PLoS ONE: Niveauet af Ets-1 protein reguleres af Poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) i kræftceller til at forebygge DNA Damage

Abstrakte

Ets-1 er en transskription faktor, der regulerer mange gener involveret i kræft progression og i tumor invasion. Det er en dårlig prognostisk markør for bryst-, lunge-, tyktarms- og æggestok karcinomer. Her har vi identificeret poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) som en ny interaktion partner i Ets-1. Vi viser, at Ets-1 aktiverer, ved direkte interaktion, den katalytiske aktivitet af PARP-1 og derefter poly (ADP-ribosyl) i en DNA-uafhængig måde ated. Den katalytiske inhibering af PARP-1 forstærkede Ets-1 transkriptionel aktivitet og forårsagede sin massive ophobning i cellekerner. Ets-1 ekspression blev korreleret med en stigning i DNA-skader, når PARP-1 var inhiberet, hvilket fører til celledød. Endvidere PARP-1-inhibitorer forårsagede kun Ets-1-udtrykkende celler til at akkumulere DNA-beskadigelse. Disse resultater giver ny indsigt i Ets-1 regulering i kræftceller og dens forbindelse med DNA reparation proteiner. Desuden er vores fund antyder, at PARP-1-inhibitorer er nyttige til en ny terapeutisk strategi, der specifikt målrettes Ets-1-udtrykkende tumorer

Henvisning:. Legrand AJ, Choul-Li S, Spriet C, Idziorek T, Vicogne D, Drobecq H, et al. (2013) Niveauet af Ets-1 protein reguleres af Poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) i kræftceller til at forebygge DNA Damage. PLoS ONE 8 (2): e55883. doi: 10,1371 /journal.pone.0055883

Redaktør: Rajesh Mohanraj, UAE University, De Forenede Arabiske Emirater

Modtaget: September 25, 2012; Accepteret: 3 Januar 2013; Publiceret: 6 Feb 2013

Copyright: © 2013 Legrand et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) og ved tilskud fra la Ligue contre le Cancer, Comité du Pas-de-Calais. Den Ministère de la Recherche et de l’Enseignement Supérieur og Fondation ARC pour la Recherche sur le cancer forudsat en ph.d.-stipendium til Arnaud J. Legrand. Den CNRS og Conseil Régional du Nord-Pas-de-Calais forudsat en ph.d.-stipendium (BDI) til Souhaila Choul-li. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ets-1 er den stiftende medlem af familien af ​​transkriptionsfaktorer kaldet ETS. Denne familie er karakteriseret ved et velbevaret DNA-bindende domæne (DBD)

5, der genkender specifikke DNA-elementer, kaldet ETS-bindingssteder (EBS), fundet i promotorerne for målgener. Ets-1 er hovedsageligt udtrykkes i embryonale væv. Det er involveret i fysiologiske processer, såsom proliferation, differentiering, migration, invasion og apoptose [1] – [6]. Ets-1-ekspression reguleres stramt i voksne væv, og dets overekspression er ofte forbundet med invasive sygdomme, såsom rheumatoid arthritis, glomerulonephritis og mange cancere [7] – [9]. Den patologiske udtryk for Ets-1 er delvis ansvarlig for spredning og invasion evner tumorceller. Denne invasionsevne skyldes gener, som styres af Ets-1 og som koder proteaser, herunder matrixmetalloproteaser collagenase-1 og stromelysin-1, eller urokinase-plasminogenaktivator (uPA). Derfor er Ets-1 øjeblikket betragtes som en markør for dårlig prognose i flere kræftformer [10] – [13].

Endvidere, trods det faktum, at alle ETS familiemedlemmer har samme DBD, Ets-1 har egne DNA-bindende egenskaber, der er tæt kontrolleret for at sikre en bestemt biologisk virkning. Ets-1 inhiberer sin egen DNA-binding på grund af tilstedeværelsen af ​​to inhibitoriske domæner der flankerer dens DBD [14]. Ets-1 skal interagere med partnere for at modvirke denne auto-hæmning og binder til initiativtagerne til sine målgener [15]. I nogle promotorer, såsom dem der findes i

MMP3

(stromelysin-1) og

TP53

gener, to Ets-1-molekyler binder til to palindrome EBS adskilt af 4 bp [16] – [18]. I alle tilfælde, protein-protein interaktioner synes at være hjørnestenen i Ets-1 regulering.

Desuden Ets-1 er også tæt kontrolleret af post-translationelle modifikationer, herunder phosphorylering, SUMOylation og ubiquitinering [7], [19]. Dog Ets-1 har de samme signalveje med mange transkriptionsfaktorer. Således er udfordringen at identificere de særlige kendetegn ved de veje, der styrer aktiviteten af ​​Ets-1 til at bruge dem til terapeutisk målretning.

For at identificere nye veje, vi tidligere renset interaktion partnere Ets-1 ved hjælp af streptavidin pull-down assay. Med denne strategi har vi vist den funktionelle interaktion mellem Ets-1 og den DNA-reparation komplekse DNA-PK [20].

Her identificerede vi poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) som en ny interaktion partner i Ets-1. PARP-1 er en rigelig og allestedsnærværende kerneprotein der katalyserer poly (ADP-ribosyl) ation (PARylation) ved anvendelse NAD + som substrat til at syntetisere forgrenede poly (ADP-ribose) polymerer på målproteiner. PARP-1 spiller forskellige roller i mange molekylære og cellulære processer, herunder DNA-skader detektering og reparation og kromatin ændring [21]. Selvom PARP-1 oprindeligt blev karakteriseret som en DNA-reparation protein, har mange nylige undersøgelser fremhævet sin rolle i transkriptionel regulering. PARP-1 er involveret i reguleringen af ​​transkriptionsfaktorer, såsom NF-KB, AP-2, p53 og mange andre [22] – [24]. Endvidere har PARP-1-inhibering dukket op som en ny terapeutisk strategi til cancer [25]. Interessant PARP-1-inhibering synes at være effektive i cancere, der ofte viser overudtrykte ETS proteiner, herunder ovarie-, prostata- og brystcancere [25]. Tidligere undersøgelser har vist en funktionel sammenhæng mellem PARP-1 og ETS familiemedlemmer, såsom Ese-1, Fli1, Erg og Elk-1 [26] – [28]. Ligeledes kan Ets-1 være et centralt regulator af

parp1

gen ved at styre sin promotor [29]. For ganske nylig, har interesse i dette funktionelle link forhøjet i det omfang, det nu betragtes som en helt ny terapeutisk tilgang i kræft. Nylige rapporter har vist, at ETS fusionsproteiner, der er involveret i mange kræftformer, er narkotika-følsomhed biomarkører for PARP-1 hæmning [26], [30], [31]. Høj udtryk for TMPRSS2: Erg i prostata kræft eller EWS-Fli1 i Ewing sarkom forårsager DNA-skader, der forstærkes af PARP-1 hæmning og følges af en kraftig hæmning af kræft progression. Ikke desto mindre, så vidt vi ved, har der ikke været nogen rapporter om eventuelle funktionelle forbindelser mellem Ets-1-ekspression og dens følsomhed over for PARP-1 hæmmere.

I denne undersøgelse viser vi, at PARP-1 negativt styrer niveau af Ets-1 proteiner i kræftceller via PARylation. Under PARylation inhibering, er Ets-1 transkriptionel aktivitet forbedret som korrelerer med Ets-1-proteiner akkumulering i cellekerner og en stigning i DNA-skade, der fører til celledød. Derfor tyder vore resultater, at hæmning af PARylation kunne være et hidtil ukendt terapeutisk strategi for begrænsning af kræft progression i Ets-1-udtrykkende tumorer

Resultater Salg

PARP-1:. Et hidtil ukendt Ets-1 interaktion partner i cancerceller

For at finde nye Ets-1 partnere, vi gennemført en

in vitro

affinitetsoprensning strategi ved hjælp af en streptavidin pull-down assay. Denne tilgang sikrer storstilet identifikation af partnere ved hjælp af biotinylerede rekombinante Ets-1 immobiliseret på streptavidinkugler at beholde sine bindende proteiner, der findes i kerneekstrakter [20], [32]. Her anvendte vi MDA-MB-231-celler, en invasiv brystcancer cellelinje, til at producere kerneekstrakter; disse celler endogent udtrykker Ets-1 oncoproteinet og dermed tilbyde en passende cellulær kontekst. Efter adskillelse af de bundne proteiner ved SDS-PAGE, blev en meget synlig proteinbånd med en molekylvægt på 113 kDa observeret efter kolloidt farvning (fig. 1A, bane 3, markeret med en stjerne (*)), men fraværende i kontrolbetingelser (fig. 1A, bane 1 og 2). Dette protein blev identificeret ved massespektrometri som PARP-1 enzym (fig. 1B og S1) og har eksklusiv tilstedeværelse i Ets-1-bundne proteiner blev bekræftet ved Western blot (fig. 1C, bane 3). På grund af den stærke affinitet af PARP-1 for nicked DNA blev kerneekstrakter behandlet med DNase I før inkubation for at fjerne alle spor af nucleinsyrer. Denne behandling ikke forstyrrede interaktionen mellem Ets-1 og PARP-1 (fig. 1D, bane 4). Dette blev bekræftet ved massespektrometri (data ikke vist). Vi derefter udført co-immunopræcipitationsforsøg anvendelse af et anti-Ets-1-antistof-agarose konjugat i MDA-MD-231-celler og i en osteosarcomcellelinie, MG63, som også udtrykker Ets-1. Efter adskillelse ved SDS-PAGE og immunoblotting med et anti-PARP-1-antistof, PARP 1 co-udfældet med Ets-1 fra både MDA-MB-231 og MG63-celler (fig. 1E, bane 2). Kontrolforsøg med IgG fra normalt kaninserum undladt at rekruttere PARP-1 (fig. 1E, bane 1). Gensidige co-immunopræcipitationsforsøg blev udført ved anvendelse af et anti-PARP-1-antistof-agarose konjugat i MDA-MD-231 og MG63-celler. Ets-1 co-udfældet fra både MDA-MB-231 og MG63-celler og var fraværende fra kontrolforsøg (fig. 1F). Endvidere immunofluorescens eksperimenter under anvendelse af anti-Ets-1 og anti-PARP-1 antistoffer viste, at begge proteiner co-lokaliseres i MDA-MB-231 celler kerner (fig. S2, bane 4).

(A) kolloidblåt-farvede gel for Ets-1-associerede proteiner fra MDA-MB-231 kerneekstrakter. Biotinyleret Ets-1 proteiner anvendes til pull-down assay blev lastet alene som en kontrol for at identificere de biotinylerede proteiner (pilespidser) og deres potentielle nedbrydningsprodukter (bane 1). Pull-down proteiner detekteret fra kerneekstrakter (NE) inkuberet med ubelastede perler blev anset for at være ikke-specifikke produkter (bane 2). Den kolloide blåfarvede specifik PARP-1-protein trukket ned af biotinyleret Ets-1 er angivet med en asterisk (bane 3). (B) Identifikation af PARP-1 ved MALDI-TOF massespektrometri. (C) Western blot-analyse bekræfter Ets-1-associeret protein som PARP-1. Proteiner trukket ned fra MDA-MB-231 nukleare ekstrakter blev analyseret ved Western blot med kanin-antistoffer rettet mod PARP-1 (H-250). (D) Kolloid blå-farvede gel for Ets-1-associerede proteiner fra MDA-MB-231 kerneekstrakter enten ubehandlede (bane 1 og 2) eller behandlet med DNase I i 40 min (bane 3 og 4) og derefter enten inkuberet med streptavidinperler lastet med biotinyleret Ets-1 protein (pilespidser) (bane 2 og 4) eller med ubelastede perler (bane 1 og 3). Stjerner angiver PARP-1 protein påvist i (A). (E) og (F) Co-immunfældning udført under anvendelse af et kanin-anti-Ets-1 (C-20) eller et kanin-anti-PARP-1 (H-250) antistof-agarose konjugat (bane 2) eller normalt kanin IgG som en kontrol (bane 1) og kerneekstrakter fra MDA-MB-231 celler eller MG-63-celler. Input (bane 3) indeholder 3% af nukleare ekstrakter, der undergik co-immunopræcipitation. PARP-1 og Ets-1 blev analyseret ved Western blot ved hjælp af henholdsvis H-250 og C-4-antistoffer.

Ets-1 direkte interagerer med PARP-1 og er derefter PARylated i en DNA-uafhængig måde

En tidligere undersøgelse viste, at ETS DBD interagerer med PARP-1 [30]; Ikke desto mindre er interaktioner med Ets-1 DBD begrænset af Ets-1 auto-hæmning. Derfor, for at studere interaktionen mellem Ets-1 og PARP-1, anvendte vi to biotinylerede og auto-inhiberet isoformer af Ets-1: fuldlængde form blot kaldet Ets-1 og en dominant negativ isoform følge af alternativ splejsning , Ets-1 p27. Ets-1 p27 blev for nylig opdaget af vores gruppe og mangler threonin-38 (Thr38) rest samt den spidse (PNT) og transaktiveringsassays (TAD) domæner (fig. 2A), som alle er nødvendige for transaktivering af Ets -1 målgener. Men Ets-1 p27 har stadig de samme DNA-bindende egenskaber som Ets-1 [33]. Efter inkubation af biotinylerede Ets-1 isoformer immobiliseret på streptavidinkugler med en rekombinant PARP-1 enzym, PARP-1 specifikt og direkte interagerede med Ets-1-isoformer (Fig. 2B, bane 2 og 3). Således ikke automatisk hæmning af Ets-1 ikke forstyrre direkte interaktion mellem DBD og PARP-1. At undersøge om Ets-1 er posttranslationelt modificeret ved PARP-1-medieret PARylation gennemførte vi-out en

in vitro

PARylation assay. At katalysere PARylation, PARP-1 kræver generelt tilstedeværelsen af ​​nicked DNA, som vist i kontroller med tilsætning af sonikeret dobbeltstrenget DNA (Fig. 2C bane 1 og 2). Når den er aktiveret, PARP-1 katalyserer dens auto-PARylation, hvilket kan visualiseres ved anvendelse af et anti-PAR-antistof (fig. 2C, bane 2). I nærvær af Ets-1, auto-PARylation var stærkere og Ets-1 blev PARylated ved en molekylvægt på ca. 51 kDa svarende til mono (ADP-ribosyl) ation og PARylation med forskellige polymerstørrelser (fig. 2C, bane 4, sort pil). Endvidere i fravær af DNA, ikke kun var PARP-1 stadig aktiveret, men Ets-1 var endnu stærkere PARylated (fig. 2C, bane 5, sort pil). Med Ets-1 p27 isoform, viste resultaterne, at i tilstedeværelse af hakkede DNA blev Ets-1 p27 ikke PARylated (Fig. 2C, bane 7). Alligevel, med intet DNA, Ets-1 p27 aktiverer PARP-1 og er derefter PARylated, set som et bånd ved en molekylvægt på ca. 27 kDa og med forskellige størrelser polymerer ved molekylvægte på mellem 40 og 60 kDa (fig. 2C, bane 8). Således kan den C-terminale ende af Ets-1 aktiverer automatisk PARylation af PARP-1 i en DNA-uafhængig måde ved direkte protein-protein-interaktion og blive PARylated gengæld. For at demonstrere PARylation i humane cancerceller, genereret vi en HeLa-cellelinie, opnået ved retroviral infektion, som stabilt udtrykker Ets-1 mærket med et streptavidin-bindende peptid (SBP). Efter rensning af Ets-1 på streptavidinkugler, vi analyserede PARylation ved Western blot ved hjælp af en anti-PAR antistof. Resultaterne viste, at en del af Ets-1-protein var lidt PARylated i celler (fig. 2D, bane 2). PARylation er en meget kortvarig post-translationel modifikation, der er vanskelig at visualisere i celler, især som følge af virkningen af ​​poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG), som katalyserer nedbrydningen af ​​PAR polymerer [21].

(A) Skematisk gengivelse af fuld-længde Ets-1 protein og dets dominant negativ isoform Ets-1 p27. Bokse svarer til translaterede regioner og punkterede linjer til utranslaterede regioner. Threonin-38 (Thr38), Spids domæne (PNT), transaktiveringsdomænet (TAD), inhiberende domæne (I), oversat region svarende til exon VII og DNA-bindende domæne (DBD) er angivet. (B) Streptavidin pull-down assay med rekombinant Ets-1 og PARP-1-proteiner. Biotinyleret Ets-1 (5 ug) eller Ets-1 p27 (2,5 ug) proteiner blev påsat streptavidinkugler og derefter inkuberet med ren rekombinant PARP-1-protein (1 ug) i 1 time (bane 2 og 3). Streptavidinkugler alene inkuberet med PARP-1, blev anvendt som kontrol (bane 1). PARP-1 blev analyseret ved Western-blot. (C) PARylation assay med Ets-1 og Ets-1 p27. Ets-1 (1 ug) eller Ets-1 p27 (500 ng) proteiner blev inkuberet med rekombinant PARP-1-protein (500 ng) i PARylation reaktionspuffer (se materialer og metoder) i nærvær (bane 4 og 7) eller i fravær (bane 5 og 8) af nicked DNA i 20 min. Som kontrol blev Ets-1 isoformer inkuberet alene i reaktionspuffer og nicked DNA (bane 3 og 6) og auto-aktivering af PARP-1 alene blev kontrolleret med eller uden DNA (kontrol, bane 1 og 2) (D) PARylation af Ets-1 i stabilt transfekterede HeLa-celler, opnået ved retroviral infektion. Ets-1 mærket med streptavidin-bindingspeptid (SBP) blev oprenset på stretavidin perler fra HeLa celle nukleare ekstrakter (bane 2). HeLa-celler, der stabilt udtrykker kun SBP blev anvendt som kontrol (bane 1). I (C) og (D), blev PARylation status bestemt ved anvendelse af et anti-PAR-antistof.

PARP-1 modulerer Ets-1-medieret transkription af stromelysin-1 promotoren

for at afgøre, om interaktion med PARP-1 modulerer transkriptionelle aktivitet af Ets-1 blev luciferase transaktiveringsassays analyser udført. For at gøre dette, brugte vi initiativtageren af ​​matricen metalloprotease stromelysin-1, hvilket er et godt studerede Ets-1 target gen involveret i kræftcellen migration og invasion [34]. Denne promotor, aktiveres af kooperativ binding af to Ets-1-molekyler via et palindrom EBS, blev fusioneret med luciferasegenet (fig. 3A). 3T3 museceller, med enten PARP-1 vildtype (WT) eller knock-out (KO), blev anvendt til at evaluere Ets-1 transskriptionel aktivitet i totalt fravær af PARP-1-proteinet. I WT celler blev stromelysin-1 promotor fuldt aktiveret af Ets-1 transfektion (fig. 3B, bane 3). I modsætning hertil PARP-1 KO reducerede evne Ets-1 til transaktivere promotor (fig. 3B, bane 4). Redningsforsøg udført ved anvendelse af et humant PARP-1 ekspressionsvektor tilladt Ets-1 til dels genvinde sin transkriptionel aktivitet (fig. 3B, bane 5). Således PARP-1 er nødvendig for fuld transaktivering af stromelysin-1 promotor fra Ets-1. Vi derefter undersøgt konsekvenserne af PARP-1-medieret PARylation på Ets-1 transkriptionel aktivitet. For at gøre dette, vi udførte de samme luciferase transaktiveringsassays assays med 3T3-celler ved hjælp af PJ-34, en PARP-1 katalytisk hæmmer. Overraskende PARylation inhibering modsætning til PARP-1 KO, øget Ets-1 transskriptionel aktivitet på stromelysin-1-promotoren som vist i transficerede WT celler (fig. 3C, bane 3 og 4). I KO-celler, PJ-34 havde ingen effekt og undlod at øge transaktivering af promotoren (fig. 3C, bane 7 og 8). Derfor stigninger i Ets-1 transkriptionel aktivitet virker gennem den specifikke inhibering af PARP-1. Analyse med Western blot viste, at inhibering af PARylation af PJ-34 forårsagede en stigning i Ets-1 proteinniveauet i WT-celler (fig. 3C, bane 3 og 4). For at bekræfte, at PARylation hæmning medfører også en stigning i Ets-1 transkriptionel aktivitet i humane cancerceller, udførte vi luciferase transaktiveringsassays analyser i HeLa-celler med stigende doser af PJ-34. Resultaterne viste, at PJ-34 dosisafhængig stigning i transaktivering af stromelysin-1 promotoren blev korreleret med en stigning i Ets-1 proteinniveauer (fig. 3D, bane 5-8). Denne stigning i Ets-1 proteinniveauer blev observeret i HeLa-celler ikke kun med PJ-34, men også med to andre velundersøgte PARP-1-inhibitorer:. 5-AIQ og ABT-888 (veliparib) (fig 3E, bane 6- 8). Således er denne stigning er på grund af specifik PARP-1 hæmning. Disse resultater antyder, Ets-1 proteinniveauer negativt reguleres af PARP-1-medieret PARylation.

(A) Skematisk repræsentation af luciferasegenet under kontrol af den humane stromelysin-1-promotoren. Palindrome Ets-bindingssteder (EBS) er vist bundet med to Ets-1 molekyler. (B) Effekt af PARP-1 knock out (KO) på Ets-1-medieret stromelysin-1 promotor-aktivitet. pGL3 luciferase reporterkonstruktioner (100 ng) blev transficeret ind 3T3 museceller vildtype (WT) (bane 1 og 3) eller KO for PARP-1-genet (bane 2, 4 og 5) ved 50-80% konfluens i fravær (bane 1 og 2) eller i nærvær (bane 3, 4 og 5) i Ets-1-ekspression vektor (25 ng) og i redningsforsøg med PARP-1 ekspressionsvektor (100 ng; bane 5). (C) Effekt af PARP-1 katalytiske inhibering på Ets-1-medieret stromelysin-1 promotoraktivitet i nærvær eller fravær af PARP-1. pGL3 luciferase reporterkonstruktioner (100 ng) blev transficeret ind i 3T3 museceller WT (bane 1 og 4) eller KO for PARP-1-genet (bane 5-8) ved en 50-80% sammenflydning i fravær (bane 1, 2 , 5 og 6) eller i nærvær (bane 3, 4, 7 og 8) af Ets-1 ekspressionsvektor (25 ng) og i fravær (bane 1, 3, 5 og 7) eller i nærvær (bane 2 , 4, 6 og 8) af PJ-34, en katalytisk inhibitor af PARP-1 (10 uM). (D) Effekt af PARP-1 katalytisk inhibering på Ets-1-medieret stromelysin-1-promotor-aktivitet i en cancercelle model. pGL3 luciferase reporterkonstruktioner (100 ng) blev transficeret ind i HeLa-celler ved en 50-80% sammenflydning i fravær (bane 1-4) eller i nærvær (bane 5-8) af Ets-1 ekspressionsvektor (100 ng) og med stigende doser af PJ-34 (0-20 uM; bane 1-4 og 5-8). I (B), (C) og (D), luciferaseaktivitet målt 48 timer efter transfektion og 20 timer efter inkubation med PJ-34, udtrykkes som en procentdel med aktiviteten induceret af Ets-1 i en PARP-1 WT sammenhæng angives som 100%. Resultater er gennemsnittet af tre eksperimenter udført i triplikat. (E) Effekt af PARP-1 katalytisk hæmning på niveauet af Ets-1 protein. HeLa-celler blev dyrket i 6-brønds plader indtil 70% konfluens, transficeres med pcDNA3 (1 ug; venstre panel) eller pcDNA3-Ets1 (1 ug; højre panel) vektorer til 24 timer og behandlet med PJ-34 (1 uM) ( bane 2 og 6), 5-AIQ (1 uM) (bane 3 og 7) eller ABT-888 (1 uM) (bane 4 og 8) i 20 timer. I alle eksperimenter blev cellelysater (30 ug af total proteiner) analyseret ved Western blot under anvendelse af forskellige antistoffer (se Materialer og fremgangsmåder).

Inhibering af PARylation forårsager akkumulering af Ets-1 i cancerceller

for at bestemme kinetikken for Ets-1 ophobning, vi udførte time-lapse billeddannelse eksperimenter. HeLa-celler blev transient transficeret med en vektor, som udtrykker et fusionsprotein eGFP (forstærket grønt fluorescerende protein) -Ets-1. Under kontrol betingelser, eGFP-Ets-1 protein niveauer var stabile i løbet af en 12 h time-lapse (fig. 4A, række 1). Efter tilsætning af PJ-34, observerede vi en kraftig stigning i eGFP-Ets-1 signal svarende til kernerne i HeLa-celler (fig. 4A, række 2). Alligevel PJ-34 havde ingen virkning på eGFP alene (fig. 4A, række 4), og, mere interessant, havde ingen virkning på eGFP-Ets-1 p27 (fig. 4A, række 3). I betragtning af, at fuld-længde Ets-1 er ubiquitinerede og derefter nedbrydes af proteasomet, hvorimod Ets-1 p27 ikke har nogen ubiquitinering sites [19], [33], vi næste undersøgt, om kinetikken af ​​Ets-1 ophobning kan sammenlignes til de af proteasomalaktivitet inhibering. Brug MG-132, en velkendt proteasominhibitor, resulterede i de samme kinetik for Ets-1 akkumulation som dem observeret under PARylation hæmning (fig. 4A, række 5). I modsætning hertil MG-132 havde ingen effekt på Ets-1 p27 protein niveauer og dermed styrke forbindelsen mellem PARylation og proteasom nedbrydning af Ets-1 (fig. 4A, række 6). Statistisk analyse af variationen i fluorescens intensitet i disse tid-lapse viste, at den betydelige variation i Ets-1 protein niveauer (ca. 50% stigning) observeret ved tilsætning af PJ-34 eller MG-132 var sammenlignelig (fig. 4A, bund panel, bane 2 og 5). For at bekræfte, at ophobning af Ets-1 medieret af PARP-1 hæmning kunne også observeres i et endogent kontekst, vi behandlede MDA-MB-231 celler med PJ-34 og analyseret Ets-1 protein niveauer ved immunofluorescens. Ets-1 blev primært lokaliseret i kernen af ​​MDA-MB-231 celler, men dens tilstedeværelse blev også observeret i den perinukleære cytoplasma (fig. 4B, bane 1, hvide pile) [33]. Med en anti-Ets-1 antistof, bemærkede vi en stærk ophobning af endogen Ets-1 i cellernes kerner og cytoplasma (fig. 4B, bane 2). Vi undersøgte derefter, om denne mekanisme var specifik for Ets-1. For at gøre dette, vi testede flere proteiner vides at være PARylated såsom p53, c-Jun, ERK-2 og PARP-1 [21], [23], [27], [35]. Resultaterne viste, at med undtagelse af Ets-1, ingen af ​​akkumuleret i celler under PARylation inhibering af PJ-34 (fig. 4C) disse proteiner. Vi observerede også, at Ets-1 effektivt akkumuleres i MDA-MB-231-celler efter behandling med andre PARP-1-inhibitorer, 5-AIQ og ABT-888, hvorimod p53 proteinniveauer forblev uændret (fig. S3). Således er PARP-1-medieret PARylation involveret i en bestemt regulering af Ets-1 protein niveauer i kræftceller, og vi antager, at denne mekanisme er forbundet til sin proteasomalaktivitet nedbrydning.

(A) Kinetik af Ets-1 akkumulering observeret af time-lapse billeder. HeLa-celler blev dyrket i Mattek retter og blev transfekteret med pEGFP-C1-Ets-1 (500 ng; rækkerne 1, 2 og 5) eller pEGFP-C-1-Ets-1p27 (500 ng, rækker 3 og 6) eller tomme pEGFP-C1 vektorer (500 ng; row 4). 24 timer efter transfektion blev HeLa-celler behandlet med PJ-34 (10 uM; rækker 2-4) eller MG-132 (5 uM; rækker 5 og 6) og observeres i 12 timer under et fluorescensmikroskop ved × 20 forstørrelse med en billede taget hver time. Bundplade: Statistisk analyse af variationen af ​​fluorescensintensitet. 1 til 6 er angivet på x-aksen er de samme som de ovenfor beskrevne. Mean fluorescensintensiteter fra time-lapse eksperiment-billeder blev beregnet ved anvendelse ImageJ software og forholdet mellem variationen blev etableret mellem T = 12 timer og t = 0 billeder. Resultater er gennemsnittet af tre eksperimenter. (B) Visualisering af Ets-1 proteinniveauer i MDA-MB-231-celler behandlet med PJ-34 ved immunofluorescens. MDA-MB-231-celler blev behandlet med PJ-34 (10 uM) i 20 timer. Ets-1 er visualiseret i Rød (Alexa Fluor® 594). Celler blev undersøgt under et fluorescensmikroskop ved × 40 forstørrelse. Scale bar = 20 um. Hvide pile angiver cytoplasmatisk lokalisering af Ets-1 i ubehandlede celler (bane 1). Bundplade: Surface plot repræsentationer. Surface parceller blev opnået ved at analysere immunfluorescens billeder med ImageJ software; x- og y-akserne angiver pixelpositioner og z-aksen, intensiteten af ​​fluorescens. (C) Effekt af PARP-1 katalytisk hæmning på niveauet af PARylated proteiner. MDA-MB-231-celler blev behandlet med PJ-34 (10 uM) i 20 timer. Cellelysater (30 ug af total proteiner) blev analyseret ved Western blot under anvendelse af forskellige antistoffer (se materialer og metoder) mod PARP-1, p53, c-Jun og ERK-2, der vides at undergå PARylation.

Ets-1-ekspression fører til kræft celledød under PARylation hæmning

for at bestemme konsekvenserne af Ets-1 ophobning i kræftceller, vi undersøgt, om eksogen Ets-1-ekspression påvirker overlevelsen af ​​HeLa celler behandlet med PJ -34. HeLa-celler blev transficeret med en vektor, der udtrykker Ets-1 eller en tom vektor og derefter inkuberet i 20 timer med PJ-34. Time-lapse billeddannelse eksperimenter viste, at PJ-34 ikke havde nogen drastisk effekt på overlevelsen af ​​HeLa-celler transficeret med den tomme vektor ( “Mock«) som påvist ved fravær af nekrotisk morfologi og propidiumiodid (PI) inkorporering (Fig. 5A, venstre panel og 5B). Alligevel Ets-1-ekspression sensibiliserede cancerceller for PJ-34 toksicitet i høj grad (fig. 5A, højre panel). Time-lapse imaging eksperimenter og statistisk analyse viste, at næsten alle de Ets-1-udtrykkende HeLa celler indarbejdet PI og gennemgik nekrose (fig. 5A, højre panel og 5B). Tilsvarende vil en fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) -analyse viste, at Ets-1-udtrykkende HeLa-celler var mere tilbøjelige til nekrose efter PJ-34 behandling (fig. 5C, højre panel). Som PJ-34 er kendt for at forårsage mitosestandsning i et PARP-1-uafhængig måde [36], udførte vi også disse forsøg med ABT-888 (Fig. S4). De samme resultater blev opnået, hvilket viser, at nekrose af Ets-1-udtrykkende HeLa-celler opererer gennem specifik inhibering af PARP-1 (fig. S4). Med MDA-MB-231-celler, observerede vi, at 44% af cellerne undergår nekrose efter PJ-34 behandling (fig. 5D og 5E). FACS analyse bekræftede dette lavere følsomhed over for PJ-34 toksicitet (fig. 5F). Brystkræftceller er mere modstandsdygtige over anti-cancer lægemidler, såsom doxorubicin eller paclitaxel, på grund af høj ekspression af MDR1 og Ets-1 [37]. Derfor testede vi, om PJ-34 kan anvendes som supplement til et doxorubicin behandling. Disse eksperimenter også tilladt os at undersøge, om [eller ikke] ETS-1 akkumulation medieret af PARP-1 hæmning medfører en større grad af resistens over for doxorubicin i MDA-MB-231 celler. Resultater viser, at Ets-1 stadig akkumuleret under PARylation hæmning når MDA-MB-231-celler blev behandlet med 500 nM doxorubicin (fig. S5A). vi bemærkede imidlertid, at MDA-MB-231-celler var mere tilbøjelige til nekrose når PJ-34 og doxorubicin blev kombineret, end når cellerne blev behandlet med kun én af disse to lægemidler (fig. S5B og S5C). Således, selv om PJ-34 effekter er moderate i MDA-MB-231-celler, PARP-1-inhibitorer effektivt kunne kombineres med andre anticancerlægemidler at forbedre effektiviteten af ​​behandlingen.

(A) Time-lapse billeddannelse eksperimenter af HeLa celler behandlet med PJ-34. HeLa-celler blev dyrket i Hi-Q4 retter indtil 70% konfluens og transficeret med tomme pcDNA3 (250 ug; venstre panel) eller pcDNA3-Ets1 (250 ug; højre panel) vectors 24 timer før behandling med PJ-34 (5 uM) eller venstre ubehandlet. Celler blev farvet med Hoechst 33.242 (blå) og PI (rød) til live-cell imaging og overvåges i 20 timer. Scale bar = 20 uM. (B) Grafisk fremstilling af andelen af ​​nekrotiske HeLa-celler (%) ved tre tidspunkter (se Materialer og fremgangsmåder). (C) Flowcytometri celledød påvisning af HeLa-celler behandlet med PJ-34. HeLa-celler blev dyrket i 6-brønds plader indtil 70% konfluens og transficeret med pcDNA3 (1 ug; venstre panel) eller pcDNA3-Ets1 (1 ug; højre panel) vektorer i 24 timer og venstre ubehandlet (stiplede linier) eller behandlet med PJ -34 (fuldt optrukne linjer) i yderligere 20 timers inkubation. Nekrotisk celledød blev derefter bestemt ved flowcytometri efter PI-farvning. Tal under den vandrette bjælke giver de procentsatser af specifikke PJ-34-induceret nekrotisk celledød i hver tilstand. Flowcytometri profiler er vist, er repræsentative for tre gentagne forsøg. (D) Time-lapse billeddannelse eksperimenter af MDA-MB-231 celler behandlet med PJ-34. MDA-MB-231 celler blev dyrket i Hi-Q4 retter indtil 80% konfluens og behandlet med PJ-34 (10 uM) eller ubehandlet. Celler blev farvet med Hoechst 33.242 (blå) og PI (rød) til live-cell imaging og overvåges i 20 timer. Scale bar = 20 uM. (E) Grafisk fremstilling af andelen af ​​nekrotiske MDA-MB-231-celler (%) ved tre tidspunkter (se Materialer og fremgangsmåder). F) Flowcytometri celledød påvisning af MDA-MB-231-celler behandlet med PJ-34. MDA-MB-231-celler blev dyrket i 6-brønds plader indtil 80% konfluens og efterladt ubehandlet (stiplede linier) eller behandlet med PJ-34 (fuldt optrukne linier) for en 20 h inkubation. Nekrotisk celledød blev derefter bestemt ved flowcytometri efter PI-farvning. Tal under den vandrette bjælke repræsenterer de procentsatser af specifikke PJ-34-induceret nekrotisk celledød i hver tilstand. Flowcytometri profiler vist er repræsentative for tre replikater eksperimenter.

Ophobning af Ets-1 medieret af PARylation hæmning øger DNA-skader

Vi derefter undersøgt muligheden for, at cellen nekrose medieret af hæmning af PARP-1 samtidig med Ets-1 akkumulering skyldtes en stigning i DNA-skader som observeret med Ets fusionsproteiner i prostatakræft og Ewings sarkom [26], [30]. For at gøre dette, vi vurderede niveauet af en histon-mærke af DNA dobbelt-strenget pauser, phosphoryleret H2AX (γH2AX) foci.