøgelse viser vi først at ANT2 er et mål for apigenin som opregulerer DR5 og sensibiliserer maligne tumorceller til Apo2L /TRAIL.

Materialer og metoder

Cell Culture

human prostatacancer-cellelinie DU145 blev opnået som en cellelinie af NIC-60 fra National cancer Institute (MD, USA) Developmental Therapeutics Program (NCI DTP). Human prostatacancer LNCaP blev opnået fra American Type Culture Collection. Vi har bekræftet, at disse prostatakræft-cellelinier er negative for mycoplasma ved anvendelse MycoAlert ™ Mycoplasma Detection Kit (Lonza, Rockland, ME, USA). DU145-celler blev opretholdt i RPMI 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mmol /l glutamin, 50 enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i 5% CO

2. LNCaP-celler blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 4 mmol /l glutamin, 50 enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i 5% CO

2.

Reagenser

Apigenin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) og genistein (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA) blev købt og opløst i DMSO. Human rekombinant Apo2L /TRAIL blev købt fra Pepro Tech (London, UK)

RNAi

Følgende siRNA’er (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) blev anvendt:. SiANT2 # 1, 5 ‘ -AGAACAUUGGACCAUGCACCCUUGA-3 ‘; siANT2 # 2, 5’-UGUAUUGCUUAUCUGCAGUGAUCUG-3 ‘, og Stealth RNAi negativ kontrol høj GC. Kun mening tråde vises. DU145 eller LNCaP-celler blev transficeret med siRNA’er anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).

Påvisning af apoptose

DU145 eller LNCaP-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af hver flavonoid i 24 timer eller transficeres med siRNAs. Human rekombinant Apo2L /TRAIL (50 ng /ml) blev derefter tilsat til cellerne. Efter 24 timer blev cellerne høstet og suspenderet i PBS indeholdende 0,1% Triton X-100, 50 pg /ml propidiumiodid, og 100 ug /ml RNase A (Sigma, St. Louis, MO, USA). Procentdelen af ​​hypodiploid DNA (sub-G1) blev kvantificeret ved FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA). Dataene blev analyseret under anvendelse Cell Quest software (Becton, Dickinson and Company).

Western blot-analyse

DU145 eller LNCaP-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af hver flavonoid eller transficeres med siRNAs. Cellerne blev lyseret med RIPA-buffer (50 mmol /L Tris-HCI [pH 8,0], 150 mmol /l NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoxycholsyre, 0,1% SDS, 1 mmol /l DTT, 0,5 mmol /L PMSF) ved 4 ° C i 30 minutter og blev derefter centrifugeret. Supernatanterne blev opsamlet og separeret ved 10,0% SDS-PAGE og derefter overført til Immobilon-P-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA) under anvendelse våde metode. Membranerne blev gennemvædet i 5% mælk i TBS ved 4 ° C natten over og inkuberet med primære antistoffer ved stuetemperatur i 60 minutter. Primære antistoffer var et kanin-polyklonalt anti-DR5-antistof (Prosci, Poway, CA, USA) ved 1:500 fortynding i 5% mælk i TBS og et monoklonalt muse-anti-β-actin-antistof (Sigma) ved 1:2,000 fortynding i 5 % mælk i TBS. Membranerne blev derefter inkuberet med sekundære antistoffer konjugeret med peberrodsperoxidase ved 1:2,000 fortynding i TBS-Tween 20 i 60 minutter ved stuetemperatur. Protein bands blev visualiseret på BioMax XAR Film (Carestream Health, Inc., Rochester, NY, USA) ved hjælp af Chemi-Lumi One L (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan).

kvantitativ real-time RT-PCR-analyse Salg

DU145 eller LNCaP-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af hver flavonoid eller transficeres med siRNAs. Totalt RNA blev ekstraheret fra cellerne med Sepasol-RNA I super (Nacalai Tesque). Komplementær DNA blev syntetiseret fra total RNA ved hjælp af High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems, Melbourne, Australien). Komplementært DNA blev amplificeret under anvendelse af TaqMan prober til ANT2, DR5, og GAPDH (Applied Biosystems), og en ABI 7300 Real-time PCR System (Applied Biosystems).

Fremstilling af flavonoid-fikserede Perler

Magnetiske FG perler med en epoxy-linker blev indkøbt fra Tamagawa Seiki (Nagano, Japan). Fiksering af apigenin og genistein på perlerne blev udført som beskrevet (Iizumi et al., Upublicerede data). Kort fortalt blev perlerne blandet med apigenin i DMF indeholdende kaliumcarbonat ved 37 ° C i 24 timer for at genistein ved 60 ° C i 24 timer, vasket to gange med DMF og derefter to gange med deioniseret vand. De resulterende perler blev opbevaret ved 4 ° C.

Oprensning og identifikation af Flavonoid-bindende Proteiner

flavonoid-fikserede perler eller tomme perler blev inkuberet med DU145 hele celleekstrakter ved 4 ° C i 4 time. De bindende proteiner blev elueret med Laemmli farvestof, underkastet SDS-PAGE og påvist ved sølvfarvning. Bindingsproteinerne blev derefter underkastet in-gel fordøjelse under anvendelse Sequencing Grade Modified Trypsin (Promega, Madison, WI, USA). Peptidfragmenterne blev analyseret ved en Autoflex II massespektrometer (Burker Daltonics, Billerica, MA, USA).

Resultater

Apigenin Forhøjer Apo2L /TRAIL-induceret apoptose via opregulering af DR5 på Post -transcriptional Level

Blandt de mest almindelige flavonoider, apigenin vides at forøge Apo2L /TRAIL-induceret apoptose via opregulering af DR5, mens genistein forøger Apo2L /TRAIL-induceret apoptose uden opregulering af DR5 [9], [24 ], [25]. I den foreliggende undersøgelse, at kombinationen af ​​disse flavonoider og 50 ng /ml Apo2L /TRAIL markant induceret apoptose, hvorimod hver flavonoid alene ikke gjorde i humane prostatacancer DU145 celler (Fig. 1A, S1, og S2). Apigenin induceret DR5-proteinekspression men genistein gjorde ikke (fig. 1B), mens apigenin ikke opregulere DR5 mRNA (fig. 1C og S3). Disse resultater antyder, at apigenin forbedrer Apo2L /TRAIL-induceret apoptose ved post-transkriptionelt opregulering DR5.

A, DU145-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af hver flavonoid i 24 timer, efterfulgt af behandling med eller uden 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Efter 24 timer blev sub-G1 population af cellerne måles ved anvendelse af flowcytometri. B, blev DU145-celler behandlet med de angivne koncentrationer af hver flavonoid i 24 timer og høstet. Lysaterne blev analyseret under anvendelse af Western blotting med et anti-DR5-antistof. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. C, DR5 mRNA blev kvantificeret ved real-time RT-PCR og normaliseret ved GAPDH. Kolonner, betyder; barer, SD (n = 3). **

P

. 0,01 i forhold til at styre

ANT2 er identificeret som en protein af Apigenin, men ikke genistein

For at belyse den mekanisme, hvormed apigenin inducerer DR5 ekspression undersøgte vi proteinerne binder til apigenin, men ikke genistein, under anvendelse FG perler med en epoxy linker. Apigenin og genistein blev fastgjort på disse perler (fig. 2A). Bindingsproteinerne af apigenin og genistein blev oprenset fra de DU145 hele celleekstrakter og blev identificeret med MALDI-TOF MS analyse. Adeninnukleotid translocase-2 (ANT2) blev identificeret som et bindingsprotein af apigenin, men ikke genistein. På den anden side blev ribosomal protein S9 (RPS9) identificeret som et bindende protein af disse flavonoider (fig. 2B). Disse resultater indikerer, at ANT2 er et bindingsprotein af apigenin der inducerer DR5 ekspression.

A, Fiksering af apigenin og genistein på magnetiske FG perler. B, blev Apigenin- og genistein proteiner oprenset fra hele celleekstrakter af DU145-celler med hver flavonoid-fast eller ej (-) FG perler og blev analyseret ved sølvfarvning. Bindingsproteinerne blev identificeret ved et massespektrometer.

Knockdown af ANT2 Forbedrer Apo2L /TRAIL-induceret apoptose via opregulering af DR5 på Post-transkriptionel Level

Det er blevet rapporteret, at knockdown af ANT2 forbedrer Apo2L /TRAIL-induceret apoptose via opregulering af DR5 i humane brystcancerceller [19]. Derfor undersøgte vi, om knockdown af ANT2 forbedret Apo2L /TRAIL-induceret apoptose i human prostatacancer DU145 celler. ANT2 siRNA’er kraftigt undertrykt ekspression af ANT2 mRNA (fig. 3A og S4). Som vist i fig. 3B og S5, ANT2 siRNAs tilsyneladende forøget Apo2L /TRAIL-medieret apoptose. Vi undersøgte dernæst, om ANT2 knockdown induceret DR5 ekspression. DR5 ekspression blev induceret ved ANT2 siRNAs i DU145-celler (fig. 3C), hvorimod DR5 mRNA ikke blev induceret (fig. 3D og S6). Tilsammen tyder disse resultater på, at knockdown af ANT2 samt apigenin, øger Apo2L /TRAIL-induceret apoptose ved post-transkriptionelt opregulering DR5.

DU145 celler blev transficeret med to forskellige ANT2 siRNAs (siANT2 # 1 og # 2) eller et ikke-targeting siRNA (siCtrl) og blev inkuberet i 48 timer. A, ANT2 mRNA blev kvantificeret ved real-time RT-PCR og normaliseret ved GAPDH. B, Cellerne blev behandlet med eller uden 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Efter 24 timer blev sub-G1 population af cellerne målt med flowcytometri. C, protein niveauer af DR5 og β-actin blev analyseret ved Western blotting. D, mRNA-niveauer af DR5 blev målt ved real-time RT-PCR og normaliseret ved GAPDH. Kolonner, betyder; barer, SD (n = 3). *

P

0,05, **

P

. 0,01 i forhold til at styre

Knockdown af ANT2 Dæmper Apo2L /TRAIL-induceret apoptose forstærkes af Apigenin

for at belyse den rolle ANT2 i styrkelsen af ​​Apo2L /TRAIL følsomhed ved apigenin, vi undersøgte, om knockdown af ANT2 påvirket denne forbedring som tidligere udføres som til andre målproteiner [26], [27]. Apigenin (20 pmol /l) øget 50 ng /ml Apo2L /TRAIL-medieret apoptose i DU145-celler indføres ved kontrol siRNA, men ikke i DU145-celler blev indført ved ANT2 siRNA (fig. 4A og S7). Silencing af ANT2 sænkede forøgelsen af ​​DR5 udtryk med 20 pmol /L apigenin (fig. 4B). Disse resultater indikerer, at ANT2 inhibering er nødvendig for apigenin kan forbedre DR5 ekspression og Apo2L /TRAIL-induceret apoptose. Salg

DU145 celler blev transficeret med siANT2 # 1 eller siCtrl. Efter 48 timer blev cellerne inkuberet med 20 pmol /L apigenin i 24 timer. A blev cellerne behandlet med eller uden 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Efter 24 timer blev sub-G1 population af cellerne måles ved anvendelse af flowcytometri. Forskellen i sub-G1 befolkninger med og uden Apo2L /TRAIL blev defineret som Apo2L /TRAIL aktivitet. The Apo2L /TRAIL-aktivitet i prøver uden apigenin blev normaliseret til 1. B, blev Protein niveauer af DR5 og β-actin analyseret ved Western blotting. Kolonner, betyder; barer, SD (n = 3). **

P

. 0,01 i forhold til at styre

Vi næste undersøgte rolle ANT2 i en anden cancer cellelinje, hormon-afhængige humane prostatacancer LNCaP. ANT2 mRNA blev effektivt tavs af ANT2 siRNAs (fig. 5A og S8), og knockdown af ANT2 også induceret DR5 ekspression (fig. 5B) og forbedret 50 ng /ml Apo2L /TRAIL-induceret apoptose (fig. 5C og S9). Desuden knockdown af ANT2 svækkede forøgelsen af ​​Apo2L /TRAIL følsomhed og DR5 ekspression ved 20 pmol /L apigenin (Fig. 5D, E og S10).

LNCaP-celler blev transficeret med siANT2 eller siCtrl og var inkuberet i 48 timer. A, ANT2 mRNA blev kvantificeret ved real-time RT-PCR og normaliseret ved GAPDH. B, Protein niveauer af DR5 og β-actin blev analyseret ved Western blotting. C, Cellerne blev inkuberet med eller uden 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Efter 24 timer blev sub-G1 population af cellerne målt med flowcytometri. D, Cellerne blev inkuberet med 20 pmol /L apigenin i 24 timer, efterfulgt af behandling med eller uden 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Den Apo2L /TRAIL aktivitet i prøver uden apigenin blev normaliseret til 1. E, blev cellerne inkuberet med 20 mmol /l apigenin i 24 timer. Proteinniveauer af DR5 og β-actin blev analyseret ved Western blotting. Kolonner, betyder; barer, SD (n = 3). *

P

0,05, **

P

0,01 i forhold til at styre

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi. identificeret ANT2 som et bindingsprotein af apigenin som opreguleret DR5 anvendelse af magnetiske FG perler (fig. 2). Knockdown af ANT2 forbedret Apo2L /TRAIL-induceret apoptose ved opregulering DR5 (fig. 3), svarende til behandling med apigenin (fig. 1). Endvidere knockdown af ANT2 svækkede forøgelsen af ​​DR5 ekspression og Apo2L /TRAIL-induceret apoptose ved apigenin (fig. 4 og 5). Disse resultater antyder, at apigenin binder og hæmmer ANT2, der inducerer DR5 ekspression og potentierer Apo2L /TRAIL følsomhed (fig. 6). Den foreliggende undersøgelse antyder også, at apigenin post-transkriptionelt inducerer DR5 ved at inhibere ANT2 (fig. 1B og C). Vi formoder, at flere agenter, der er blevet rapporteret til at opregulere DR5 på transkriptionsniveauet [10] – [13], kan også fremkalde DR5 udtryk på post-transkriptionel niveau ved at hæmme ANT2

Apigenin binder og hæmmer. ANT2. Hæmning af ANT2 øger Apo2L /TRAIL følsomhed via opregulering af DR5.

Det er blevet rapporteret, at knockdown af ANT2 hæver ROS niveauer [17] og aktiverer JNK og p53 [19], i overensstemmelse med denne apigenin også øger ROS niveauer [25], [28] og aktiverer JNK [29] og p53 [30]. Desuden viste denne undersøgelse, at apigenin bundet til ANT2 og opreguleret DR5 ligner knockdown af ANT2. Disse resultater tyder på, at apigenin funktionelt hæmmer ANT2.

Flere polyfenoler, såsom apigenin, er blevet rapporteret at forbedre Apo2L /TRAIL følsomhed via forskellige veje [25], [31]. Men de detaljerede mekanismer, hvorigennem hver polyphenol øger Apo2L /TRAIL følsomhed fortsat ukendt. Vores metode identificere målene i polyphenoler kan være nyttige til at belyse disse mekanismer.

Vi belyst den mekanisme, gennem hvilken apigenin opreguleret DR5 ved at sammenligne de bindende proteiner af apigenin der opreguleres DR5 og genistein der ikke gjorde (fig. 2) . Strategien, der sammenligner de direkte bindende proteiner af forskellige midler er fordelagtig. For eksempel er det blevet præciseret, at ligander af VDAC proteiner selektivt fremkalde ikke-apoptotisk celledød i tumorceller huser mutationer i onkogener

HRAS

,

KRAS

, eller

BRAF

ved at sammenligne de bindende proteiner af erastin A6 og erastin B2, en erastin analog, som mangler dens aktivitet [32]. Sammenligning af de bindende proteiner af forskellige midler kan afsløre de proteiner, der skaber de største eller skadelige virkninger af disse midler. Desuden kan farmakologisk kontrol over disse bindende proteiner udvikle nuværende kemoterapi.

Til dato, flere agonistiske anti-DR5 antistoffer og human rekombinant Apo2L /TRAIL er blevet udviklet og er under kliniske forsøg, mens nogle kræftformer har udstillet resistens over for disse midler [7]. I den foreliggende undersøgelse knockdown af ANT2 sensibiliserede cancerceller for Apo2L /TRAIL ved opregulering DR5. Denne undersøgelse antyder også, at apigenin kan være en ANT2 inhibitor. Derfor kan apigenin og roman ANT2 hæmmere forstærker effekten af ​​disse midler ved at overvinde modstand mod Apo2L /TRAIL.

Støtte Information

Figur S1.

Den histogrammer for figur 1A som til apigenin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s001

(TIF)

Figur S2.

Den histogrammer for figur 1A som til genistein.

doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s002

(TIF)

Figur S3.

Amplificeringsbetingelserne kurver i figur 1C.

doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s003

(TIF)

Figur S4.

Amplificeringsbetingelserne kurverne i figur 3A.

doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s004

(TIF)

Figur S5.

Histogrammerne i figur 3B.

doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s005

(TIF)

Figur S6.

Amplificeringsbetingelserne kurver figur 3D.

doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s006

(TIF)

Figur S7.

Den histogrammer af figur 4A.

doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s007

(TIF)

Figur S8.

Amplificeringsbetingelserne kurverne i figur 5A.

doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s008

(TIF)

Figur S9.

Histogrammerne i figur 5C.

doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s009

(TIF)

figur S10.

Histogrammerne i figur 5D.

doi:. 10,1371 /journal.pone.0055922.s010

(TIF)

Tak

Vi er taknemmelige for M. Horinaka og Y. Sowa for nyttige drøftelser