PLoS ONE: UDP-glucuronosyltransferase 1A kompromiser intracellulær akkumulering og Anti-Cancer Effekt af Tanshinone IIA i Human Colon Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund og formål

NAD (P) H: quinon oxidoreduktase 1 (NQO1) reduktion medieret quinon og efterfølgende UDP-glucuronosyltransferaser (UGT’er) katalyseret glucuronidering er den dominerende metaboliske vej for tanshinone IIA (TSA), en lovende anti-cancer middel. UGT’er er positivt udtrykt i forskellige tumorvæv og spiller en vigtig rolle i den metaboliske eliminering af TSA. Denne undersøgelse har til formål at udforske den rolle UGT1A ved fastsættelsen af ​​den intracellulære akkumulering og den deraf apoptotiske effekt af TSA.

Eksperimentel Approach

Vi undersøgte TSA intracellulær ophobning og glukuronidering i HT29 (UGT1A positiv) og HCT116 (UGT1A negativ) menneskelige kolon kræft cellelinjer. Vi undersøgte også TSA-medierede reaktive ilt arter (ROS) produktion, cytotoksicitet og apoptotisk effekt i HT29 og HCT116 celler til at undersøge, om UGT1A niveauer er direkte forbundet med TSA anti-cancer effekt. UGT1A siRNA eller propofol, et UGT1A9 kompetitiv inhibitor, blev brugt til at hæmme UGT1A udtryk eller UGT1A9 aktivitet.

Key Results

Flere UGT1A isoformer er positivt udtrykt i HT29 men ikke i HCT116 celler. Cellular S9 fraktioner fremstillet ud fra HT29-celler udviser stærk glucuronidering aktivitet over TSA, der kan hæmmes af propofol eller UGT1A siRNA interferens. TSA intracellulær akkumulering i HT29-celler er meget lavere end den, HCT116-celler, som korrelerer med højt ekspressionsniveauer af UGT1A i HT29-celler. Konsekvent, TSA inducerer mindre intracellulær ROS, cytotoksicitet, og apoptotisk effekt i HT29-celler end i HCT116 celler. Forbehandling af HT29-celler med UGT1A siRNA eller propofol kan nedsætte TSA glukuronidering og samtidig forbedre sin intracellulær akkumulering, samt øge TSA anti-cancer effekt.

Konklusioner og implikationer

UGT1A kan kompromittere TSA cytotoksicitet via reducere sin intracellulære eksponering og skifte NQO1-udløste redox cyklus til metabolisk elimination. Vores undersøgelse kan kaste et lys i forståelsen af ​​cellulære farmakokinetiske og molekylære mekanisme, hvormed UGT’er bestemme kemoterapi virkninger af lægemidler, som er UGT’er ‘substrater

Henvisning:. Liu M, Wang Q, Liu F, Cheng X, Wu X, Wang H et al. (2013) UDP-glucuronosyltransferase 1A kompromiser intracellulær akkumulering og Anti-Cancer Effekt af Tanshinone IIA i Humane Colon Cancer Cells. PLoS ONE 8 (11): e79172. doi: 10,1371 /journal.pone.0079172

Redaktør: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: Maj 27, 2013; Accepteret: September 20, 2013; Udgivet: November 14, 2013 |

Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en fond for forfatteren af ​​National Excellent doktorafhandling Kina (Grant 200.979), Natural Science Foundation of China (Tilskud 91029746 og 81273586), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (Tilskud BK2011065 og BK2012026), og programmet for New Century Fremragende Talenter i University (Grant NCET-09-0770). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

UDP-glucuronosyltransferaser (UGT’er) katalyserer glukuronidering af mange lipofile endogene substrater såsom bilirubin og steroid hormoner og miljøfremmede stoffer, herunder kræftfremkaldende stoffer og kliniske lægemidler [1], [2], [3]. I de fleste tilfælde UGT-medieret metabolisme fremmer den metaboliske eliminering og mindsker de biologiske effektiviteter af substraterne, selv om der er observeret flere tilfælde af bioaktivering [4], [5]. UGT’er således betragtes som en vigtig afgiftning system. Genetiske polymorfier af UGT’er forårsager nedsat enzymaktivitet er blevet forbundet med risiko cancer, såsom colorektal cancer, brystcancer, lungecancer, proximale mave-cancer-tarmkanalen, hepatocellulært carcinom og prostatacancer [6], [7]. Alternativt kan de forbedrede enzymatiske aktiviteter af UGT’er udgør en vigtig bidragyder til kemoterapeutisk modstand på mange lægemidler, som er UGT’er ‘substrater, såsom irinotecan, methotrexat, epirubicin, og tamoxifen [8], [9], [10], [11] , hvilket indebærer en afgørende rolle for UGT’er i anti-cancerbehandling. UGT’er er positivt udtrykt i forskellige typer af tumor væv og celler, om end i et relativt lavere niveau sammenlignet med de tilsvarende normale væv [12], [13], [14], [15]. Selvom UGT’er er blevet hævdet som en vigtig årsag til kemoterapeutisk modstand, er lidt om den direkte indflydelse af UGT’er vedrørende den intracellulære akkumulering i mål kræftceller og kemoterapeutiske effekt af lægemidler.

Tanshinone IIA (TSA) er en diterpen phenanthrenquinon sammensatte isoleret fra den tørrede rod af salvia miltiorrhiza (Danshen i kinesisk), som er et udbredt urtemedicin med godt gennemprøvede kardiovaskulære og cerebrovaskulære effektiviteter [16], [17], [18]. Især akkumulere beviser støtter, at TSA er en lovende anticancermiddel [19], [20], [21], [22]. Vi har tidligere præciseret, at TSA overvejende elimineres via sekventiel NAD (P) H: quinon oxidoreduktase 1 (NQO1) og UGT katalyseret metabolisme [23], [24]. NQO1 katalyserer en to-elektron reduktion af TSA producerer et meget ustabilt catechol metabolit, hurtigt kan glukoronideret hvis UGT’er er til stede. Men når UGT’er er fraværende, kan den meget reaktive catechol mellemprodukt underkastes en redox cyklus af reduktion quinon og auto-oxidation, en proces, der producerer store mængder af reaktive oxygenarter (ROS). Basis af dette fund har vi for nylig valideret at NQO1 er en vigtig intracellulær mål på TSA som fremkalder den apoptotiske død af human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler [25].

På basis af vores nylige fund, at flere UGT1A isoformer er involveret i TSA glucuronidering [24], den foreliggende undersøgelse fokuserer på at belyse den rolle, som disse UGT’er ved bestemmelse af intracellulære akkumulering og apoptotiske virkning af TSA i humane coloncancer-celler. Her viste vi, at TSA glukuronidering i UGT-positive cancerceller formindsket TSA intracellulær akkumulation, brød NOQ1-udløst redox cyklus, og dermed reduceret TSA-induceret ROS dannelse og dens anti-cancer effekt.

Materialer og metoder

cellelinier og Kultur

human coloncancer cellelinier HT29 og HCT116 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, USA). Celler voksede i McCoys 5a (Gibco, USA) medium med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, USA), 100 U ml

-1 penicillin, og 100 mg ml

-1 streptomycin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. Til forskellige formål blev celler dyrket i 24-72 timer i mediet og derefter lægemidler blev tilsat. Trypsin (2,5%) blev anvendt for celle høst. Alle celler var mycoplasma gratis.

Kemikalier og reagenser

TSA blev købt fra det nationale institut for kontrol med farmaceutiske og biologiske produkter (Beijing, Kina), og forberedt til fast dispersion med PEG6000 som beskrevet [26]. Propofol, 4-methylumbelliferon (4-MU), mycophenolsyre (MPA), N-acetylcystein (NAC), dicoumarol (DIC), glucose-6-phosphat, glucose-6-phosphat-dehydrogenase, β-nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP) , uridin-5′-diphosphat-glucuronsyre (UDPGA), D-saccharinsyre 1,4-lacton, β-D-glucuronidase (Escherichia coli), chlorzoxazon, 2 ‘, 7’-dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA), og 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev alle opnået fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Annexin V-FITC Apoptose Detektion Kit blev indkøbt fra Bipec Biopharma Corporation (USA). Real time PCR-primere til påvisning af transkripter af UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A9, og UGT1A10 blev indkøbt fra Invitrogen (CA, USA). Antistoffer mod UGT1A (Abcam, USA), UGT1A9 (Abcam, USA), og GAPDH (Boster Biology, Kina) blev anvendt i Western blot-analyse. Højtryksvæskekromatografi (HPLC) grad acetonitril blev opnået fra Fisher Scientific (Toronto, Canada). Alle andre kemikalier var af HPLC-kvalitet eller den bedste kvalitet, der var kommercielt tilgængelige.

transient transfektion af UGT1A siRNA

Forbigående transfektion blev udført under anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, USA) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev Stealth RNAi siRNA (Invitrogen, USA) i UGT1A tavshed eller en negativ kontrol blandet med Lipofectamine RNAiMAX Reagens i Opti-MEM I (Gibco, USA) ved en finial koncentration på 20 nM, og siRNA blanding blev tilsat til en passende dyrkningsplade ved stuetemperatur. Eksponentielt voksende celler blev efterfølgende udsået i transfektionsblandingen-holdige plade. Celler blev inkuberet i en inkubator (5% CO

2) ved 37 ° C i 24-72 timer.

Kvantificering af mRNA-niveauer Salg

Total mRNA blev ekstraheret fra celler, og cDNA blev syntetiseret af PrimeScrip RT reagens kit (Takara Biotechnology, Dalian, Kina). Kvantitativ realtids-PCR blev udført ved SYBR Premix Ex Taq II (Takara Biotechnology, Dalian, Kina) ved at følge fabrikantens instruktion. Sekvenserne af primere, der anvendes i real-time PCR er noteret på understøttende information 1 (tabel S1). PCR-betingelserne var 95 ° C i 1 min, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder.

Western blot-analyse

Celler blev høstet og samlet protein blev ekstraheret. Proteinkoncentrationen blev derefter bestemt under anvendelse af BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kina). Lige store mængder protein (50 ug) blev fyldt og separeret ved SDS-PAGE elektroforese. Proteiner blev derefter overført til en PVDF-membran (PALL, USA). Blots blev blokeret med 5% skummetmælk i en TBST-buffer og inkuberet i 24 timer ved 4 ° C med specifikke primære antistoffer. Membranen blev vasket 3 gange med TBST og inkuberes derefter med HRP-konjugeret sekundært antistof (KeyGen, Nanjing, Kina) i 1 time ved 37 ° C. Signalet blev visualiseret ved forøget kemiluminescens (ECL, Millipore). De protein Ekspressionsniveauerne blev normaliseret med GAPDH.

UGT Activity Assay

UGT aktivitet blev præsenteret af substratets glucuronidering aktivitet med celle S9 fraktioner. Celler blev høstet med 2,5% trypsin og vasket i iskold PBS, homogeniseret i PBS og centrifugeret ved 9.000 g i 20 minutter ved 4 ° C til opnåelse celle S9 fraktioner. Indholdet af S9 fraktioner protein blev bestemt under anvendelse af BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kina). Ifølge tidligere rapporter [27], [28], ikke-specifik UGT1A substrat 4-MU blev anvendt til at bestemme den generelle aktivitet af UGT1A, og MPA, som er glukoronideret primært ved UGT1A9 blev anvendt til bestemmelse UGT1A9 aktivitet. Kort beskrevet 4-MU eller MPA (0,5 mM) blev inkuberet i en reaktionsblanding 200 pi indeholdende 0,1 mg (0,2 mg for MPA) celle S9 fraktioner, 2 mM UDPGA, 1 mM saccharinsyre 1,4-lacton, 5 mM MgC

2, og 50 mM Tris-HCI-buffer (pH 7,4) ved 37 ° C i 15 min (30 min for MPA). S9 fraktioner blev forbehandlet med alamethicin ved en koncentration på 25 ug mg

-1 på is i 20 minutter. Efter forinkubering i 5 min ved 37 ° C blev reaktionen startet ved tilsætning UDPGA. Reaktioner blev standset ved tilsætning af 400 pi iskold acetonitril og prøver blev centrifugeret i 10 minutter ved 20.000 g. Supernatantprøver (100 pi) blev analyseret ved en Shimadzu (Kyoto, Japan) LC-2010C HPLC-system udstyret med en kvaternær pumpe, autosampler, kolonneovn og UV-detektor. Separationen blev udført ved anvendelse af en Lunar-C18-søjle (250 x 4,6 mm i.d., 5 um, Phenomenex Inc., Kina) med en forkolonne (Phenomenex Inc., Kina). For 4-Mu, den mobile fase var acetonitril (A) og vand med 25 mM K

2HPO

3 (B) ved en strømningshastighed på 1 ml min-

1; eluering blev udført med følgende gradient: 15% A (0-2 min), lineær gradient fra 15% til 60% A (2-5 min), 60% til 40% A (5-8 min), og 15% a for 8-10 min, og derefter i yderligere 5 min på ækvilibrering med en søjletemperatur på 40 ° C og UV-detektion ved 322 nm. For MPA, den mobile fase var acetonitril (A) og vand med 0,1% (v /v) eddikesyre (B) ved en strømningshastighed på 1 ml min-

1; eluering blev udført med følgende gradient: 45% (0-2 min), lineær gradient fra 45% til 80% A (2-8 min), 80% A i yderligere 1 min og 45% A i 9-10min og derefter i yderligere 4 min af ækvilibrering med en søjletemperatur på 40 ° C og UV-detektion ved 250 nm. Nøjagtig kvantificering af de nydannede glucuronider blev opnået ved kalibrering med autentiske standarder (Sigma, USA).

Glucuronidering Analyse af TSA i S9 Brøker

S9 fraktion (0,25 mg) blev inkuberet med angivet koncentrationer af TSA i en reaktionsblanding bestående af 2 mM UDPGA, 1 mM saccharinsyre 1,4-lacton, 5 mM MgC

2, og et NADPH-regenererende system indeholdende 0,2 mM NADP, 1,9 mM glucose-6-phosphat, 1,2 U ml

-1 glucose-6-phosphatdehydrogenase og 50 mM Tris-HCI-buffer (pH 7,4) i et endeligt volumen på 200 pi. S9 fraktionen blev forbehandlet med alamethicin ved en koncentration på 25 ug mg

-1 på is i 20 min for at mindske latensen af ​​UGT aktivitet. For enzymkinetik assay efter forinkubering i 5 min ved 37 ° C blev reaktionen startet ved tilsætning af UDPGA og inkuberet ved 37 ° C i 60 minutter. For propofol inhiberingsundersøgelse, propofol (0-400 uM) blev co-inkuberet med TSA (20 uM) ved 37 ° C i 20 min. Alle reaktionerne blev afsluttet ved iskold acetonitril, efterfulgt af centrifugering ved 20.000 g i 10 minutter til dannelse af supernatanterne, og derefter analyseret ved HPLC-system på samme måde som beskrevet ovenfor med metoden baseret på vores tidligere rapport [24].

TSA intracellulær akkumulering og glucuronisering i levende celler

Eksponentielt voksende celler med 70% sammenløb blev udsat for 20 uM TSA i 0,5, 2, 6, 24 og 48 timer. Celler og dyrkningsmedium blev indsamlet separat ved angivne tidspunkter. Celler blev vasket tre gange ved iskold PBS. Ultrarent vand (300 pi) blev tilsat til hver celleprøve og frysning /optøning tre gange for at bryde cellerne. Enten celle- eller medium prøve kultur (100 pi) blev tilsat med iskold acetonitril (300 pi) og blandet ved kraftig vortex i 5 minutter, efterfulgt af centrifugering ved 20.000 g i 10 min til opnåelse af supernatanten, derefter analyseret ved HPLC-metoden baseret på vores tidligere rapport [24]. Medikamentkoncentrationer blev normaliseret ved at bestemme proteinkoncentrationen af ​​celle- prøver under anvendelse af BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kina).

ROS Assay

angivne koncentration af TSA blev administreret til celler ved 70% konfluens i 1 time. Derefter blev cellerne behandlet med DCFH-DA i 30 minutter og vasket ved iskold PBS i tre gange. Cellular ROS kan konversere ikke-fluorescerende DCFH-DA til sin fluorescerende derivat DCF. ROS-dannelse blev analyseret ved måling af fluorescensintensiteten af ​​DCF ved 535 nm (med 488 nm excitation) i Synergy-H1 fluorimeter (Bio-Tek Instruments).

cytotoksicitetsanalyse

Celler blev podet ved 7.000 celler pr brønd til en 96-brønds plade og inkuberet natten over. Cellerne blev efterfølgende udsat for de angivne koncentrationer af TSA. Efter 48 timer (for HCT116) eller 72 timer (for HT29), MTT (5 mg ml

-1) blev tilsat til hver brønd, og pladen blev inkuberet ved 37 ° C i yderligere 4 timer. MTT-opløsning blev derefter fjernet og 150 pi DMSO blev tilsat per brønd. Absorbansen ved 570 nm blev målt med en mikropladelæser.

Apoptose Assay

Celler blev podet med 2 × 10

5 /brønd i pladen med 6 brønde og nåede 60% konfluens efter 72 timer kultur. Derefter celler blev udsat for den angivne koncentration af TSA i 48 timer (HCT116) eller 72 timer (HT29) og høstet med 0,25% trypsin uden EDTA og vasket ved iskoldt PBS. Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Bipec Biopharma Corporation, USA) blev anvendt til at farve de celler ifølge producentens anvisninger. Prøverne blev analyseret ved anvendelse af et flowcytometer (BD FACSCalibur, USA).

Statistical Analysis

Alle data er præsenteret som middelværdi ± SD af mindst tre uafhængige forsøg. Statistiske forskelle mellem to grupper blev evalueret ved brug af t-test; for multiple sammenligninger blev envejs variansanalyse efterfulgt af Dunnet-test anvendt. Forskellen blev betragtet som signifikant ved * P 0,05, ** P 0,01, eller *** P 0,001

Resultater

Flere UGT1A isoformer Positivt Udtrykt i HT29, men ikke i HCT116. Celler

Vi først evalueret ekspressionsniveauerne af UGT1A isoformer der var involveret i TSA glukuronidering af real time PCR i både HT29 og HCT116 cellelinjer. Figur 1A viser genekspression mønster af UGT1A isoformer i HT29-celler. I modsætning hertil blev der ingen ekspression af UGT1A gener påvist i HCT116-celler (data ikke vist). For yderligere at undersøge den rolle, UGT’er blev specifikke siRNA brugt til at lukke munden på UGT1A gener i HT29-celler. Tre par siRNA’er rettet mod UGT1A sekvens blev udformet, og den bedste par med de højeste lyddæmpende effekter sammen med ikke-specifik siRNA som en negativ kontrol blev undersøgt. Efter siRNA transfektioner, blev mRNA-niveauer evalueret i HT29-celler. MRNA-niveauerne for UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A9, og UGT1A10 blev reduceret med 85,8%, 31,4%, 87,5%, 66,5% og 68,2%, hvorimod den negative kontrol siRNA havde ringe virkning (figur 1A). Western blot assay støttet et højt ekspressionsniveau af UGT1A i HT29-celler, hvorimod ingen påviselig UGT1A protein blev observeret i HCT116 celler (Figur 1B). Proteinet ekspression af total UGT1A og specifik UGT1A9 blev kraftigt reduceret med UGT1A siRNA i HT29-celler (figur 1B og 1C). Resultaterne af UGT aktivitet assay viste, at HT29-celler besidder høj kapacitet mod glucuronidering af 4-MU, en generel UGT1A substrat, og MPA, en relativt specifik UGT1A9 probe. 4-MU og MPA glucuronideringsprocesser aktiviteter blev reduceret med UGT1A siRNA transfektion med 85,6% og 57%, henholdsvis (figur 1B og 1C). Overensstemmelse med mRNA og protein niveauer undersøgelse blev der ikke UGT1A specifik enzymatisk aktivitet detekteres i HCT116-celler (Figur 1B). Salg

Celler blev forbehandlet med UGT1A siRNA, ikke-specifik siRNA (negativ kontrol) eller vehikel i 48 timer. (A) mRNA-niveauer af UGT1A isoformer i HT29-celler. UGT1A1 mRNA-niveau af cellerne med vehikel blev taget som 1; (B) proteinniveauer og enzymaktiviteterne i UGT1A; (C) proteinniveauer og enzymaktiviteterne fra UGT1A9. Den totale UGT1A aktivitet blev bestemt ved at detektere hastigheden af ​​4-Mu glucuronidering, og UGT1A9 specifikke aktivitet blev bestemt ved at detektere hastigheden af ​​MPA glucuronidering. Enzymaktiviteten blev udtrykt som nmol pr minut pr mg protein. En UGT1A aktivitet 0,1 nmol min

-1 mg

-1 blev anset nondetectable (ND). Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SD af mindst tre uafhængige forsøg.

hæmning af UGT1A Expression eller UGT1A9 Activity Reducerer TSA Glucuronidering i HT29 Cell S9 Brøker

For at opnå forståelse af TSA glukoronidiseringen af ​​colon cancerceller, udførte vi enzymet kinetisk assay under anvendelse af S9-fraktioner fremstillet ud fra HT29-celler med eller uden UGT1A siRNA behandling. I overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse [24], M1 og M2, et par af regioisomerer af TSA catechol glucuronider, blev påvist fra HT29 men ikke HCT116 celler S9 fraktioner. TSA glucuronidering vises en typisk Michaelis-konstanten (figur 2A og 2B). Kinetiske parametre, herunder den tilsyneladende K

m, maksimal hastighed (V

max), iboende clearance (CL

int, V

max /K

m) for M1 og M2, og sum CL

int (M1 + M2) er opsummeret i tabel 1. lyddæmpning af UGT1A isoformer af UGT1A siRNA blyholdig til en ca. 10 ganges fald i V

max værdier til produktion af både M1 og M2, mens havde lille indflydelse i K

m værdier. Følgelig CL

int for M1 og M2, og summen CL

int (M1 + M2) af UGT1A stilhed gruppe var ca. 10 gange lavere end den negative kontrolgruppe.

enzymkinetik til dannelse af TSA glucuronider (M1 og M2) blev undersøgt i (A) celle S9 fraktioner fremstillet ud fra HT29-celler forbehandlet med negativ kontrol siRNA, og (B) celler S9 fraktioner fremstillet ud fra HT29-celler forbehandlet med UGT1A siRNA. (C) inhiberende virkning af propofol (0-400 uM) på TSA glucuronidering i HT29 celler S9 fraktioner. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg.

Den hæmmende effekt af propofol på TSA glukuronidering i HT29 celle fraktioner blev også undersøgt. Som UGT1A9 specifikt substrat [8], viste propofol ca. 25% inhibering af både M1 og M2 på 100 uM, og omkring 40% inhibering ved 400 uM (figur 2C).

UGT1A determinates TSA Akkumulering i Colon Cancer celler

for at teste, om UGT1A kan påvirke TSA disposition i levende celler, udførte vi en cellulær farmakokinetisk undersøgelse. Den dynamiske intracellulær akkumulering af TSA og dets metabolitter (M1 og M2) blev bestemt. Af interesse, det intracellulære niveau af TSA steget kontinuerligt i løbet af 48 timer efter TSA behandling i HCT116 celler. Imidlertid TSA koncentration i HT29-celler toppede efter 6 timer og derefter faldt dramatisk (Figur 3A). Arealet under kurven fra 0 til 48 timer (AUC

0-48 h) og maksimal koncentration (C

max) på TSA i HCT116 var meget højere end den HT29-celler (tabel 2). Forbehandling af HT29-celler med propofol resulterede i en signifikant forøgelse intracellulær akkumulering af TSA. Tilsvarende UGT1A siRNA transfektion øgede også TSA akkumulering i HT29-celler (figur 3A, tabel 2). Både M1 og M2 var påviselige i HT29-celler ved 0,5 time efter TSA behandling, hvilket tyder på en hurtig intracellulær produktion af glucuronider. De intracellulære niveauer af M1 og M2 toppede efter 6 timer og faldt derefter (figur 3B og 3C), mens niveauerne af TSA glucuronider i dyrkningsmediet akkumulerede kontinuerligt i løbet af detektion (figur 3D og 3E). Dannelsen af ​​M2, men ikke M1, blev reduceret med enten propofol eller UGT1A siRNA transfektion i HT29-celler (figur 3B og 3C, tabel 2). Både propofol og UGT1A siRNA faldt betydeligt dannelsen af ​​TSA glucuronider M1 og M2 i dyrkningsmediet (figur 3D og 3E, tabel 2).

HT29 celler blev forbehandlet med UGT1A siRNA eller vehikel i 48 timer, eller forbehandlet med propofol (100 uM) i 1 time. Derefter blev cellerne eksponeret for TSA (20 uM) i 0,5, 2, 6, 24 og 48 timer og prøver af både dyrkningsmediet og cellerne blev opsamlet og forberedt til HPLC-analyse. TSA og dets glucuronider (M1 og M2) blev påvist med metoden baseret på vores tidligere rapport [24]. (A) intracellulær TSA af HT29 eller HCT116-celler; (B) intracellulære M1 af HT29-celler; (C) intracellulær M2 af HT29-celler; (D) M1 i HT29 cellekulturmedium; (E) M2 i HT29 celledyrkningsmedium. Data er vist som gennemsnit ± SD af mindst tre uafhængige forsøg.

UGT1A Formindsker TSA-induceret ROS Formation

Vi har tidligere vist, at TSA gennemgår NQO1 stofskifte til at producere et meget ustabilt catechol mellemprodukt, der kunne enten konjugeres af UGT’er eller spontant vendt tilbage til forælder TSA at danne en nytteløs redox cyklus med store mængder af ROS produktion [23]. Desuden fandt vi, at TSA produceret et betydeligt niveau af ROS i NSCLC celler, en NQO1 positiv og UGT negative cellelinje [25]. Vi således begrundet, at i nærværelse af UGT1A kan TSA-udløste redox cyklus ændres til metabolisk eliminering og derved reducere produktionen af ​​ROS. For at undersøge denne hypotese, blev DCF-farvning-assay udført for at overvåge TSA-induceret ROS-dannelse. TSA induceret dosisafhængig dannelse af ROS i HCT116-celler (figur 4A). Imidlertid blev disse ændringer i ROS-dannelse ikke observeret i HT29-celler (figur 4B). Når propofol blev anvendt til at inhibere UGT1A9-aktivitet i HT29-celler, blev TSA-induceret ROS niveau steg betydeligt med ca. 3,6 gange ved 40 uM TSA, og denne stigning blev vendt ved NAC (figur 4B). I modsætning hertil propofol ikke ændre TSA-induceret ROS niveau i HCT116-celler, men kombinationen af ​​NAC stadig faldt TSA-induceret ROS niveau (figur 4A). Desuden UGT1A siRNA transfektion også signifikant forøget ROS-niveauer med 2,0 gange ved 40 pM i HT29-celler (figur 4C). Salg

Celler blev forbehandlet med UGT1A siRNA eller uspecifikt siRNA (negativ kontrol) i 48 timer eller forbehandles med propofol (100 uM) /NAC (5 mM) i 1 time. Derefter blev cellerne eksponeret for TSA (5, 20, 40 uM) i 1 time og behandles efterfølgende med DCFH-DA. Fluorescensintensiteten blev målt ved et fluorimeter. (A) HCT116-celler; (B) og (C) HT29-celler. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SD af mindst fire uafhængige forsøg (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, TSA behandling vs kontrolceller;

# P 0,05,

# # P 0,01,

### P. 0,001, propofol /NAC forbehandling vs TSA kun, eller UGT1A siRNA forbehandling vs negativ kontrol siRNA forbehandling)

UGT1A Årsager modstandsbevægelsen for tyktarmskræft celler til TSA cytotoksicitet

Overskydende ROS kan inducere forstyrrelse af intracellulær redox homeostase, og irreversible oxidative modifikationer af lipid, protein eller DNA, efterfølgende fremme celle apoptotisk død via både død receptor og mitokondrier-medierede pathways [29 ]. Vi har for nylig valideret, at TSA-induceret cytotoksicitet er ROS afhængig [25]. Idet tilstedeværelsen af ​​UGT1A i HT29-celler kompromitteret produktionen af ​​ROS, foreslår vi, at ekspressionen af ​​UGT1A gener ville forøge resistensen af ​​cancerceller til TSA-induceret cytotoksicitet. Til dette formål blev MTT assay udført i både HT29 og HCT116 celler. Resultaterne viste, at TSA produceret dramatiske cytotoksicitet i HCT116-celler udtrykker ikke UGT1A med en IC

50 værdi på 4,5 ± 0,4 uM (figur 5A). I modsætning hertil HT29-celler, der udtrykker rigelige UGT1A enzymer, fandtes meget modstandsdygtige over for TSA cytotoksicitet med en IC

50 værdi på 54,3 ± 4,7 pM (figur 5B). Forbehandling med propofol til at inhibere UGT1A9 aktivitet signifikant øget TSA cytotoksicitet i HT29-celler med en IC

50 værdi på 29,9 ± 4,5 pM (figur 5B), som blev vendt ved kombinationen af ​​NAC (IC

50 80 uM) . I HCT116-celler, blev propofol-forstærket TSA cytotoksicitet ikke observeret, men NAC kombination forårsagede høj TSA modstand (figur 5A). Tilsammen tyder disse resultater på, at virkningen af ​​propofol i HT29-celler er fra inhiberingen af ​​UGT1A9 og dermed fremme forgæves redox cyklus af TSA. Konsekvent, UGT1A siRNA transfektioner forbedret også den cytotoksiske virkning af TSA i HT29 celler og signifikant reducerede IC

50 værdi til 25,9 ± 5,6 pM (figur 5C). Salg

Celler blev forbehandlet med UGT1A siRNA eller ikke- specifik siRNA (negativ kontrol) i 24 timer, eller forbehandles med propofol (100 uM) /NAC (5 mM) i 1 time. Derefter blev cellerne eksponeret for gradient koncentrationer af TSA (2,5-80 uM for HT29; 0,5-40 uM for HCT116) til angivet tid og MTT-assayet blev udført. (A) HCT116-celler; (B) og (C) HT29-celler. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SD af mindst fire uafhængige forsøg (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001)

UGT1A kompromiser TSA-induceret apoptose i Colon. cancer Cells

for yderligere at udforske den rolle, samlede UGT1A og UGT1A9 i TSA-medieret anti-cancer aktivitet, blev celle apoptotisk død undersøgt af Annexin V-FITC /PI farvning assay. Når HT29 celler blev udsat for den angivne koncentration af TSA i 72 timer, var der nogle påviselige apoptotiske celler (figur 6B). Imidlertid blev apoptotisk død observeret i HCT116-celler efter 48 timers TSA eksponering i en dosis-afhængig måde. Apoptotisk celledød var 20,7 ± 1,7%, 30,8 ± 2,4%, og 48,7 ± 3,0% med TSA koncentrationer på 5, 20 og 40 uM (figur 6A). Propofol (100 uM) signifikant restaureret modtagelighed HT29-celler til TSA-induceret apoptotisk død, fra de basale apoptotiske niveauer til et apoptotisk forhold på 27,8 ± 4,5%, 45,0 ± 3,5%, og 53,5 ± 14,7% ved 5, 20, og 40 uM TSA henholdsvis (figur 6B). Propofol-forstærket apoptose blev ikke observeret i HCT116 celler (figur 6A). Tilsvarende UGT1A siRNA transfektion øget TSA-induceret celle apoptose i HT29-celler, der karakteriserer med 16,2 ± 1,4%, 40,3 ± 4,3%, og 48,5 ± 3,2% apoptotiske celler ved TSA koncentrationer på 5, 20, og 40 uM (figur 6C ).

Celler blev forbehandlet med UGT1A siRNA eller uspecifikt siRNA (negativ kontrol) i 72 timer, eller forbehandles med propofol (100 uM) i 1 time. Derefter blev cellerne eksponeret for TSA (5, 20, 40 pM) til angivet tid og opsamlet. Celler blev farvet ved Annexin V-FITC /PI og undersøges ved en flowcytometri. (A) HCT116-celler; (B) og (C) HT29-celler. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SD af mindst tre uafhængige forsøg (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, TSA behandling vs kontrolceller;

# P 0,05,

# # P 0,01,

### P. 0,001, propofol forbehandling vs TSA kun, eller UGT1A siRNA forbehandling vs negativ kontrol siRNA forbehandling)

diskussion

Mange anti -cancer midler er substrater for UGT’er, og af denne grund har den funktionelle betydning af UGT’er i forårsager kemoterapeutisk modstand blevet et vigtigt anliggende. På trods af tidligere bestræbelser på at løse dette vigtige spørgsmål, er lidt kendt om den direkte virkning af UGT’er udtrykt i tumorvæv /celler ved fastsættelsen af ​​den intracellulære akkumulering og den deraf anticancer effekt af sådanne midler, der er UGT’er ‘substrater. Vi viser i den foreliggende undersøgelse, at ekspressionsniveauet af UGT1A, særlig UGT1A9, er en vigtig faktor for intracellulære akkumulering og den apoptotiske virkning af TSA i humane coloncancer-celler.

Vores tidligere undersøgelse identificeret, UGT1A isoformer, herunder UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A10, særlig UGT1A9, er de dominerende enzymer involveret i glukuronidering af TSA følgende sin reduktion af NQO1. Selv UGT2B7 kan være involveret i produktionen af ​​M1 og bidrage til den samlede glukuronidering af TSA, CL

int (M1 + M2) værdien af ​​UGT1A9 var meget højere end for UGT2B7 [24]. Og i HT29-celler, den basale ekspression af UGT2B7 er meget lavere end UGT1A9 (fig S1). Baseret på dette fund blev det silencing af UGT1A af UGT1A siRNA og inhiberende af UGT1A9 ved propofol undersøgt i TSA metabolisme og toksicitet i den foreliggende undersøgelse.

HT29-celler har tilstrækkelig UGT enzymaktivitet til glucuronidate TSA i både S9 fraktioner og levende celler (figur 1, 2, 3).