PLoS ONE: HDAC-hæmmere Act med 5-aza-2′-deoxycytidin at hæmme Cell Proliferation ved at undertrykke Fjernelse af Incorporated fornedrer i lungekræft Cells

Abstrakt

5-aza-2′-deoxycytidin (5- aza-CdR) anvendes i udstrakt grad som et demethyleringsmiddel og virker i forening med histondeacetylaseinhibitorer (HDACi) for at inducere apoptose eller inhibering af celleproliferation i humane cancerceller. Hvorvidt virkningen af ​​5-aza-CdR i denne synergistiske effekt resultater fra demethylering af denne agent er endnu ikke klart. I denne undersøgelse fandt vi, at hæmning af celleproliferation ikke blev observeret, når celler med knockdown af DNA methyltransferase en (DNMT1), eller dobbelt knock ned af DNMT1-DNMT3A eller DNMT1-DNMT3B blev behandlet med HDACi, hvilket indebærer, at demethyleringsmiddel funktion 5- aza-CdR kan ikke involveret i denne synergieffekt. Yderligere undersøgelse viste, at der var en årsagssammenhæng mellem 5-aza-CdR inducerede DNA-skader, og mængden af ​​[

3H] -5-aza-CdR inkorporeret i DNA. Men inkorporeret [

3H] -5-aza-CdR faldt, efterhånden når celler blev inkuberet i [

3H] -5-aza-CdR frit medium, hvilket indikerer, at 5-aza-CdR, hvilket er en unormal udgangspunkt , kan udelukkes af cellen reparation system. Var det af interesse at HDACi signifikant udskudt fjernelsen af ​​det inkorporerede [

3H] -5-aza-CdR fra DNA. Desuden viste HDAC-hæmmer selektiv synergi med nukleosid analog-induceret DNA-skader til at hæmme celledeling, men viste ingen sådan virkning med andre DNA skader belastninger såsom γ-ray og UV, etoposid eller cisplatin. Denne undersøgelse viser, at HDACi synergistisk hæmmer celledeling med nukleosidanaloger ved at undertrykke fjernelse af inkorporerede skadelige nukleotidanaloger fra DNA

Henvisning:. Chai G, Li L, Zhou W, Wu L, Zhao Y, Wang D, et al. (2008) HDAC-hæmmere Act med 5-aza-2′-deoxycytidin at hæmme Cell Proliferation ved at undertrykke Fjernelse af Incorporated fornedrer i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 3 (6): e2445. doi: 10,1371 /journal.pone.0002445

Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Kina

Modtaget: 15. marts 2008; Accepteret: 12. maj 2008; Udgivet: 18 Jun 2008

Copyright: © 2008 Chai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er støttet af National Natural Science Foundation of China (No.30425017, 30.670.417 og 30.621.002), og tilskud (2005CB522403, 2006AA02Z101, 2006CB910300 og B07001) fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina

Konkurrerende interesser:. det forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Det er velkendt, at DNA-methylering er forbundet med histonacetylering status i regulering af genekspression [1] – [4]. eller celledeling og aldring [5]. Denne kobling mellem histon status og DNA-methylering var godt bekræftet af Cameron

et al

der fandt, at flere gener tavshed ved methylering blev reaktiveret, når de behandles med demethyleringsmiddel 5-aza-CdR og histondeacetylaseinhibitoren (HDACi) trichostatin A (TSA) sammen, men blev ikke reaktiveres i nærvær af 5-aza-CdR eller TSA alene [6]. Senere, flere laboratorier, herunder vores egen udvidet disse resultater til at oprette en terapeutisk strategi til kræftbehandling, hvor 5-aza-CdR fungerer sammen med depsipeptid /TSA at inducere signifikant apoptotisk celledød [7] – [10]. Da DNA-methylering i promotorregionen er forbundet med HDAC1 af en methyl-bindende protein MeCP2 [11], er troværdigt, at visse gener, hvis hypermethyleret i deres promotorområde, er mere tæt pakket af histoner og dermed transkriptionsfaktorer adgang til deres DNA-bindende steder kun med større vanskeligheder. Derfor kunne celledød gener, som er bragt til tavshed på grund af hypermethylering, genaktiveres ved behandling med 5-aza-CdR; denne reaktivering bør styrkes ved HDACi, og på samme tid, bør celledød være lettere observeres som godt.

Men 5-aza-CdR spiller også en antineoplastisk rolle, som er methylering-uafhængig [ ,,,0],12] – [14]. 5-aza-CdR kan virke direkte på mitokondrier og inducere apoptose i mammale celler [14]. En direkte methylering uafhængigt bevis for 5-aza-CdR induceret celledød er, at 5-aza-CdR signifikant forøger ekspression af Apaf-1 eller p19

INK4d at inducere celledød, men de promotorområder af disse gener er fuldstændig methylerede [12], [13]. 5-aza-CdR er også rapporteret at inducere et synergistisk virkning ved forøgelse af cisplatin bundet til DNA, via en ændring i topologien af ​​DNA som følge af 5-aza-CdR uden dens funktion som et demethyleringsmiddel [15]. Disse data antyder, at 5-aza-CdR spiller forskellige roller i celler, som omfatter både demethyleringsmiddel funktioner og methylering uafhængige funktioner.

Cytotoksiciteten af ​​5-aza-CdR resultater fra dets evne til at skade DNA som 5-aza -CdR er en nukleosidanalog (NA) og kan inkorporeres i DNA-rygraden [16], [17], hvilket igen kan inducere dannelsen af ​​en kovalent addukt mellem 5-aza-CdR molekyle og methyltranferases [16]. Det er blevet påvist, at NA såsom 5-aza-CdR eller cytarabin (Ara-C), phosphoryleres i deres triphosphatform og derpå inkorporeres i DNA under replikation [18]. Efterfølgende den inkorporerede NA tjene som abase som kan inducere DNA-skade, mutationer og stop af det DNA replikation gaffel [19], [20]. Disse ændringer i DNA-rygraden er skadelige, og DNA skader sensorer såsom DNA-PK, p53, ATM og ATR genkende disse beskadigede steder og reparere den unormale DNA [21], [22]. Tidligere både vores gruppe og andre forskere direkte bekræftet, at 5-aza-CdR inducerer DNA-ødelæggelse og fremkalder p53-afhængige biologiske reaktioner [23] – [25]. Men hvis de unormale DNA forandringer som følge af indarbejdelse af nationale kontorer er overvældet, eller DNA reparations systemer er alvorligt hæmmet, vil cellerne undergår apoptose [26].

HDAC-hæmmere er nye og effektive midler mod cancer [27 ], [28], som er involveret i regulering mange gener, herunder aktivering af p53 [29], eller nedregulering anti-apoptotiske gener [28], [30] for at udøve en anti-neoplastisk effekt. Derfor undersøgelse af, hvorvidt HDACi påvirker også DNA reparation enzymer til at forbedre NA-induceret DNA-skader kaldes for.

I denne undersøgelse bekræfter vi, at 5-aza-CdR handler i koncert med HDACi at fremkalde en signifikant inhibering af celleproliferation i en methylering uafhængig måde. 5-aza-CdR blev inkorporeret i DNA i en dosis og tid afhængig måde, der klart var forbundet med induktion af DNA enkeltstrengede brud (SSB) med 5-aza-CdR. HDAC-hæmmere betydeligt undertrykt fjernelse af indbygget 5-aza-CdR fra DNA og dermed produceret en synergistisk virkning der resulterer i hæmning af celledeling

Materialer og metoder

Cell kultur og kemisk behandling

human lunge cancercellelinjer A549 og H719 blev anvendt i denne undersøgelse. Både 5-aza-CdR (opløst i 50% eddikesyre) og Ara-C (opløst i DMSO) (begge fra Sigma, St. Louis, MO) blev tilsat frisk i mediet hver 24 timer. TSA (Sigma) blev opløst i ethanol. Depsipeptid (venligst tilvejebragt af NIH) blev opløst i DMSO.

Bestemmelse af celleproliferation ved MTT-assay

Lige antal af celler (ca. 5000 /brønd) blev podet i en 96-brønds plade 24 timer forud for eksperimenteren. Celler blev behandlet med 5-aza-CdR, Ara-C, γ-bestråling og HDACi alene eller i kombination. Efter behandling blev MTT farveopløsning (Sigma) tilsat til 96-brønds plade. Den korrigerede absorbans af hver prøve blev beregnet ved sammenligning med den ubehandlede kontrol.

RT-PCR

For at afgøre, om knockdown af DNA methyltransferaser (DNMTs) er effektiv i DNA demethylere og reaktivere tavshed gener, RT-PCR blev udført for at påvise ændringer i ekspression af p21, der er tavshed på grund af en hypermethylering i

p21

promotor [31]. PCR primere var som følger: p21, venstre primer- GGA AGA CCA TGT GGA FTT GT og højre primer- GGA TTA GGG CTT FTT CTT GG;

β

actin, venstre primer- TGG AGA AGA GCT ACG AGC TGC CTG og højre primer- GTG CCG CCA GAC AGC ACT GTG TTG.

Western Blot

For at identificere ændringer i proteinekspression i celler behandlet med knockdown af DNMTs eller 5-aza-CdR blev celler høstet med en skraber og derefter vasket en gang med kold phosphatpufret saltopløsning. Cellerne blev derefter lyseret i lysebuffer (50 mM Tris-HCI, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 0,15% Igepal CA-630, og 1,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid). Lige store mængder proteiner (100-150 ug) blev størrelsesfraktioneret på 7,5-12,5% SDS-PAGE. Desuden at bestemme mængden af ​​kromatin-bundne RPA blev celler lyseret i opløsning A (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,34 M saccharose, 10% glycerol, 1 mM Na

3VO

4 og protease inhibitor cocktail). Til opnåelse kerneekstrakter blev celler lyseret i puffer B (10 mM HEPES, pH 7,9, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 0,34 M saccharose, 10% glycerol, 0,1% Triton X-100, protease inhibitor cocktail) . Isolerede kerner blev vasket en gang med buffer B og yderligere lyseret i puffer A som ovenfor. Til opnåelse kromatin-bundne proteiner, blev isolerede kerner lyseret i puffer C (3 mM EDTA, 0,2 mM EGTA, 1 mM DTT) og yderligere lyseret i puffer A som ovenfor.

anvendte antistoffer var anti-PARP ( Santa Cruz, F-2), anti-RPA (Santa Cruz, MA34 og MA70-2), anti-γ-H2AX (Upstate, 05-636), anti-DNMT1 (Santa Cruz, H-300), anti-DNMT3A (Santa Cruz, P-16), anti-DNMT3B (en gave fra Dr. Xu, G, Shanghai Institute of Biological Science) og β-actin-antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz.

DNA bisulfitbehandling og bisulfit sekventering

for at evaluere ændringer i DNA-status for methylering efter behandling med knockdown af DNMTs blev DNA behandlet med natriumbisulfit og renset for PCR som tidligere beskrevet [31]. Primerne til sekventering af

p21

promotoren var som følger: venstre primer, 5′-GGG AGG AGG GAA GTG TTT TT-3 ‘og højre primer, 5′-ACA ACT ACT CAC ACC TCA ACT-3’ . PCR-produkterne blev gel ekstraheret (Qiagen, Valencia, CA) og ligeret ind i en pGEM-T-easy-vektor, ved anvendelse af TA kloning systemet (Promega, Madison, WI). Transformerede bakterier DH5a blev dyrket natten over, og plasmid DNA blev isoleret ved anvendelse af et kit (Qiagen). Mindst 10 separate kloner blev udvalgt til sekvensanalyse.

Comet assay

comet assay blev udført som tidligere beskrevet [24]. Kort fortalt blev frosted mikroskopiske objektglas dækket med 0,5% normalt smeltende agarose ved 60 ° C. Omkring 10

5 5-aza-CdR behandlede eller ubehandlede celler i PBS blev blandet med en lige mængde på 1% lavtsmeltende agarose til dannelse af en cellesuspension. Efter elektroforese blev slides undersøgt ved 600 × forstørrelse og billeder blev taget med et fluorescens mikroskop (TCS, Leica, Manheim, Tyskland).

Analyse af udelukkelse af inkorporeret [

3H] -5-aza CdR fra DNA

Det radioaktivt mærkede nucleosidanalog inkorporering assay blev udført som tidligere beskrevet med modifikationer [32]. [

3H] -5-aza-CdR blev indkøbt fra Moravek Biochemicals (MT1676, 1 mCi /ml, Brea, CA). H719 og A549-celler blev behandlet med [

3H] -5-aza-CdR ved 1 uM i 48 timer med eller uden depsipeptid 0.1 uM for de sidste 6 timer (fra 42 til 48 timer), og cellerne blev derefter vasket med kold PBS. Cellerne blev derefter erstattet i [

3H] -5-aza-CdR frit medium og inkuberet i 6, 12 eller 24 timer. Kold trichloreddikesyre (TCA, 50%) blev derefter tilsat til cellen opløsning, og TCA-uopløseligt DNA blev placeret på et glas mikrofiber filter (Whatman, Maidstone, England). Dette glasfilter med TCA-uopløseligt DNA blev anbragt i et hætteglas til at tælle radioaktivitet med en Beckman LS 5000 væskescintillationstæller.

Etablering af cellelinien med en stabil DNMT1-deficient klon

pCMVneo -DNMT1 antisense plasmid blev venligst stillet til rådighed af Dr. SB Baylin [33]. Vektoren blev transficeret i H719 celler under anvendelse af Qiagen Effectene Transfection kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Fireogtyve timer efter den første transfektion blev en anden transfektion udført for at forbedre virkningen af ​​RNAi, og derefter 800 ug /ml G418 blev tilsat for at vælge stabile celler med DNMT1 antisense.

RNA forstyrrer DNMT3A , DNMT3B

RNAi målrettet oligonucleotidsekvenser er som følger: CAT CCA CTG TGA ATG ATA ATT (DNMT3A) og GAT CAA GCT CGC GAC TCT C (DNMT3B) (købt fra Shanghai GeneChem Company). Oligonukleotiderne til DNMT3A og DNMT3B siRNA blev transficeret ind i celler ved anvendelse af Lipofectamine 2000 for 48 timer.

Resultater Salg

5-aza-2′-deoxycytidin samvirker med HDACi at inducere inhibering af celleproliferation med en methylering uafhængig mekanisme

Det er blevet rapporteret, at 5-aza-CdR virker sammen med HDAC-inhibitorer til synergistisk at inducere celledød eller hæmning af celleproliferation [7] – [10]. For at undersøge om den rolle, som 5-aza-CdR involveret i denne synergistiske inhibering af celleproliferation, når det kombineres med HDACi er epigenetiske, to dobbelt knock down (DKD) kloner (DKD af DNMT1 /DNMT3A og DKD af DNMT1 /DNMT3B) blev etableret. For at undgå at inducere en forskel i effektiviteten af ​​transfektion, når celler blev transficeret med to vektorer eller to RNAi oligonukleotider, blev en DNMT1 mangelfuld stabil klon først etableret ved transfektion af en vektor med antisense DNMT1 cDNA i H719 celler og selekteres med G418. Som vist i fig. 1A, er DNMT1 protein godt slået ned i denne stabile H719 cellelinje. Derefter DKD af DNMT1 /DNMT3A eller DNMT1 /DNMT3B blev udført af transfektion af DNMT3A eller DNMT3B RNA oligonukleotider i DNMT1 knockdown stabile celler. Figur 1B-C viser klart, at DNMT3A og DNMT3B protein niveauer blev signifikant reduceret med disse RNAi behandlinger. For at vurdere, om disse DKDS af DNMTs var effektive til demethyleringsmiddel DNA, status methylering af

p21

WAF1 /Cip1

promotor blev valgt til test med bisulfit sekventering, fordi

p21

WAF1 /CIP1

promotor er stærkt methyleres i H719 celler [31]. Fig. 1D viser et skematisk diagram, der viser promotorregionen af ​​

p21

WAF1 /Cip1

og udpeget til bisulfit sekventering fragment. Som vist i fig. 1E,

p21

WAF1 /Cip1

promotor i H719 celler var stærkt methylerede (51,25% af CGs i

p21

WAF1 /Cip1

promotor blev methyleret i 10 udvalgte kloner ). Imidlertid blev denatureret CGs faldet til 23,75%, 21,5% og 12,5%, når DNMT1, DNMT1 /DNMT3A og DNMT1 /DNMT3B blev udsat for fordoble banke ned med 10 udvalgte kloner (fig. 1E), hvilket indikerer, at knockdown af DNMT1 og DNMT3B sammen var den mest effektive for DNA demethylering. Dette fald i methylering af

p21

WAF1 /Cip1

promotor blev klart forbundet med udtryk for p21 som målt med RT-PCR (fig. 1 F).

(A) Repræsentant vestlige blottet viser at DNMT1 proteinniveauet i H719-celler blev signifikant reduceret i DNMT1-deficiente stabil klon sammenlignet med den ikke-specifikke oligonukleotid behandlet kontrol. (B) og (C) Repræsentative Western blots viser også, at DNMT3A eller DNMT3B proteinniveauet var faldt betydeligt efter RNAi behandling i DKD af DNMT1 /DNMT3A celler eller DKD af DNMT1 /DNMT3B celler. β-actin er vist som en loading kontrol i det nederste panel. (D) En skematisk diagram, der viser

p21

WAF1 /Cip1

promotor, med den sorte region angiver fragment, der undergik bisulfit sekventering (-233 til +2 forhold til transkriptionsstartstedet). (E) Med bisulfit sekventering blev 10 kloner tilfældigt udvalgt og status methylering af

p21

WAF1 /Cip1

promotor blev bestemt i ubehandlede H719 celler eller i de H719 celler behandlet med knockdown af DNMT1, DKD af DNMT1 /DNMT3A eller DKD af DNMT1 /DNMT3B. (F) RNA blev ekstraheret fra H719-celler behandlet med DKD af DNMT1 /DNMT3B, og RT-PCR blev udført for at detektere ekspression af p21 mRNA. β-actin er vist som en belastning kontrol for RT-PCR-analyse.

En uventet fund var, at vi ikke observere en forskel i celleproliferation, når H719 celler med DKDS eller TKDs (knockdown af DNMT1 /3A /3B) blev behandlet med eller uden depsipeptid og analyseret med MTT (fig. 2A). I modsætning hertil blev celleproliferation signifikant reduceret i begge A549 og H719 celler, som blev behandlet med 5-aza-CdR og HDACi depsipeptid /TSA, skønt 5-aza-CdR alene og depsipeptid alene /TSA havde lille indvirkning på inhibering af celleproliferation på de anvendte doser (fig. 2B-C). Men 5-aza-CdR-induceret inhibering af celleproliferation var cellelinje afhængig. For eksempel viste 5-aza-CdR en indlysende virkning til inhibering af proliferation af A549-celler (fig. 2C), men havde ingen effekt i H719 celler (Fig. 2B). Disse forskelle i 5-aza-CdR-induceret virkning på celleproliferation mellem A549 og H719 celler resulterede fra p53 status for de behandlede celler [24]. A549-celler har en vildtype p53, mens H719 celle p53 er muteret [31]. Endvidere selvom procain er blevet rapporteret at være en demethyleringsmiddel [34], synergistisk inhibering af celleproliferation blev ikke observeret, når H719 celler blev behandlet med procain (0,5 mM i 72 timer) og depsipeptid (0,1 uM i 6 timer ved 66- 72 timer) eller TSA (1 uM i 6 timer ved 66-72 timer) (fig. 2D). Disse data tyder på, at rollen af ​​5-aza-CdR i sin synergistisk virkning med HDACi til at inducere inhibering af celleproliferation ikke kan skyldes dens demethyleringsmiddel funktion.

(A) H719 celler med mangelfuld DNMT1, DKD af DNMT1 /DNMT3A, DKD af DNMT1 /DNMT3B eller TKD (tredobbelt knockdown) i DNMT1 /DNMT3A /DNMT3B blev behandlet med eller uden depsipeptid på 0,1 uM i 6 timer, og celledeling blev testet med MTT-analysen. (B) og (C) 5-aza-CdR (1 uM i 72 timer) samvirker med HDAC inhibitor depsipeptid (0,1 uM for de sidste 6 timer) eller TSA (1 uM for de sidste 6 timer) til synergistisk at inducere inhibering af celle proliferation i H719 (B) eller A549-celler (C). (D) H719-celler blev behandlet med procain (0,5 mM) i 72 timer, og depsipeptid (0,1 uM for de sidste 6 timer) eller TSA (1 uM for de sidste 6 timer) blev derefter tilsat til de behandlede celler. Alle data er resultaterne af to separate forsøg.

5-aza-CdR inducerer cytotoksicitet ved inkorporering i DNA som en nukleosidanalog

Det er velkendt, at 5-aza-CdR phosphoryleres til sin triphosphatform i celler og derefter inkorporeres i DNA under replikation [18]. For at undersøge graden af ​​5-aza-CdR inkorporering i celler, [

3H] -5-aza-CdR blev sat til A549 eller H719 celler i 24 timer, og DNA blev derefter ekstraheret med TCA-præcipitation. Radioaktivitet pr ug DNA blev målt. Som vist i fig. 3A-B, inkorporering af [

3H] -5-aza-CdR i DNA var koncentrationsafhængig i begge cellelinier. Inkorporeret radioaktivitet pr ug DNA ved 0,1 pM og 1 uM [

3H] -5-aza-CdR øget ~2- og ~12 gange i henholdsvis H719 celler og ~10- og ~110 gange henholdsvis A549 celler sammenlignet med radioaktiviteten af ​​0,01 uM [

3H] -5-aza-CdR i begge cellelinier.

(A) H719 eller (B) A549-celler blev inkuberet med [

3H ] -5-aza-CdR i 24 timer ved forskellige koncentrationer og derefter vasket med kold PBS. Cellerne blev inkuberet i frisk medium i yderligere 24 timer, og DNA blev derefter præcipiteret med kold TCA. Radioaktivitet blev målt og relativ radioaktivitet pr ug blev talt. Samme mængde DNA blev påsat og kørt ved 1% agarose gel ved 100 V i 5 min som ladningskontrol, som er vist på øverste panel i fig. 3A og fig. 3B henholdsvis. Resultaterne præsenteret er fra to separate forsøg (middelværdi ± SD) DNA beskadigelse induceret af 5-aza-CdR i H719-celler blev bestemt ved comet assay. (C) ubehandlet kontrol (D) 5-aza-CdR 0.1 uM i 72 timer og (E) 5-aza-CdR ved 1 uM i 72 timer.

Der var en sammenhæng mellem inkorporeret 5-aza-CdR og DNA-skader som bestemt med comet assay. Figur 3C-E viser, at 5-aza-CdR udviste en dosisafhængig kapacitet for DNA-skader i A549-celler, hvilket blev påvist ved tilstedeværelsen af ​​en DNA-hale. Større DNA hale område og længere DNA hale længde repræsenterer større DNA-beskadigelse. Tabel 1 viser en statistisk analyse af comet assay sammenligner 5-aza-CdR behandlede prøver med en ubehandlet kontrol. Disse data paralleller indarbejdet beløb på 5-aza-CdR, og indebærer, at 5-aza-CdR spiller en rolle i cytotoksicitet ved inkorporering i DNA.

Som apoptose kan også give et positivt resultat i comet assay [35], vi høstede 5-aza-CdR behandlede celler og udførte flowcytometri analyse for at fastslå, om 5-aza-CdR-induceret DNA-beskadigelse fremkalder apoptotisk celledød. Cellerne med DNA-indhold mindre end den for G

0 /G

1 (region M1 i figur 4), anses for at være apoptotiske celler. Som vist i fig. 4, 5-aza-CdR ikke inducere apoptose i A549-celler ved 0,1 uM (fig. 4B) eller 1 uM i 72 timer (Fig. 4C). Desuden blev A549-celler behandlet med 5-aza-CdR ved 1 uM i 48 timer eller 72 hrsand protein blev ekstraheret i Western blotting under anvendelse af anti-PARP (spaltning af PARP er et kendetegn for apoptose). Fig. 4D viser, at 5-aza-CdR ikke inducerede apoptotisk celledød ved begrænsede doser. Disse data indikerer, at 5-aza-CdR alene ved begrænsede doser ikke er i stand til at inducere apoptose og dermed det positive resultat i komet analyseresultaterne hovedsagelig fra 5-aza-CdR induceret DNA-ødelæggelse.

(A-C ) for at bestemme om 5-aza-CdR-induceret DNA-beskadigelse inducerer inhibering af celleproliferation via apoptotisk celledød, blev en flowcytometri analyse udført. Ubehandlede A549-celler (A) eller A549-celler blev behandlet med 5-aza-CdR 0.1 uM (B) eller ved 1 uM i 72 timer (C), og cellerne blev derefter høstet til farvning med propidiumiodid (PI). DNA-indhold med mindre end G

0 /G

1 blev betragtet som apoptotisk DNA (område M1). (D) A549-celler blev behandlet med 5-aza-CdR ved 1 uM i 48 eller 72 timer, og protein blev ekstraheret i Western blotting under anvendelse af anti-PARP at detektere PARP-spaltning i celler behandlet med 5-aza-CdR. En apoptotiske positiv kontrol blev vist på banen af ​​den yderste højrefløj, hvor der er to bands der angiver PARP (116 KD) og PARP cleavaged (85 KD).

Generelt DNA skadelige stoffer inducerer DNA enkeltstrengede pauser (SSB) eller dobbelte-streng pauser (DSB). At afgøre, hvilken type DNA-beskadigelse induceres af 5-aza-CdR udførte vi Western blotting ved anvendelse af anti-RPA (replikation protein A) eller γ-H2AX. De fleste DNA-beskadigende midler inducerer cellulære responser ved aktivering af ATR (ATM og Rad3-relateret) [36] – [40], og aktiveringen af ​​ATR afhænger i høj grad et mellemliggende molekyle RPA [41], [42]. Chromatin blev ekstraheret fra 5-aza-CdR behandlede H719 celler og kromatin-bundne RPA blev bestemt. Fig. 5A viser, at kromatin-bundne RPA blev forøget som reaktion på øget 5-aza-CdR, hvilket indikerer, at 5-aza-CdR induceret DNA-beskadigelse kan være enkeltstrengede pauser (SSB). På den anden side, er γ-H2AX betragtes som et kendetegn for DNA dobbelt-strenget pauser (DSB) [43], og Western blotting blev derfor udført ved anvendelse af ant-γ-H2AX at udelukke muligheden af ​​5-aza-CdR induceret DSB. Fig. 5B viser, at 5-aza-CdR på 1 μ ikke inducerede DSB. Men 5-aza-CdR ved højere koncentration ( 5 uM) inducerede dosisafhængige DSB (data ikke vist). Disse data viser, at 5-aza-CdR induceret DNA SSB eller DSB er dosis-afhængig. I denne undersøgelse blev 5-aza-CdR næsten altid anvendes ved lavere doser (1 uM) og dermed 5-aza-CdR induceret DNA-beskadigelse er SSB.

(A-B) H719 celler blev behandlet med 5-aza-CdR (0,1-1 uM) i 48 timer, og cellulære ekstrakter herunder kromatin fraktion (A, Chr) og opløselig fraktion (B, Sol) blev isoleret for Western blotting for at detektere ændringer i RPA70 og RPA32. Bandet intensitet ubehandlede prøve blev sat som 1. Den numeriske værdi af hver prøve repræsenterer procentdelen af ​​båndintensitet forhold til den for ubehandlede prøve. (C) H719 celler blev også behandlet med 5-aza-CdR på 1 uM til 24, 48 eller 72 timer, og protein blev derefter ekstraheret til Western blotting under anvendelse af anti-γ-H2AX. Celler blev behandlet med doxorubicin ved 1 uM i 24 timer som en positiv kontrol (længst til højre bane).

depsipeptid specifikt inhiberer fjernelse af inkorporeret 5-aza-CdR og forbedrer nukleosidanalog induceret cytotoksicitet

Fordi DNA beskadigelse induceret af lav dosis af 5-aza-CdR er reversibel, er det særlig vigtigt at forstå, hvordan HDAC inhibitor forbedrer 5-aza-CdR-induceret toksicitet. Hertil kommer, som sekventiel behandling af 5-aza-CdR og HDAC inhibitor er mere effektiv til at inducere celledød [44], blev vi ført til at overveje, om HDACi øger optagelsen af ​​5-aza-CdR i DNA eller formindsker fjernelse af inkorporeret 5- aza-CdR fra DNA, hvilket vil øge 5-aza-CdR-induceret cytotoksicitet. Først depsipeptid (0,1 uM) og [

3H] -5-aza-CdR (1 uM) blev tilsat sammen til A549-celler for en indledende 6 timer, og cellerne blev derefter kontinuerligt dyrket i medium med [

3H] -5-aza-CdR alene i yderligere 42 timer. Radioaktivitet blev talt efter 0-24 timer efter cellerne blev inkuberet i en radioaktivitet-frit medium. Ved at sammenligne prøver behandlet med [

3H] -5-aza-CdR alene til prøver behandlet med [

3H] -5-aza-CdR plus depsipeptid, iagttoges ingen forskel i radioaktivitet, hvilket indikerer, at depsipeptid ikke fremmer inkorporering af [

3H] -5-aza-CdR i DNA (fig. 6A). For at teste om depsipeptid påvirker fjernelse af inkorporeret 5-aza-CdR, et henfald analyse af inkorporeret [

3H] -5-aza-CdR blev udført i A549-celler. Celler blev behandlet med [

3H] -5-aza-CdR ved 1 uM i 48 timer med og uden depsipeptid 0.1 uM for de sidste 6 timer af behandlingen, og cellerne blev derefter vasket og erstattet i frisk medium ( uden eksperimentelle reagenser) til 6, 12 og 24 timer. Figur 6A viser, at indarbejdet [

3H] -5-aza-CdR faldt gradvist under inkubation på [

3H] -5-aza-CdR fri medium. Radioaktivitet pr ug DNA ved 6, 12 og 24 timer i celler behandlet med [

3H] -5-aza-CdR alene, for eksempel blev reduceret til 78,44 ± 7,08%, 57,5 ​​± 3,88% og 36.05 ± 1,79% henholdsvis sammenlignet med radioaktiviteten i begyndelsen af ​​inkubation. Dette afspejler fjernelse af [

3H] -5-aza-CdR fra DNA. Tilsætning af depsipeptid signifikant udskudt fjernelse af [

3H] -5-aza-CdR fra DNA, og radioaktivitet pr ug DNA ved 6, 12 og 24 timer var 80,3 ± 13,21%, 78,71 ± 12,72% og 82,5 ± 20,47%, sammenlignet med radioaktiviteten i begyndelsen af ​​inkubation. Denne depsipeptid inducerede formindskelse i fjernelse af [

3H] -5-aza-CdR var også afhængig af depsipeptid koncentration. For eksempel radioaktiviteten af ​​celler behandlet med [

3H] -5-aza-CdR og depsipeptid på 0,05 uM, 0,1 pM og 0,2 pM viste 1.8-, 2.7- og 3,25 fold stigninger henholdsvis mere end den for celler behandlet med [

3H] -5-aza-CdR alene (fig. 6B). Desuden 5-aza-CdR induceret DNA-skader også gradvist genvindes, når celler blev dyrket i en 5-aza-CdR frit medium. Længden og område af DNA halen induceret af 5-aza-CdR var kortere og mindre, når cellerne blev dyrket i 5-aza-CdR frit medium i 12 timer sammenlignet med celler uden stoffri inkubation (Fig. 6C-E ). Denne proces med genvinding fra 5-aza-CdR inducerede DNA-skader blev signifikant undertrykt af depsipeptid, så længde og areal af halerne i kometen assay var længere og større, når celler blev behandlet med 5-aza-CdR og depsipeptid sammen ( fig. 6F-H). Den depsipeptid-induceret suppression af restitution fra 5-aza-CdR induceret DNA-beskadigelse er opsummeret i tabel 2. Disse data antyder, at HDAC-inhibitor kan undertrykke restitution fra 5-aza-CdR induceret DNA-beskadigelse og synergistisk inducerer inhibering af celleproliferation.

(A) H719-celler blev inkuberet med [

3H] -5-aza-CdR i 48 timer, med nærvær eller fravær af depsipeptid 0.1 uM for de første 6 timer (depsipeptid + [

3H] -5-aza-CdR) eller sidste 6 timer ([

3H] -5-aza-CdR + depsipeptid) og derefter vasket med kold PBS. Cellerne blev udskiftet i frisk medium til yderligere inkubation i forskellige intervaller, og DNA’et blev derefter ekstraheret med kold TCA. Relativ radioaktivitet af hver prøve til forskellige tidspunkter blev sammenlignet med radioaktiviteten af ​​cellerne ved begyndelsen af ​​inkubationen. (B) H719-celler blev behandlet med [

3H] -5-aza-CdR i 48 timer, og depsipeptid på 0,05, 0,1 og 0,2 um blev derefter sat til cellerne i de sidste 6 timer. Ved 24 timer efter inkubation blev cellerne høstet og radioaktivitet blev talt. Samme mængde DNA blev påsat og kørt ved 1% agarose gel ved 100 V i 5 min som ladningskontrol, som er vist på øverste panel i fig. 6A og fig. 6B henholdsvis. (C-E) Comet assay viser, at 5-aza-CdR induceret DNA-skader udvundet, når de behandlede celler blev inkuberet i 5-aza-CdR frit medium i 12 timer. (C) ubehandlet kontrol (D) 5-aza-CdR ved 1 uM i 24 timer uden inkubation og (E) 5-aza-CdR ved 1 uM i 24 timer, efterfulgt af vask for yderligere inkubation i en stoffri medium i 12 timer. (F-H) Inddrivelse af DNA-skader fremkaldt af 5-aza-CdR blev hæmmet af depsipeptid behandling (0,1 uM for de sidste 6 timer). (F) depsipeptid behandlede celler (0,1 uM) i 6 timer, (G) Celler blev behandlet med 5-aza-CdR (1 uM i 24 timer) og depsipeptid (0,1 uM for sidste 6 timer) uden inkubering, eller (H) Celler behandlet som ovenfor og yderligere inkuberet i en stoffri medium i 12 timer.

HDAC-hæmmer handlet selektivt med nukleotid analog til at fremkalde hæmning af celledeling

for at bestemme hvorvidt HDACi selektivt øger NA-induceret cytotoksicitet, blev H719-celler behandlet med Ara-C, en anden cytidinanalog, og depsipeptid eller TSA blev derefter tilsat til cellerne for at observere ændringer i celleproliferation analyseret med MTT. Var det af interesse at både depsipeptid og TSA væsentligt forbedret Ara-C-induceret inhibering af celleproliferation (Fig. 7A-B). Imidlertid var dette synergistiske inhibering af celleproliferation ikke observeret i cellerne behandlet med depsipeptid og andet DNA damage induktorer som γ-ray (fig. 7C), UV (fig. 7D), cisplatin (fig. 7E) eller etoposid (Fig . 7F). Disse data antyder, at HDACi selektivt virker sammen med NA’erne at inducere inhibering af celleproliferation.

(A) H719 celler eller (B) A549-celler blev behandlet med Ara-C ved 0,1 uM i 72 timer i nærvær eller fravær af HDACi (depsipeptid 0,1 uM eller TSA 2 pM for de sidste 6 timer). Cellerne blev derefter vasket og inkuberet yderligere i 24 timer for MTT-assayet. (C) Effekt af interaktion af HDACi og bestråling ved 2 Gy blev bestemt med MTT-assayet. H719-celler blev bestrålet ved 2 Gy, eller behandlet med depsipeptid ved 0,1 uM, eller TSA ved 2 uM i 6 timer alene eller i kombination.