PLoS ONE: P2X7 formidler ATP-Driven invasionsevne i prostatakræft Cells

Abstrakt

ATP-gated P2X7 har vist sig at spille en vigtig rolle i invasiv og metastase af nogle tumorer. Imidlertid har de mulige forbindelser og underliggende mekanismer mellem P2X7 og prostatakræft ikke blevet belyst. Her har vi vist, at P2X7 blev højt udtrykt i nogle prostatacancerceller. Nedregulering af P2X7 af siRNA signifikant svækkede ATP- eller BzATP-drevne migration og invasion af prostatacancerceller in vitro og inhiberede tumorindtrængen og metastaser i nøgne mus. Desuden nedregulering af P2X7 bemærkelsesværdigt svækket ATP- eller BzATP- drevne ekspressionssystemer ændringer i EMT /invasion gener Sneglen, E-cadherin, claudin-1, IL-8 og MMP-3, og svækket phosphoryleringen af ​​PI3K /AKT og ERK1 /2 in vitro. Lignende effekter blev observeret i nøgne mus. Disse data indikerer, at P2X7 stimulerer celleinvasion og metastase i prostata cancerceller via nogle EMT /invasion-relaterede gener, samt PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveje. P2X7 kunne være en lovende terapeutisk mål for prostatakræft

Henvisning:. Qiu Y, Li W-h, Zhang H-q, Liu Y, Tian X-X, Fang W-G (2014) P2X7 formidler ATP-Driven invasionsevne i prostatacancerceller. PLoS ONE 9 (12): e114371. doi: 10,1371 /journal.pone.0114371

Redaktør: Jean Kanellopoulos, University Paris Sud, Frankrig

Modtaget: Juni 15, 2014, Accepteret: November 6, 2014; Udgivet: 8. december 2014

Copyright: © 2014 Qiu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud til WGF fra National Natural Science Foundation of China (81321003, 30971152), og 973 Program (2010CB529402) fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er en af ​​de mest almindelige maligne tumorer, og også en af ​​de førende årsager til mandlig cancer dødsfald på verdensplan [1]. De fleste af patienterne dør ikke af lokal primære tumor, men af ​​fjerne metastaser. Processen med cancermetastase består af sekventielle og indbyrdes forbundne begivenheder [2]. På den ene side kan kræftceller erhverve vandrende og invasive kapaciteter ved epitelial mesenkymale overgang (EMT), som gør det muligt for dem at erhverve evnen til at infiltrere omgivende væv og i sidste ende metastaserer til fjerne steder [3]. På den anden side, interaktioner mellem cancerceller og tumor mikromiljø er afgørende for den metastatiske spredning af tumorer celler [4]. Vores tidligere undersøgelser har fokuseret på en vigtig tumormikromiljøet molekyle, adenosin-5′-triphosphat (ATP).

Ud over at have et intracellulært rolle i cellestofskiftet som energikilde, ATP er blevet bredt accepteret som et ekstracellulært signalmolekyle, og kan frigives til ekstracellulære miljø i både fysiologiske og patologiske situationer såsom neurotransmission, væv skader, et al [5], [6], [7]. Det er nu klart, at ATP er en af ​​de rigelige biokemiske komponenter i tumormikromiljøet og spiller en central rolle i vært-tumor interaktion. Ekstracellulær ATP fungerer som signalmolekyle gennem interaktion med P2-receptorer og medierer en række biologiske processer, såsom celleproliferation, migration og invasion [8], [9], [10]. P2-receptorer er opdelt i to adskilte familier: G protein-koblede P2Y-receptorer (P2Y1, 2, 4, 6, 11, 12, 13 og 14) og ligand-gatede kation permeabel kanal P2X-receptorer (P2X1-7) [11]. Der er rapporteret om en række P2-receptorer, der skal udtrykkes i prostata kræftceller [10], [12]. Vores tidligere undersøgelse viste, at ekstracellulær ATP var et vigtigt pro-invasiv middel og P2Y2 var en af ​​de vigtigste receptorer, som er medieret ATP-fremmet migration og invasion af prostatacancerceller [10]. Men vi fandt også, at ATP-medieret pro-invasiv ikke helt kan afskaffes efter maksimal lyddæmpning af P2Y2, hvilket indikerer, at en anden receptorsubtype (r) kan være involveret i denne proces. Blandt P2X receptorfamilien, P2X7 er den seneste klonede element [13], og blev oprindeligt betragtet som et cytolytisk receptor siden dets langvarig aktivering fører til celledød [14]. For nylig blev det konstateret, at P2X7 rigeligt blev udtrykt i cancerceller af leukæmi, neuroblastom, melanom, samt i prostata, bryst og thyreoideacancer [15], [16], [17], [18], [19], og blev endda foreslået at være en biomarkør for tidligt kræft [17], [20], [21]. Endvidere blev aktivering af P2X7 rapporteret at have anti-apoptotiske virkninger, stimulere tumorcellevækst [22], [23], og endog til at fremme celle invasionsevne i nogle cancerceller [24], [25], som er i modstrid med den oprindelige antagelse, at P2X7 var en “død receptor”. I denne undersøgelse var det et mål at undersøge den rolle, P2X7 i invasionen og metastase af prostatacancer, og at afsløre de underliggende mekanismer.

Materialer og metoder Salg

Kemi og antistoffer

ATP blev BzATP, KN62, LY294002, U0126 og Digitonin opnået fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Kanin-anti-P2X7-antistof (# Apr-008) blev opnået fra Alomone Labs (Jerusalem, Israel), og antistoffer af β-actin (# TA-09), ERK1 /2 (# SC-94) og E-cadherin (# SC-7870) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer af sneglen (# 3895S), Claudin-1 (# 4933P), p-AKT (# 4056S), AKT (# 4691S), og p-ERK1 /2 (# 9101S) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA , USA). HRP-konjugeret ged anti-mus (# ZB-2305) og gede-anti-kanin IgG (# ZB-2301) blev opnået fra OriGene (Maryland, USA). Fluo-04:00 (# F14201) blev opnået fra Molecular Probes (Eugene, OR, USA). HBSS (# 14.025.092) blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

1E8 og 2B4 celler blev afledt af PC-3M humane prostata carcinom celle linje. 1E8 var meget metastatisk, mens 2B4 var ikke-metastatisk [26]. 22RV1 prostatacancer-cellelinie og BPH1 blev indkøbt fra American Type Culture Collection. Alle celler blev dyrket i RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C.

revers transkription og real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ved at følge producentens instruktioner. 2 ug totalt RNA blev omvendt transkriberet til cDNA under anvendelse af MMLV revers transkriptase (Promega, Madison, Wisconsin, USA), og real-time PCR blev udført under anvendelse af ABI StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). De specifikke primere blev anskaffet fra Invitrogen og opført i S1 tabel. De termiske forhold cyklus var som følger: 10 minutter ved 95 ° C, 30 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C. Relative genekspressionsniveauer, normaliseret til p-actin-ekspression blev beregnet ved anvendelse af 2

-. △△ Ct metode [27]

Cellelyse og western blot-analyse

helcellelysat blev ekstraheret med RIPA-buffer (Applygen Technologies Inc, Beijing, Kina) indeholdende proteaseinhibitorer og phosphataseinhibitorer (Roche, Mannheim, Tyskland). Koncentrationen af ​​protein blev bestemt ved anvendelse af et BCA-reagens (Applygen Technologies Inc, Beijing, Kina). Lige store mængder protein blev separeret ved SDS-PAGE-gel og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), som blev inkuberet ved 4 ° C natten over med primære antistoffer mod P2X7 (1:200), E-cadherin (1:500), Claudin-1 (1:1000), snail (1:1000), β-actin (1:1000), ERK1 /2 (1:1000), AKT (1:1000), p-ERK1 /2 (1:1000) eller p-AKT (1:1000) hhv. Immunoreaktive proteiner blev visualiseret ved kemiluminescens (Applygen Technologies Inc) og kvantificeret ved densitometri analyse under anvendelse Mængde One software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA)

Celler blev dyrket i nærvær eller fravær af ATP, og supernatanten blev opsamlet efter forskellig behandling. Supernatanten blev opbevaret ved -80 ° C efter centrifugering ved 12.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. IL-8 og MMP-3 proteinniveauer blev målt separat under anvendelse af IL-8 ELISA-kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og MMP-3 ELISA-kit (Boster, Wuhan, Kina) ifølge producentens instruktioner. Koncentrationen af ​​IL-8 og MMP-3 blev bestemt ved at sammenligne absorbansen med standard protein, og derefter normaliseret til totalt protein. Salg

Cell transfektion

I forbigående gendæmpning, to adskilte siRNA oligonukleotider målretning P2X7 blev anvendt med sekvenser som følger: P2X7 siRNA1, 5′-CTAGGATAATGTCCAACTAAA-3 ‘og P2X7 siRNA2, 5′-CACAGTGTCTTTGACACCGCA-3’. En scramble siRNA blev anvendt som negativ kontrol. 1E8 og 2B4 prostatacancerceller blev transficeret med ovennævnte siRNA anvendelse af lipofectamin RNAi Max (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger.

I stabil gendæmpning, to plasmider med shRNA (short hairpin RNA ) rettet mod P2X7 blev bygget ved hjælp pGPU6 /GFP /Neo kloning systemet (Genepharma Co., Ltd, Shanghai, Kina). Sekvenserne målretning P2X7 var som følger: shRNA1, 5′-GCATGAATTATGGCACCATTA-3 ‘, og shRNA2, 5′-GCAATTCAGGGCGGAATAATG-3’. Den pGPU6 /GFP /Neo vektor med en scramble sekvens shRNA blev anvendt som en negativ kontrol. Celletransfektion blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Cell-kloner med stabil knockdown af P2X7 blev etableret i 1E8 celler ved Geneticin (G418) valg.

For gen overekspression blev en udtrykke vektor kodning fuld længde human P2X7 (hP2X7) konstrueret (Genepharma Co., Ltd , Shanghai, Kina), og transficeret ind 22RV1 prostata kræftceller.

In vitro migration assay og invasion assay

migrations- og invasionsevne evner prostatacancerceller blev vurderet ved hjælp af Boyden Chamber assay ifølge beskrevet af Albini et al [28], med visse modifikationer metode. Cellemigrering analyseret ved anvendelse af 24-brønds Transwell kamre som indeholdt 8 pM porestørrelse polyethylenterephthalat membran cellekultur inserter (Costar, San Diego, CA, USA). Det øvre rum blev podet med 0,5 × 10

5 levedygtige celler og det nedre kammer blev fyldt med 600 pi NIH3T3 konditioneret medium som en kemoattraktant. Efter inkubation med eller uden ATP i 12 timer ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2, blev kamrene fjernet. Celler på den øvre side af kammeret blev fjernet med bomulds- tippes podninger, og cellerne på undersiden af ​​membranerne blev farvet med krystalviolet efter fiksering i 4% formaldehyd. Celle invasiv evne blev vurderet ved anvendelse af de samme skær som nævnt ovenfor, men med membranen dækket med en film af Matrigel (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). I dette tilfælde er 1 × 10

5 levedygtige celler blev podet i det øvre rum. Membraner blev skåret og monteret på objektglas og cellerne blev observeret under mikroskopet ved × 200 forstørrelse. Hvert forsøg blev gentaget mindst tre gange, og resultaterne for migration og invasion var normaliseret til kontrollerne.

Etik erklæring

Alle mus er blevet rejst under en specifik patogen fri (SPF) miljø. Alle dyrene blev behandlet i overensstemmelse med vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Alle eksperimentelle procedurer og protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Peking University (nr LA2011-72).

In vivo assay

Den mandlige BALB /c nøgne mus (4 uger gamle) blev indkøbt fra Animal Department of Peking University Health Science center og blev randomiseret i tre grupper (n = 8 pr gruppe). To 1E8 kloner med stabil knockdown af P2X7 samt en negativ kontrol klon blev anvendt i de følgende eksperimenter. Celler ved den logaritmiske vækstfase blev opsamlet og justeret med PBS til en koncentration på 5 x 10

6 celler /ml, og 200 pi cellesuspension blev injiceret subkutant i hver forreste flanke region nøgne mus. Otte uger efter podning blev alle musene aflivet ved cervikal dislokation, og de primære tumorer sammen med nogle organer, såsom lever, lunger, nyrer og lymfeknuder blev udskåret. Tumorer, lever, lunger og nyrer fra musene blev fikseret i 4% paraformaldehyd, indlejres i paraffin og blev derefter opdelt i 4~5 um skiver. At observere en fjern mikrometastase af primær tumor, hæmatoxylin og eosin (HE) plet blev udført på de væv dias. I mellemtiden blev nogle tumorvæv lyseret med RIPA lysebuffer til påvisning af protein udtryk for EMT /invasion-relaterede gener ved anvendelse western blot analyse. Endvidere blev nogle tumor prøver nedsænket i OTC medium og frosne snit af 5 um tykkelse blev forberedt til immunofluorescensassay.

Immunofluorescens assay

For immunfluorescensfarvning, tumor prøver blev nedsænket i OTC medium , og frosne snit af 5 um i tykkelse blev fremstillet. Snit blev fikseret med acetone i 10 minutter ved -20 ° C, og derefter ikke-specifik binding blev blokeret i gedeserum i 1 time ved stuetemperatur. Snit blev inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer mod sneglen (Cell Signaling Technology), E-cadherin (Santa Cruz), eller Claudin-1 (Invitrogen) henholdsvis og derefter inkuberet med en FITC-konjugeret sekundært antistof (Sigma) i 1 time ved stuetemperatur. DAPI-farvning blev anvendt til at visualisere cellekerner. Billeder blev taget med konfokal mikroskopi.

Fluo-04:00 og ethidiumbromid uptake analyser

Ændringer i frie koncentration intern calcium blev målt med den fluorescerende indikator Fluo-04:00. Celler udpladet på 1 mm glasbund skålen blev fyldt i 30 min ved 37 ° C med 1 uM Fluo-4:00 i HBSS-buffer. Overskydende farvestof blev fjernet ved skylning af cellerne to gange med HBSS. Derefter blev celler inkuberet i yderligere 10 minutter i HBSS og behandlet med eller uden ATP og BzATP som angivet i figurteksterne. Billeder blev erhvervet til 5 s mellemrum; talrige celler i et synsfelt blev målt for 350 s for at opnå den gennemsnitlige Fluo-4 fluorescerende signal. For at måle ethidium optagelse, ethidiumbromid (25 uM) blev tilsat til overhældning løsninger. Billeder blev erhvervet til 5 s intervaller for 900 s. Den samlede optagelse af ethidiumbromid blev estimeret ved at tilsætte digitonin (100 uM) i kuvetten. Den permeabiliserende effekt af ATP eller BzATP blev estimeret i forhold til permeabilisering målt i nærværelse af digitonin.

Cell overlevelse assay

For at vurdere cellens overlevelse, 2 × 10

5 celler blev podet per brønd i seks-brønds plader i en kontrolkultur medium eller i nærvær af 1 mM ATP (eller 100 uM BzATP), og blev dyrket i 24 timer. Celleoverlevelse blev estimeret med MTT-assay og data blev udtrykt som% celleoverlevelse sammenlignet med kontrol. Resultater blev valideret ved manuel celletælling. blev udført mindst tre uafhængige forsøg.

Dataanalyse og statistik

Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange. Data er præsenteret som middelværdi ± SD. Dataene blev analyseret med SPSS 19.0. Studerendes

t

-test blev udført for at vurdere forskellene mellem to grupper, og ikke-parametrisk ANOVA blev anvendt, når flere midler blev sammenlignet. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant ved p. 0,05

Resultater

Prostata kræftceller udtrykte funktionelle P2X7

For det første, vi analyserede mRNA ekspressionen af ​​P2X7 i prostata kræftceller 1E8, 2B4 og 22RV1 samt i ikke-maligne udødeliggjort prostata epitelcelle BPH1 hjælp af real-time PCR, og fandt, at P2X7 markant blev udtrykt i 1E8 og 2B4 prostatacancerceller, mens dets ekspression var meget svag i 22RV1 og BPH1 celler (fig. 1A). Desuden blev P2X7 protein stærkt udtrykt i 1E8 og 2B4 (fig. 1B) prostatacancerceller. Dernæst undersøgte vi intracellulært frit calcium koncentration ([Ca

2 +] i) at bestemme, om P2X7 i prostatacancerceller var funktionelle. Ekstracellulær ATP (1 mM) eller BzATP (100 uM) behandling udløste en bemærkelsesværdig stigning i [Ca

2+] i i prostatacancerceller, overvåges af Fluo-4 fluorescens. Imidlertid KN62 (1 uM), en P2X7-antagonist, signifikant hæmmet ATP eller BzATP induceret [Ca

2+] i-stigning (Fig. 1C). Ethidium optagelse blev også registreret i prostatacancerceller efter stimuleret med ATP eller BzATP, som blev inhiberet væsentligt, når KN62 blev tilsat til den eksterne opløsning (fig. 1D-E). Alle disse resultater antydede, at P2X7 udtrykt i prostatacancerceller var funktionelle.

(A) Relativ mRNA udtryk for P2X7 blev normaliseret ved β-actin udskrift i 1E8, 2B4, 22RV1 og BPH1 celler. (B) Protein niveauer af P2X7 i prostatacancerceller blev påvist ved western blot-analyse og data blev normaliseret for p-actin. Protein ekspression af P2X7 i BPH1 celler blev defineret som 1. Værdier blev præsenteret som gennemsnit ± S.D. (vertikale søjler). (C) Repræsentative intracellulære calcium ændringer som reaktion på ATP (1 mM) eller BzATP (100 uM) i nærvær eller fravær af KN62 (1 uM). (D) repræsentant ethidium optagelse af prostatacancerceller i basal tilstand eller ved stimulering med ATP (1 mM) eller BzATP (100 uM) i nærvær eller fravær af KN62. ATP /BzATP blev tilsat, som angivet ved pilen, til HBSS indeholdende 25 pM ethidiumbromid. (E) ethidium fluorescensintensitet i basal tilstand eller ved stimulering med ATP (1 mM) eller BzATP (100 uM) i nærvær eller fravær af KN62, blev præsenteret som en procentdel i forhold til værdien af ​​digitonin-induceret permeabilisering. Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg. * P. 0,05

P2X7 var involveret i ATP /BzATP-drevet migration og invasion af prostata cancer celler in vitro

P2X7 har vist sig at være over-udtrykt i flere tumorer [15], [16], [17], [18], [19], men dens rolle i kræft progression er fortsat uklart. Vores tidligere undersøgelser viste, at ekstracellulær ATP kunne forbedre migration og invasion af prostatacancerceller [29], [30]. Vi spekulerede på, om P2X7 spillet en rolle i ATP-medierede biologiske opførsel af prostata kræftceller. Første har vi analyseret effekten af ​​P2X7 på overlevelse af prostatacancerceller, og fandt, at aktivering af P2X7 med ATP eller BzATP havde ingen virkning på cellelevedygtighed (fig. 2A). I modsætning hertil fandt vi, at aktivering af P2X7 af ATP forårsagede en signifikant forøgelse af cellemigration og invasion i prostatacancerceller (fig. 2C-D). Derefter blev to forskellige siRNA’er (siRNA1 og siRNA2), der anvendes til at lukke munden på P2X7 udtryk, og hver siRNA opnået en fremtrædende effekt på knockdown af P2X7 i prostata cancer celler (Fig. 2B). Nedregulering af P2X7 af siRNA bemærkelsesværdigt inhiberede ATP-drevne migration og invasion i 1E8 og 2B4 prostatacancerceller (fig. 2C-D). Ligeledes knockdown af P2X7 også signifikant blokeret BzATP-medieret migration og invasion af prostata cancer celler i 1E8 og 2B4 prostata kræftceller (S1 figur). Desuden overekspression af P2X7 fremtrædende forbedret ATP-induceret migration og invasion i 22RV1 prostatacancerceller (S2A-B Figur). Disse resultater antydede, at P2X7 var involveret i ATP-medierede migration og invasion af prostata kræftceller.

(A) 1E8 og 2B4 prostatacancerceller blev behandlet med 1 mM ATP i 12 timer og 24 timer. Celleoverlevelse blev estimeret ved MTT-assayet og data blev normaliseret til dem under kontrol betingelse. (B) 1E8 og 2B4-celler blev transficeret med to forskellige P2X7 siRNA’er (siRNA1 og siRNA2) eller en kontrol siRNA (NC). Western-blot eksperimenter blev udført for at detektere knockdown effektivitet. (C-D) in vitro migration og invasion-assays blev udført som beskrevet i fremgangsmåder sektion i fravær (kontrol) eller tilstedeværelse af 1 mM ATP (ATP 12 h). Data for cellemigrering eller invasion blev beregnet som en procentdel af kontrolceller. Resultater blev påvist ved histogrammer og værdier blev præsenteret som gennemsnit ± S.D. (vertikale søjler). Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg. * P. 0,05

P2X7 deltog i reguleringen af ​​EMT /invasion-relaterede genekspression i prostatacancerceller

Ved at bruge cDNA microarray analyse, vores tidligere undersøgelse viste, at ekstracellulær ATP kunne regulere mRNA ekspression af Snail, E-cadherin, Claudin-1 og IL-8, som spiller vigtige roller i EMT og tumorprogression [10]. Desuden, vores tidligere undersøgelse i prostatacancer påvist, at ATP behandling kan øge ekspressionen af ​​MMP-3, som er stærkt involveret i invasion og metastase af cancer [30]. Derfor spekulerede vi om P2X7 deltaget i disse ATP-medieret gen udtryk. Som vist i fig. 3, i nærværelse af ATP, udtryk for sneglen, IL-8 og MMP-3 blev signifikant forøget i prostatacancerceller 1E8 og 2B4, mens udtryk for E-cadherin og Claudin-1 blev tydeligt reduceret. BzATP viste lignende effekt på udtrykkene for EMT /invasion-relaterede gener i prostatacancerceller (S3 figur). Alligevel efter knockdown af P2X7 ved siRNA, ændringer i udtrykkene for sneglen, IL-8, MMP-3, E-cadherin og Claudin-1, medieret af ATP eller BzATP blev attenueret (fig. 3 og S3 figur). Desuden specifikt blokerer aktiveringen af ​​P2X7 ved sin antagonist KN62, ATP og BzATP kunne ikke påvirke udtryk for Snail, E-cadherin og Claudin-1 længere (S4 og S5 Tal). Tilsvarende ATP førte til forøget ekspression af Snail og nedsat ekspression af E-cadherin i 22RV1 celler, som eksogent udtrykte P2X7 (S2C figur). Alle disse data antydede, at P2X7 var nødvendig for ATP-medierede ekspression ændringer af EMT /invasion-relaterede gener i prostatacancerceller.

P2X7 tavshed celler (siRNA1 og siRNA2) og kontrol siRNA celler (NC) blev behandlet med eller uden 1 mM ATP i 12 timer. Proteinniveauer af sneglen (A), E-cadherin (B) og Claudin-1 (C) blev undersøgt ved Western blot-analyse. Protein-niveauer af IL-8 (D) og MMP-3 (E) blev vurderet ved ELISA-assay. Udtryk for disse proteiner blev normaliseret til deres respektive ekspression i kontrolceller (uden ATP). Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (vertikale søjler). Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg. * P. 0,05

Aktivering af PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveje var kritiske i ATP- /BzATP-drevne migration, invasion og udtryk ændringer i EMT /invasion-relaterede gener

i vores tidligere undersøgelse er det blevet påvist, at ATP PI3K /AKT og ERK1 /2 signaleringsveje på en tids- og dosisafhængig måde i 1E8 og 2B4 prostatacancerceller [29], [30]. Her fandt vi, at BzATP behandling forårsagede også en bemærkelsesværdig aktivering af PI3K /AKT og ERK1 /2 signaleringsveje i prostatacancerceller (S6A-B Figur). For at forstå den funktionelle virkning af PI3K /AKT og ERK1 /2 signaleringsveje i prostatacancerceller, to farmakologiske inhibitorer, LY294002 og U0126 blev anvendt til at blokere PI3K /AKT og ERK1 /2 signalvejen (fig. 4A-B og S6A- B Figur). Resultaterne viste, at ATP- og BzATP-drevet migration og invasion af prostatacancerceller blev signifikant undertrykt, når PI3K /AKT eller ERK1 /2-signalvejen blev inhiberet (fig. 4C-D og S6c-D Figur). Endvidere inhibering af enten PI3K /AKT eller ERK1 /2 signalvejen betydeligt svækkede udtrykket ændringer i EMT /invasion gener induceret af ATP eller BzATP i prostatacancerceller (fig. 5 og S7 figur).

IE8 og 2B4-celler blev behandlet med LY294002 (bane betegnet som LY294002) eller U0126 (bane betegnet som U0126) eller uden behandling (tjente som en negativ kontrol, bane betegnet NC). (A-B) LY294002 og U0126 inhiberede ATP-medierede PI3K /AKT og ERK1 /2-aktivering henholdsvis. (C-D) Virkninger af LY294002 og U0126 om migration og invasion i 1E8 og 2B4 prostata kræftceller. Data for cellemigrering eller invasion blev beregnet som en procentdel af kontrolceller. Resultater blev påvist ved histogrammer, og værdier blev præsenteret som gennemsnit ± S.D. (vertikale søjler). Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg. * P. 0,05

IE8 og 2B4-celler blev behandlet med LY294002 (bane betegnet LY294002) eller U0126 (bane betegnet som U0126) eller uden behandling (tjente som en negativ kontrol, bane betegnet NC ). Expressions of snail (A), E-cadherin (B) og Claudin-1 (C) blev påvist ved western blots. Udtryk af IL-8 (D) og MMP-3 (E) blev påvist ved anvendelse af ELISA. Udtryk for disse proteiner blev normaliseret til deres respektive ekspression i kontrolceller (uden ATP). Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (vertikale søjler). Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg. * P. 0,05

P2X7 var påkrævet for ATP /BzATP-induceret aktivering af PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveje

Da vi observeret, at P2X7 samt PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveje udstillet vigtige virkninger på ATP- og BzATP-drevne migration, invasion og udtryk ændringer i EMT /invasion-relaterede gener i prostata kræftceller, vi spekulerede på, om P2X7 var involveret i ATP- og BzATP-induceret aktivering af PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveje. Som vist i fig. 6 og S8 Figure, knockdown af P2X7 resulterede i fremtrædende inhibering af ATP- og BzATP-induceret phosphorylering af PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveje. Tilsammen foreslog disse resultater en vigtig rolle P2X7 i ATP-medieret aktivering af PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveje.

P2X7 tavshed celler (siRNA1 og siRNA2) og kontrollerer siRNA celler (NC) blev behandlet med eller uden 1 mM ATP i 15 minutter. Western blot blev udført for at analysere phosphorylering niveau af AKT (A) og ERK1 /2 (B). Udtryk for p-AKT og p-ERK1 /2 blev normaliseret til deres respektive ekspression i kontrolceller (uden ATP). Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (vertikale søjler). Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg. * P. 0,05

P2X7 var påkrævet til in vivo invasiv og metastase samt regulering af ekspressionen af ​​EMT /invasion gener

Endelig har vi analyseret in vivo effekt af P2X7 på invasion og metastaser i nøgne mus. Tumorer i mus, der er udviklet med subkutant injiceret kontrolceller, vises betydelig invasionsevne til nærliggende væv, såsom fedt og muskler. Endvidere i musene injiceret med kontrolceller, 37,5% af dem frembudt fjerne metastaser til nyre og 87,5% fremlagt lymfeknudemetastaser. Men i de to grupper injiceret med P2X7-lyddæmpet celler, kun én mus havde metastaser til lymfeknude (fig. 7).

(A) 1E8-celler blev stabilt transficeret med P2X7 shRNA eller en scramble shRNA (NC ). To stabile P2X7 shRNA kloner (shRNA1 og shRNA2) blev vist at udtrykke lave niveauer af P2X7 anvendelse af Western blot analyse. (B) repræsentant fotografi af tumorsektioner og tilstødende væv (farvet med hæmatoxylin og eosin (H 0,05

Vi analyserede også udtryk for Snail, E-cadherin, Claudin-1 og IL-8 samt phosphoryleringsniveauerne af AKT og ERK1 /2 i ubearbejdet tumorvæv af mus dannes af 1E8 kontrol shRNA celler og P2X7 shRNA celler. Efter knockdown af P2X7 blev udtryk for Sneglen og IL-8 naturligvis inhiberet mens udtryk for E-cadherin og Claudin-1 var signifikant forøget (fig. 8A-C). Desuden, P2X7 knockdown signifikant inhiberede aktivering af AKT og ERK1 /2 i tumorvæv (fig. 8D). Disse resultater stemte overens med de observerede in vitro resultater.

(A) Immunfluorescensfarvning for sneglen, E-cadherin, Claudin-1 (grøn) og DAPI (blå) blev udført i tumorvæv fra mus. Billeder blev taget ved konfokal mikroskopi. Scale søjler repræsenterer 75 um eller 25 um som vist i figuren. (B) Western-blotting blev udført for at påvise proteinniveauer af sneglen, E-cadherin og Claudin-1 i tumorvæv. (C) ELISA blev anvendt til at undersøge ekspressionen af ​​IL-8. (D) Western blotting blev udført for at analysere phosphorylering niveau af AKT og ERK1 /2 i tumorvæv. For hver gruppe blev mindst tre forskellige tumorer fra tre forskellige mus anvendt i forsøgene. * P. 0,05

Diskussion

Mange undersøgelser viste, at det ekstracellulære mikromiljø af tumorer indeholdt meget højere koncentrationer af ATP end raske væv, og ATP kunne repræsentere en stressende stimulus i kræft progression [7]. ATP kan udskilles af levende tumorceller i deres mikromiljø ved relativt høje koncentrationer samt blive frigivet fra nekrotiske celler i perilæsional regioner af kræft [6], [7], [24]. Som en allestedsnærværende ekstracellulær messenger, ATP funktioner via dens interaktion med P2X og P2Y-receptorer.

Blandt de P2-receptorerne engageret af ekstracellulær ATP, P2X7 er den mest konsekvent udtrykt eller endda over-udtrykkes af tumorceller. P2X7 er en ATP-ionkanal og har længe været kendt for dets cytotoksiske aktivitet imidlertid foreslået mere tyder en rolle for P2X7 i celleproliferation. P2X7 er blevet påvist at stimulere proliferation af lymfoide celler og fremme serum-uafhængig vækst [22], [23]. Omfattende undersøgelser i immunceller viste den vigtige rolle, P2X7 som et immunmodulerende receptor involveret i interleukin (IL) -1β modning og frigivelse, antigenpræsentation og graft-versus-host-reaktion [31], [32], [33]. I det seneste årti, har høj ekspression af P2X7 blevet fundet i forskellige former for tumorer og beviser akkumuleret viser pro-kræft virkninger af P2X7 [15], [16], [17]. Melanomceller med højt udtrykt P2X7, frembydes anti-apoptotisk virkning [16]. Efter transfektion med P2X7, HEK293 fibroblaster og CT26 coloncarcinomceller påvist med forbedringer i tumorigenese in vivo vækst og angiogenese, og reduktion i apoptose [34]. Desuden aktivering af P2X7 fremmet migration og invasivitet af brystkræftceller [24] og lymfoide neoplasme celler [35]. I den foreliggende undersøgelse, vi demonstreret, at P2X7 blev højt udtrykt i nogle prostatacancerceller. Knockdown af P2X7 af siRNA betydeligt ophævet ATP-forstærket migration og invasion in vitro. Desuden, nedregulering af P2X7 ført til bemærkelsesværdige inhibering af tumorindtrængen og metastaser i nøgne mus. Desuden overekspression af P2X7 markant forbedret ATP-medieret migration og invasion i 22RV1 prostatacancerceller, hvilket giver yderligere beviser for, at P2X7 var et af de centrale regulatorer af prostatakræft invasion og metastaser.

epitel-mesenkymale overgang (EMT) er et vigtigt skridt i løbet af kræft progression og tæt forbundet med høj motile og invasive karakteristisk for kræftceller. Det er nu almindeligt accepteret, at forringet udtryk eller funktion E-cadherin er en af ​​de tidligste trin i EMT [3]. Foruden adhæsionsmolekyler, under progressionen af ​​EMT, tight junctions proteiner, såsom Claudins, er normalt nedreguleres [36]. Claudins spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af ​​cellepolaritet og har en betydelig indflydelse på tumorprogression i flere typer af cancere [37], [38], [39]. Endvidere har flere transkriptionsfaktorer, såsom sneglen, Slug and Twist blevet rapporteret at drive EMT i forskellige cancerceller, og sneglen, en væsentlig transkriptionsfaktor, er generelt opreguleret under EMT-processen [3]. I den foreliggende undersøgelse, vi påvist, at ATP og BzATP behandling både førte til en betydelig opregulering af sneglen samt en dramatisk nedregulering af E-cadherin og Claudin-1 i prostatacancerceller in vitro, og P2X7 knockdown bemærkelsesværdigt inhiberet udtryk for sneglen og fremmet udtryk for E-cadherin og Claudin-1 in vitro og in vivo. Disse resultater antydede, at P2X7 medieret ATP-drevne EMT i prostatacancerceller.

tumorprogression og metastase ikke kun afhænge af den maligne potentiale af cancerceller selv, men også indflydelsen af ​​forskellige regulatoriske faktorer i tumor miljø . (vertikale søjler). Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg. Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (vertikale søjler). Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg. Proteinniveauer af sneglen (A), E-cadherin (B) og Claudin-1 (C) blev undersøgt ved Western blot-analyse. Protein-niveauer af IL-8 (D) og MMP-3 (E) blev vurderet ved ELISA-assay. Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (vertikale søjler). Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg. Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (vertikale søjler). Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg. Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (vertikale søjler). Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg. (vertikale søjler). Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg. Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (vertikale søjler). Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg. Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (vertikale søjler). Der blev udført mindst tre uafhængige forsøg.