PLoS ONE: Undertrykkelse af MAPK Signaling og Tilbageførsel af mTOR-Dependent MDR1-associerede multiresistens af 21α-Methylmelianodiol i lungekræft Cells

Abstrakt

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan og rester den mest udbredte. Samspil mellem PI3K /AMPK /AKT og MAPK veje er en afgørende effektor i vækst lungekræft og progression. Disse signaler transduktion proteinkinaser tjene som gode terapeutiske mål for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som omfatter op til 90% af lungecancere. Her beskrev vi, om 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD), en aktiv triterpenoid derivat af

Poncirus trebladede

, kan vise kræft egenskaber ved at regulere disse signaler og modulere forekomsten af ​​multiresistens i NSCLC celler. Vi fandt, at 21α-MMD hæmmede væksten og kolonidannelse af lungecancerceller uden at påvirke den normale lunge-fænotype. 21α-MMD ophævede også den metastatiske aktivitet lungekræft celler gennem hæmning af celle migration og invasion, og induceret G

0 /G

1 cellecyklusstop med øget intracellulær ROS generering og tab af mitokondrie membran integritet. 21α-MMD reguleret udtrykkene for PI3K /AKT /AMPK og MAPK signalering som kørte os til yderligere at evaluere sine aktiviteter på multiresistens (MDR) i lungekræft celler ved at angive på P-glycoprotein (P-gp) /MDR1-forening. Anvender de etablerede paclitaxel-resistente A549 celler (A549-PacR), vi yderligere fundet, at 21α-MMD inducerede en MDR vending aktivitet gennem hæmning af P-gp /MDR1 udtryk, funktion, og transskription med genvandt paclitaxel følsomhed, som kan hængigt korrelere til regulering af PI3K /mTOR-signalvejen. Tilsammen disse resultater viser for første gang, den mekanistiske evaluering

in vitro

af 21α-MMD viser vækst-hæmmende potentiale med indflydelse på MDR vending i humane lunge kræftceller.

Henvisning : Aldonza MBD, Hong JY, Bae SY, Song J, Kim WK, Oh J, et al. (2015) Undertrykkelse af MAPK Signaling og Tilbageførsel af mTOR-Dependent MDR1-associerede multiresistens af 21α-Methylmelianodiol i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 10 (6): e0127841. doi: 10,1371 /journal.pone.0127841

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: August 28, 2014 Accepteret: April 21, 2015; Udgivet: 22 juni 2015

Copyright: © 2015 Aldonza et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en bevilling (2005 og 12172MFDS989) fra Ministeriet for Food and Drug Safety og National Research Foundation Korea (NRF) tilskud finansieret af den koreanske regering (MEST) (nr 2009 til 0.083.533)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den mest almindelige kræftform i verden i årtier, og det tegner sig for ca. 1.380.000 dødsfald hvert år for både mænd og kvinder i USA alene. Prognosen er forbundet med sygdommen er meget dårlig forsinke diagnosen indtil sene fremskredne stadier og behandlingsmuligheder er begrænsede, hvilket resulterer i næsten 90% dødeligheden på grund af behandlingssvigt forårsaget af uopdaget metastaser progression [1]. Naturlige produkter er blevet brugt som medicinske lægemidler i århundreder med så mange som 70% af alle lægemidler, der er godkendt til klinisk kemoterapi samt for lungekræft behandling mellem 1981 og 2002, der består af enten naturlige produkter eller kemiske og syntetiske derivater baseret på naturlige produkter. [2]. Imidlertid er den mekanisme, hvorved de fleste naturlige produkter udviser deres terapeutiske potentiale mindre godt forstået. Triterpenoids har taget en stigende opmærksomhed sidst i lungekræft terapi på grund af deres rapporterede kemoforebyggende og terapeutiske potentiale både

in vitro

og

in vivo

[3,4]. 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD) er en naturlig triterpenoid og en isomer af 21-methylmelianodiols først isoleret fra frugterne af

Poncirus trifoliata

(Rutaceae), som længe har været anvendt i orientalsk medicin som et middel mod allergisk betændelse. I de seneste rapporter, 21α-MMD viste funktionelle anti-inflammatoriske aktiviteter [5]. Imidlertid har der ikke været nogen rapport yderligere vurdere dens anticancer potentiale og virkningsmekanisme i lungekræft.

Kræft overlevelse-associeret signalveje, herunder phosphoinositid 3-kinase (PI3K) /AKT /pattedyr mål for rapamycin (mTOR ) og mitogenaktiverede proteinkinase (MAPK) og cancermetastase-associeret AMPK baner spiller afgørende roller i reguleringen af ​​lægemiddelinducerede funktionelle aktiviteter såsom DNA-beskadigelse-induceret apoptose, cellevækstinhiberingen, og anti-metastatiske /progression forsyningsselskaber [6 , 7], med udtalt afgørende funktionel regulatorisk aktivitet i lungekræft celledeling og overlevelse [8]. De nøjagtige molekylære mekanismer, der er ansvarlige for de fleste af triterpenoid-induceret anticancer aktiviteter, der omfatter disse klassiske veje er endnu ikke klarlagt i detaljer for yderligere at indarbejde terapeutiske strategier for bedre resultater.

En anden afgørende årsag til behandlingssvigt i lungekræft er forekomsten af ​​multiresistens (MDR), den vigtigste mekanisme, ved hvilken mange cancere bliver resistente over for et bredt spektrum af kemoterapeutika. PI3K /AKT og MAPK’er signalering har været bredt involveret i udviklingen af ​​MDR i lungekræft. Stimulering af disse veje gør lunge tumorceller resistente over for cytotoksiske kemoterapeutiske lægemidler såsom paclitaxel, for yderligere at påvirke cellulær funktion [9,10]. Følsomhed over for forskellige kemoterapeutiske midler varierer meget fra patient til patient. Men man kan molekylære mekanisme påpeges til effektivt at designe rationale kemoterapeutiske kombinationsbehandlinger, der er ved at målrette MDR1 (ABCB1) gen kodet P-glycoprotein (P-gp), er ansvarlig for at pumpe ud en række miljøfremmede stoffer og endogene stoffer indefra til den ekstracellulære region af cellerne [11]. De seneste beviser har understreget samspillet mellem mTOR signalering og P-gp /MDR1-medieret MDR i hepatocellulære karcinomer og kolorektal cancer [12,13]. Disse slags foreninger har ført til funktionelt karakterisere potentielle reguleringsmekanisme målrette PI3K /AKT og MAPK’er vej og efterfølgende nedskrivning af P-gp-aktivitet [14,15]. Desuden har en række undersøgelser også foreslået at udvikle lægemidler baseret fra flavonoider og triterpenoids der kan målrette disse signaler til senere form, en kategori af P-gp-hæmmere og øge aktiviteten af ​​flere anticancer lægemidler, såsom paclitaxel og doxorubicin [16 -18].

formålet med denne undersøgelse var derfor at mekanistisk identificere virkemåde af 21α-MMD på humane NSCLC celler og yderligere relatere sin reguleringsmekanisme på cellevækst og overlevelse-relaterede signaler såsom PI3K /AKT /AMPK og MAPK’er med P-gp /MDR1-associeret MDR forekomst i en lungekræft fænotype. Karakterisering af de virkningsmekanismer af 21α-MMD kan føre til nye indsigter af terapeutisk udvikling for at bekæmpe vækst, metastatisk aktivitet, samt forekomsten af ​​MDR i humane lungekræft.

Materialer og Metoder

Reagenser

trichloreddikesyre (TCA), (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), sulforhodamin B (SRB), propidiumiodid (PI ), RNase A, paclitaxel, 5-fluorouracil (5-FU), muse monoklonalt anti-β-actin-antistof, dichlor-dihydro-fluoresceindiacetat (DCFH-DA), rhodamin-123, krystalviolet, N-acetyl-L- cystein (NAC), og andre reagenser, medmindre andet er angivet blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, USA). RPMI 1640-medium, føtalt bovint serum (FBS), antibiotisk-antimykotisk opløsning og trypsin-EDTA blev købt hos Invitrogen (Grand Island, NY, USA). mus monoklonale anti-phospho-ERK (Tyr 204), anti-c-myc, og kanin polyklonalt anti-cyclin A, anti-cyclin B1, anti-cyclin E, anti -CDK2, anti-CDK4, anti-Rb og anti-phospho-Rb, anti-ERK 1/2, anti-p38 MAPK, anti-phospho-Akt, anti-Akt, anti-phospho-mTOR, anti-mTOR blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Muse monoklonalt anti-phospho-JNK /SAPK (Thr 183 /Tyr 185), anti-JNK /SAPK, anti-phospho-p38 (Thr 180 /Tyr 182), anti-AMPK, anti-phospho-AMPKα (Thr 172), anti-PI3K, og anti-phospho-PI3K p85 (Tyr 458) blev erhvervet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Alexa Fluor 488-mærket kylling anti-kanin IgG blev indkøbt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Muse monoklonalt anti-P-gp og fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket monoklonalt anti-P-gp blev indkøbt fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Den kationiske lipofile farvestof tetramethylrhodamin ethylester (TMRE) blev indkøbt fra Molecular Probes (OR, USA). ON-TARGETplusTM (SMARTpool) mTOR og kapløbet siRNA’er blev købt fra Thermo Scientific-Dharmacon RNAi Technologies (Suwanee, GA, USA). Testforbindelsen, 21α-MMD, blev isoleret fra frugterne af

Poncirus trifoliata

som tidligere beskrevet [19] og leveret af Dr. S. H. Lee, en medforfatter, ved College of Pharmacy, Yeungnam University, Korea.

cellelinier og dyrkningsbetingelser

Humane lunge kræftceller (A549, H460, H1299 H358, og H292) , humane normale lungeceller (L132 og MRC-5), humane brystcancerceller (MDA-MB-231), human duktale breast epithelial tumorceller (T47D), human lever cancerceller (SK-HEP-1) og human gastrisk kræftceller (SNU-638) blev leveret af den koreanske cellelinje Bank (Seoul, Korea). Paclitaxel-resistente A549 celler (A549-PacR) blev udviklet af vores gruppe fra forældrenes A549 celler gennem vedvarende udsættelse for gradvist stigende koncentrationer af paclitaxel opretholde kontinuerlig vækst og fine forældrekontrol-lignende morfologi [20]. Cellerne blev dyrket i DMEM (for MRC-5, MDA-MB-231, og SK-HEP-1-celler) og RPMI-1640 (for A549, A549-PacR, H358, H1299, H460, H292, T47D, og ​​SNU -638 celler) suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS og antibiotika-antimykotika (PSF; 100 enheder /ml penicillin G natrium, 100 ug /ml streptomycin og 250 ng /ml amphotericin B). Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C og 5% CO

2 i en fugtig atmosfære.

celleproliferationsassays Salg

celleproliferation blev vurderet ved anvendelse MTT kolorimetrisk assay bortset fra den indledende screening af anti-proliferative aktivitet af

P

.

trifoliata

aktive forbindelser, som blev udført af SRB assay. Celler blev podet ved en densitet på 3 til 5 x 10

4 celler per brønd i plader med 96 brønde med et totalvolumen på 200 pl /brønd og fik lov til at vedhæfte natten over. Efter 24 timers inkubation celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af 21α-MMD, H

2O

2, narkotika, som individuelle eller i kombination, eller DMSO kontrol kontinuerligt ved de angivne tidsforløb. Efter behandling blev cellerne fikseret med 10% TCA-opløsning og blev udsat for SRB eller MTT-assays. For MTT-assayet blev celler inkuberet i MTT (0,5 mg /ml) indeholdende dyrkningsmedium ved 37 ° C i 4 timer. Supernatant medium blev fjernet, og DMSO (200 pi) blev tilsat til hver brønd og blandet fuldstændigt at opløse MTT. For SRB-assayet blev celler inkuberet med 0,4% SRB opløsning i 30 min. Den ubundne SRB blev fjernet hurtigt ved vask af brøndene fem gange med 1% eddikesyre og derefter lufttørret. 100 pi Tris-puffer (0,01 M, pH 10,4) blev tilsat og rystet forsigtigt i 5 minutter på en mekanisk ryster. Absorbans blev målt ved 570 nm for MTT-assay, mens 515 nm for SRB-assay med blød baggrund subtraktion ved 650 nm (nul dag eller replikere kontrol) ved Versamax mikropladelæser (Molecular Devices Inc., Toronto, Canada). Absorbansværdier blev udtrykt som en procentdel af det for ubehandlet eller DMSO kontrolceller, og koncentrationen af ​​testede lægemidler, der blev beregnet ved formlen% levedygtighed = ((Ave. Abs.Drug-Ave.Abs.Zero Day) /(Ave. Abs.Control-Ave. Abs.Zero Day)) x 100. IC

50 værdier blev beregnet som det stof, der hæmmer celledeling med 50% sammenlignet med kontrol ved hjælp af ikke-lineær regressionsanalyse (procent overlevelse vs. koncentration) . Alle eksperimenter blev udført under anvendelse af fire gentagelser og gentaget mindst tre gange i en parallel måde i hvert lægemiddel /forbindelseskoncentration.

kolonidannelse Assay

Monolag af celler blev behandlet i 20 timer med 21α- MMD ved forskellige koncentrationer, og derefter høstet, talt og podet til 24-brønds plader ved en densitet på 1.500 celler pr. Efter én til halvanden uger blev adhærerende makroskopiske kolonier vasket med PBS, fikseret under anvendelse af 2% paraformaldehyd og farvet med krystalviolet (0,5% vægt /volumen) og derefter talt visuelt eller ved hjælp af Image J software.

lægemiddelkombination Analyse

celler blev podet ved en densitet på 5 x 10

4 celler per brønd i 96-brønds plader med stigende koncentrationer af 21α-MMD, paclitaxel, og 5-FU, enten alene eller i kombination på deres ækvipotent molforhold samtidigt. Vækstinhiberende aktivitet af kombinationerne blev målt ved MTT-assayet. De kombinerede virkninger blev analyseret ved anvendelse midterplan virkning analysemetoden og ved beregningen af ​​kombinationen (CI) ved anvendelse af ligningen: CI = D

1 /(D

x)

1 + D

2 /(D

x)

2, hvor D

1 og D

2 er koncentrationerne af kombineret forbindelse, og stof, der opnåede den forventede effekt, og (D

x)

1 og (D

x)

2 er de koncentrationer, der opnås tilsvarende virkninger, når forbindelserne anvendes alene. 50% inhibering blev valgt som indikator for effektivitet. Den beregnede CI blev derefter sammenlignet med rapporterede referenceværdier [21].

Cell Cycle Analysis og BrdU Indbygning Assay

Analyse om virkningerne af 21α-MMD på cellecyklusfordeling blev udført af metoden tidligere beskrevet [22]. Celler blev behandlet med eller uden 21α-MMD i 24 timer i 10% FBS-suppleret medium. Cellerne blev høstet, vasket to gange og fikseret i 70% kold ethanol natten over ved -20 ° C. Ethanol-fikserede celler blev pelleteret, vasket med iskold PBS og resuspenderet i farvningsopløsning indeholdende 50 ug /ml PI, 0,1% Triton-X-100, 0,1% natriumcitrat, og 100 ug /ml RNase. Efter 1 h inkubation ved stuetemperatur i mørke blev fluorescensaktiveret celler sorteret og cellulært DNA-indhold analyseredes ved flowcytometri under anvendelse af FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) udstyret med en argon laser og data blev vurderet ved anvendelse af CellQuest 3.0.1 software (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Mindst 20.000 celler blev anvendt til hver analyse. Ændringer i den procentdel af cellefordeling i hver fase af cellecyklussen blev bestemt og resultaterne vises som histogrammer. Andelen af ​​celler i forskellige faser af cellecyklussen blev derefter optaget med mindst tre eksemplarer og udtrykt som gennemsnit ± SD. Desuden blev en colometric BrdU-inkorporering assay (Abcam) udført for at måle hastigheden af ​​DNA-syntese. Kort beskrevet blev celler behandlet med eller uden 21α-MMD i 24 timer i det samme medium som ovenfor. BrdU sættes til celler dyrket i mikroplader efterfulgt af 4 timers inkubering at inkorporere BrdU i DNA’et i prolifererende celler. Kultursupernatant blev fjernet efterfulgt af fiksering. Celler blev derefter inkuberet med et anti-BrdU-antistof konjugeret til peroxidase. Bundet BrdU detekteres af en substratreaktion og kvantificeres ved absorbansmålinger ved 350 nm.

Måling af intracellulær ROS

Intracellulær ROS blev målt ved flowcytometri (Becton Dickinson, FACSCalibur) som tidligere beskrevet [ ,,,0],23]. Kort fortalt blev cellerne podet ved en tæthed på 1 x 10

4 celler /ml i steril 60 mm skål i 24 timer og blev behandlet med eller uden 21α-MMD i 24 timer for at detektere ROS ændringer. Celler blev høstet og vasket to gange og farvet med 1 ml DCFH-DA ved 10 uM koncentration, der blev anvendt som probe til at vurdere ROS-produktion. Celler blev derefter inkuberet ved 37 ° C i 40 min og den maksimale excitationsbølgelængde for oxideret DCFH-DA ved 488 nm med emission ved 525 nm blev analyseret ved flowcytometri. ROS-produktion blev udtrykt som gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) beregnet gennem Cell Quest software. Påvisning af ROS blev også undersøgt ved fluorescensmikroskopi. Kort beskrevet blev celler podet med en densitet på 5 x 10

4 celler /ml i dækglas af skåle og inkuberet natten over til fastgørelse. Cellerne blev derefter behandlet med forskellige koncentrationer af 21α-MMD eller NAC, enkeltvis eller i kombination, i 24 timer ved 37 ° C. Dækglas blev fjernet fra fade og celler blev farvet med 40 pM DCFH-DA i 40 min. Cellerne blev vasket med PBS to gange for at fjerne overskydende farve. Dækglas blev monteret på objektglas og billeder blev taget med et fluorescens mikroskop ved 200X forstørrelse.

Måling af mitokondrie transmembranpotentialeændring (Δѱm)

Ændringer i mitokondrie potentiale blev vurderet ved hjælp af fluorescerende potentiometrisk farvestof TMRE. Den kationiske lipofile farvestof TMRE virker ved at indtaste cellen i form af en ester, som efterfølgende hydrolyseres og omdannes til tetramethylrhodamin, som er reversibelt akkumuleret i negativt ladede mitokondrielle matrix afhængigt mitokondrisk transmembranpotentiale udviser potentiale-afhængig akkumulering i mitokondrier. For at analysere Δѱm efter 21α-MMD behandling blev cellerne vækst ved en densitet på 1 x 10

5 celler per brønd i 24 timer i 24-brønds steril dyrkningsplade behandlet med eller uden 25 uM 21α-MMD i 24 h. Tyve minutter før slutningen af ​​inkubationsperioden blev cellerne vasket med PBS og TMRE farvestof ved 100 nM blev påsat i 10 minutter ved 37 ° C. Celler blev trypsinbehandlet og høstet med kold PBS efterfulgt af måling af fluorescensintensiteten ved flowcytometri (Becton Dickinson, FACSCalibur) og analyseret under anvendelse af CellQuest 3.0.1 software.

Cell Migration og invasion assays Salg

Ændringer i celle migration blev bestemt og transwell analyser uden inkorporering af matrigel. For migration transwell assay blev celler podet på de øvre kamre i 24-transwell plader med 200 uL medium serum udsultet (uden FBS). Efter behandling med forskellige midler blev cellerne efterladt overtid til at migrere til de nedre kamre indeholdende 800 pi medium med 10% FBS for at inducere kemotaxi. Migrerede celler blev visualiseret ved farvning med krystalviolet (0,5% vægt /volumen) efter vask med PBS og fiksering med methanol. Billeder blev taget og analyseret ved hjælp JULI FL mikroskop hjulpet med Image J software. Celleinvasion assay blev udført i 24-brønds plader transwell med polycarbonat (PVDF) filtre (8 um porestørrelse, Corning, USA). Matrigel blev fortyndet til 1 mg /ml med serumfrit dyrkningsmedium og anvendt på indsatsen i de øvre kamre i flerbrøndspladens for invasion assayplade. Celler med en densitet på 2 x 10

4 celler per brønd blev podet ind i det øvre kammer i transwell enhed i 200 pi serumfrit dyrkningsmedium. Det nedre kammer af enheden blev tilsat 800 pi dyrkningsmedium suppleret med 10% FBS for kemotaxi induktion. Efter inkubation med eller uden 21α-MMD (5 uM; IC

50) i 24 timer ved 37 ° C blev mediet i det øvre kammer suges ud, og en vatpind blev anvendt til at fjerne cellerne på oversiden af membranen. Celler, som invaderede til undersiden af ​​membranen blev farvet med krystalviolet (0,5% vægt /volumen) og visualiseret og scoret under JULI FL mikroskop. Alle resultater er udtrykt som procent af migrerede eller invaderede celler i sammenligning med kontrolgruppen (ubehandlede celler).

Rhodamin-123 (Rho-123) Ophobning Assay

Ændringer i efflux funktion P-gp i A549-PacR celler blev bestemt parallelt med ændringer i ophobningen af ​​Rho-123 farvestof. Celler blev podet i 30 mm skåle ved en densitet på 1 x 10

5 celler pr skål. Cellerne blev forbehandlet med forskellige koncentrationer af 21α-MMD for 24 og 48 timer. 0,5% DMSO blev anvendt som kontrol. Efter forbehandling blev cellerne inkuberet med 1 ug /ml Rho-123-farvestof i dyrkningsmedium ved 37 ° C og 5% CO

2 i mørke i 90 min. Efter Rho-123 akkumulering blev cellerne trypsiniseret fra subkonfluent monolag af celler i dyrkningsskåle, og cellepelleten blev vasket to gange med iskold PBS. Cellerne blev derefter analyseret straks ved hjælp FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) udstyret med en 488 nm argon-laser. Koncentrationen af ​​Rho-123 i hver prøve blev bestemt ud fra fluorescensmålingerne ved bygning af Rho-123 standardkurve. Koncentrationen af ​​intracellulært Rho-123 blev normaliseret ved mængden af ​​protein og udtrykt som nmol /g protein. Den grønne fluorescens af Rho-123 blev målt under anvendelse af et 530 nm båndpasfilter [24]. Den efflux funktion af P-gp blev overvåget med hensyn til fald i eksport af Rho-123 med inkorporering af forældrenes A549 celler anvendt som negativ kontrol.

Immuncytokemi

P-gp lokalisering, immunofluorescens, og DNA fluorescerende observation i A549 /A549-PacR celler blev observeret ved anvendelse af Zeiss LSM 780 ApoTome mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland). De A549 /A549-PacR celler blev udsået i 30 mm skåle med rutschebaner og inkuberet natten over. Cellerne blev forbehandlet med forskellige koncentrationer af 21α-MMD eller stoffri medium i 48 timer. Alle vaskninger blev udført med PBS, og alle inkubationer blev gennemført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Cellerne blev vasket to gange. Efter behandling inkubation blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd (i PBS) i 15 minutter og derefter blokeret med 1% BSA (i PBS) i 1 time ved stuetemperatur, blev cellerne inkuberet med P-glycoprotein primært antistof ved 4 ° C natten, vaskes derefter i yderligere to gange. Permeabilisering med Triton X-100 var ikke inkluderet, da målproteinet, P-gp, er et transmembrant protein. Efter inkubation natten over blev cellerne inkuberet med FITC-konjugeret sekundært antistof i 2 timer ved stuetemperatur. DAPI (0,5 ug /ml) blev anvendt til kontrastfarve kernerne og opbevaret ved 4 ° C før mikroskopi.

proteinlysater, Western blotting og Immunpræcipitation Salg

Celler blev podet i sterile 100 mm skåle i 24 eller 48 timer og blev udsat for forskellige koncentrationer af 21α-MMD. For at bestemme niveauerne af målprotein udtryk blev helcelleekstrakterne fremstillet. Behandlet eller ikke-behandlede celler blev lyseret, og proteinet kvantificeringer blev bestemt ved anvendelse af Bradford-assayet [25]. Proteiner blev isoleret ved lysis buffer (Beyotime, Kina) [20 mmol /L Tris (pH 7,4), 250 nmol /l NaCl, 2 mmol /L EDTA (pH 8,0), 0,1% Triton X-100, 0,01 ug /ml aprotinin , 0,005 ug /ml leupeptin, 0,4 mol /l phenylmethylsulfonylfluorid, og 4 mmol /L Navo

4] efterfulgt af spinding af lysater ved 14.000 rpm i 10 min ved anvendelse af Thermo Sorvall Legend Micro 21R kølecentrifuge (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) for at fjerne uopløseligt materiale og målt ved anvendelse af NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo, USA). Cellerne blev sprængt ved sonikering og ekstraheret ved 4 ° C i 30 min. Homogenaterne blev centrifugeret ved 14.000 rpm i 30 minutter til fjernelse af mitokondrier og andre uopløselige fragmenter og supernatanter blev derefter igen centrifugeret som ovenfor for at sikre fuldstændig fjernelse af mitokondrier. Supernatanter fra helcellelysater blev opsamlet og opbevaret ved -80ºC. Det totale protein (100 ug) i hvert cellelysat blev løst i forskellige procentdele af geler matchet med molekylvægtene af proteinmål ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og blev elektro-overført til PVDF nitrocellulosemembraner. Membranerne blev inkuberet med blokeringsbuffer (5% fedtfri tørmælk i phosphatpufret saltvand-0,1% Tween 20, PBST, pH 8,0) i 2 timer ved stuetemperatur og blev yderligere inkuberet med specifikke antistoffer fortyndet i TBST natten over ved 4 ° C . Efter vask med TBST tre gange, blev membranerne inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Visualisering af de immunkomplekser blev udført ved hjælp af PowerOpti-ECL-kit (Animal Genetics Inc., Korea) og en LAS 4000 Imager (Fuji Film Corp., Tokyo, Japan).

RNA Extraction og Real-Time Reverse transkription-PCR

RT-PCR og real-time RT-PCR blev udført for at evaluere MDR1-mRNA, cyclin E og CDK2 mRNA genekspressioner efter behandling med eller uden 21α-MMD eller siRNA som angivet. Celler ved en densitet på 1 x 10

5 celler /skål i 100 mm skåle blev behandlet med 21α-MMD for forskellige tidsforløb. Efter inkubation blev cellerne vasket to gange med PBS, og derefter lyseret med TRI-reagens til indledende RNA isoleret trin. RNA’et blev ekstraheret ved tilsætning af chloroform, og det isolerede RNA blev udfældet med isopropylalkohol. RNA-pellets blev vasket med 70% ethanol, lufttørret og derefter opløst i nuklease-frit vand. Absorbansen blev målt ved 260 og 280 nm til bestemmelse af koncentrationen og renheden af ​​RNA. Det totale RNA (1 til 2 ug) blev revers transkriberet under anvendelse af AMV-revers transkriptase og oligo (dT) 15-primer. En polymerasekædereaktion (PCR) blev udført i en reaktionsblanding indeholdende cDNA, 0,2 mM dNTP-blanding, 10 pmol af target-specifikke primere med sekvenser, der er opført som følger: MDR1 (fremadrettet: 5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′, bagside: 5′ -GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3′), mTOR (frem: 5′-ACTCGCTTCTATGACCAACTGA-3′; omvendt: 5′-TTGAAGGTCTCAAACATGAT-3′), cyklin E (frem: 5′-CGGGTCCACAGGATGCGAAGGA-3′; omvendt: 5′-CAGGTGTGGGGATCAGGGAGCA- 3′), CDK2 (frem: 5′-CATTCCTCTTCCCCTCATCA-3′; omvendt: 5′-CAGGGACTCCAAAAGCTCTG-3′) og 0,25 U Taq DNA-polymerase hjælp GeneAmp PCR-system 2400 (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) til amplificere cDNA’et. Tærskelcyklen (CT) blev bestemt. De relative mRNA-ekspressionsniveauer blev normaliseret til enten β-actin (fremadrettet: 5′-AGGCACCAGGGCGTGAT-3′; revers: 5′-GCCCACATAGGAATCCTTCTGAC-3′) eller GAPDH (fremadrettet: 5′-ATCCCATCACCATCTTCCAG-3′, bagside: 5′ -CCATCACGCCACAGTTTCC-3 ‘) som angivet, ved at dividere den med de gennemsnitlige Ct-værdier for den interne kontrol for at prøve (Δ-Ct). De normaliserede transkriptniveauer blev udtrykt i forhold til prøven opnået fra DMSO-kontrol (ΔΔ – Ct), og den relative RNA ekspressionsniveauet blev præsenteret som 2-Δ-Ct [26]. PCR-produkterne blev separeret ved 2% agarosegelelektroforese. Gelen blev farvet med 10.000-fold-fortyndet SYBR sikker farvningsopløsning og visualiseret under en UV-transilluminator (Alpha ImagerYM, Alpha Innotech Corp., USA). Real-time PCR blev udført under anvendelse af et MiniOpticon-system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), ved anvendelse af 5 pi revers transkriptionsprodukt, 10 pi iQTMsupermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), 0,5 pi primere og prober i et samlet volumen på 20 pi. Standard thermocycler betingelser var ansat som følger: 95 ° C i 5 min før den første cyklus, 95 ° C i 10 sek, 56 ° C i 30 sek, gentaget 40 gange

Transient transfektion af små interfererende RNA. (siRNA)

lyddæmpning af mTOR med siRNA (25 nM) blev opnået ved hjælp af DharmaFECT transfektionsreagenser efter instruktions manual for kortvarig transfektion i A549-PacR celler. Scramble siRNA (25 nM), der anvendes som kontrol, blev også leveret. Reagensblandingen blev tilsat til hver brønd pr skål indeholdende 200 pi serum-frit og antibiotikum-frit medium i et samlet volumen på 300 pi, og cellerne blev inkuberet i 4 timer ved 37 ° C. Et tilsvarende volumen af ​​medium blev derefter tilsat til hver brønd. Efter transfektion i 24 timer efter udpladning blev cellerne beriget med 10% FBS, inkuberet i yderligere 24 timer med 25 pM af 21α-MMD og celler blev opsamlet og underkastet analyse. Knockdown af mTOR ekspression blev undersøgt ved immunoblotting som beskrevet ovenfor under anvendelse af anti-mTOR-antistof. MTOR siRNA-sekvens var 5′-AAGAAUCAAAGAGCAGAGUGC-3′.

Statistiske analyser

Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange. Data blev udtrykt som middelværdien ± SD for det angivne antal individuelt gennemført eksperimenter og analyseret under anvendelse af en t-test af ikke-parametriske Mann-Whitney U-test for værdier, der ikke var normalfordelt, envejs ANOVA, og Spearman rank korrelation tests eventuelt ved GraphPad Prism v5.01 software (GraphPad software, La Jolla, CA, USA). Værdier med

s

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Anti-proliferative effekter af forbindelser fra

P

.

trifoliata

på humane kræftceller

Coumariner og triterpenoids fra frugterne af

P

.

trifoliata

er blevet beskrevet tidligere at udvise potente anticancer virkninger mod en bred vifte af kræft celle modeller [27-29]. Baseret på denne information, de

in vitro

cytotoksiske aktiviteter af 13 forbindelser isoleret fra frugterne af

P

.

trifoliata

mod MDA-MB-231, blev T47D, SNU-638, SK-HEP-1, og A549 humane cancercellelinier evalueret under anvendelse SRB-assay. Som vist i tabel 1, viste triterpenoids de mest lovende ved at inhibere et panel af cancerceller med IC

50 værdier på mindre end 50 mikro-molær intervaller. Blandt testforbindelserne, triterpenoids 25-methoxyhispidol A, 21α-methylmelianodiol (21α-MMD, Fig 1A), og 21α, 25-dimethylmelianodiol udviste den mest aktive anti-proliferativ aktivitet. Dataene antydede, at anti-proliferative aktivitet af 21α-MMD er potent, når det testes på A549 humane lunge cancerceller, der er rettet os til yderligere at studere dens virkningsmekanisme i et større panel af NSCLC celle modeller.

( a) den kemiske struktur af 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD), en naturlig triterpenoid isoleret fra frugten af ​​

Poncirus trifoliata

. (B) MRC-5 og L132 humane normale lunge-cellelinier og A549, H460, H358, H1299, og H292 human lungekræft cellelinier blev udpladet på 96-brønds plade og blev behandlet med varierende koncentrationer af 21α-MMD i 24 timer og cellevækst blev analyseret ved MTT-assay og plottet som procentdelen af ​​levedygtige celler. Værdier sammenlignet med den tilsvarende kontrol værdi. (C) Klonal dannelse vækst angivne lunge kræftceller blev gennemført efter en 7-dages vækstperiode efter en enkelt administration af forskellige koncentrationer af 21α-MMD. Billederne på venstre viste er krystalviolet farvede kolonier, mens på den højre er grafer, der repræsenterer tæller målinger af kolonierne. (D og E) Fase-kontrast mikroskopi blev udført på celler efter udsættelse for 25 uM 21α-MMD at identificere ændringer i morfologi og DNA blev observeret af DAPI (nederst til venstre) og af PI (til højre) farvning observeret ved konfokal mikroskop. (F) H1299 og A549-celler blev inkuberet med 5 uM 21α-MMD i 24 timer efterfulgt af celleinvasion analyse.