PLoS ONE: Paradoksal Impact of Two folatreceptorer, FRα og RFC, i Kræft i æggestokkene: Effekt på celleproliferation, Invasion og Klinisk Outcome

Abstrakt

På trods af at et vigtigt vitamin, folat har været impliceret at øge tumor vækst, som det fremgår af rapporter om overekspression af folat receptor alpha (FRα) i karcinomer. Rolle anden folat transportør, reduceret folat carrier (RFC), er stort set ukendt. Denne undersøgelse undersøgte roller folat, FRα og RFC i æggestokkene. Vi demonstrerede FRα mRNA og protein-overekspression og reduceret RFC ekspression i association med FRα genamplifikation og RFC promotor hypermethylering hhv. FRα overekspression var forbundet med tumor progression mens RFC udtryk afholdt et gunstigt klinisk resultat. Sådan gensidig ekspressionsmønster blev også observeret i æggestokkene cancercellelinier. Folat blev vist at fremme cancercelleproliferation, migration og invasion

in vitro

og nedregulere E-cadherin ekspression. Denne effekt blev blokeret efter enten stabil knockdown af FRα eller ektopisk overekspression af RFC. Denne hidtil urapporteret fænomen tyder på, at RFC kan tjene som en afvejning partner i FRα og giver en beskyttende effekt i patienter med høje FRα udtrykkende ovariecarcinomer, som det fremgår af deres langvarige samlet og sygdomsfrie overlevelse. Afslutningsvis rapporterer vi om den paradoksale virkning af FRα (formodet onkogene) og RFC (formodet tumor undertrykkende) i humane maligniteter. FRα og RFC kan potentielt blive udforsket som terapeutisk target eller prognostisk markør henholdsvis. Vi anbefaler forsigtighed og yderligere forskning på folat kosttilskud hos kræftpatienter

Henvisning:. Siu MKY, Kong DSH, Chan HY, Wong ESY, Ip PPC, Jiang L, et al. (2012) Paradoksal Impact of Two folatreceptorer, FRα og RFC, i kræft i æggestokkene: Effekt på celleproliferation, Invasion og kliniske resultat. PLoS ONE 7 (11): e47201. doi: 10,1371 /journal.pone.0047201

Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australien

Modtaget: Juni 1, 2012; Accepteret: 10. september 2012; Udgivet: November 7, 2012 |

Copyright: © 2012 Siu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af midler fra det amerikanske Institute for Cancer Research ph.d.-Award og University of Hong Kong Seed finansiering, og konferencen og Forskning Grant fra University of Hong Kong. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

æggestokkene carcinomer udgør den højeste dødelighed blandt alle gynækologiske kræftformer i verden [1], [2]. Mens forekomsten af ​​ovariecarcinomer varierer mellem forskellige etniske grupper, dets forekomst i de asiatiske lande er på en stigende tendens [3], [4]. Årsagerne til dette stort set ukendt eller kontroversielt. Adskillige livsstil risikofaktorer er blevet impliceret. Disse omfatter kost, fedme, fertilitet og paritet statusser. På den anden side har det blev en generel opfattelse, at højt indtag af mikronæringsstoffer såsom folat, vitamin C, kan E-vitamin beskytter mod cancere [5]. Som sådan, bedre forståelse af virkningerne af ernæringsmæssige elementer på carcinogenese er vigtigt at forbedre de strategier for forebyggelse og forvaltning af kræft.

Folat er et vandopløseligt B-vitamin findes i de fleste grøntsager. Et højt kostindtag folat er blevet rapporteret at associere med en lavere risiko for at udvikle kræft i æggestokkene, især dem, der forbruger alkohol [6], [7], [8], [9]. Det er tæt forbundet med dens funktion på DNA-syntese og dets inddragelse i den relaterede methionin metaboliske vej afgørende for DNA methylering. Folat-mangel ville fører derfor til DNA hypometylering, ændret genekspression og fejlinkorporering af uracil i DNA, hvilket fører til kromosom skader, som alle er centrale faktorer for carcinogenese [10], [11]. Det forekommer, at folat er et vigtigt vitamin afgørende normale funktion af celler og til at hindre initiering af cancer. Men der er stigende bevis for, at folat kan faktisk øge kræft progression i etablerede carcinomer i tyktarm og endetarm, bryst og prostata [12], [13], [14].

Folat optagelse involverer flere transportører , såsom folat receptorer og reduceret folat carrier (RFC) [15], [16]. Folatreceptoren alpha (FRα), en enkelt kæde glycosyl-phosphatidylinositol-forankret membranprotein, forbedrer folat optagelse gennem endocytose. Dets overekspression er blevet rapporteret i ovariecancer, hvilket indebærer, at den kan fremme tumorvækst [17], [18], [19], [20]. RFC er en allestedsnærværende udtrykt transportør for naturlige folater og klassiske antifolater, og kan styre folat optagelse i et tovejs måde [16]. Tab af RFC med efterfølgende virkninger af folatmangel viste sig at fremme udviklingen af ​​kræft i tyk- og endetarmskræft [16], [21]. Det vil derfor være logisk at antage, at disse to folat transportører, FRα og RFC, udøver forskellige effekter i cancer progression.

Selv om der er etableret overekspression af FRα i ovariecancer, udtrykket status og funktionelle roller RFC forblive stort set ukendt. I denne undersøgelse undersøgte vi udtrykket, genetiske og epigenetiske profiler af FRα og RFC i normal ovarieepitelet og ovariecancer, og korreleret med klinisk-patologiske parametre. Deres funktionelle roller og mulige efterfølgende mål for celleproliferation, migration og invasion i relation til folat i kræft i æggestokkene blev også vurderet. Vi forsøgte at bedre at forstå de roller folat og dets transportører i æggestokkene carcinogenese, og udforske de mulige virkninger af folat indtag hos kræftpatienter.

Materialer og metoder

kliniske prøver og cellelinier

Et hundrede og halvtreds tre formalin-fikserede paraffin indlejrede prøver af tumorer i æggestokkene, herunder 11 inklusion cyster /godartede cystadenomas (22-63 år; gennemsnitlig alder, 50 år), 19 borderline tumorer (20~46 år gennemsnitsalder , 30 år), 83 carcinomer (34 til 83 år, gennemsnitlige 51 år) af forskellige histologiske undertyper og 44 tilsvarende metastatiske foci (tabel 1), blev indsamlet fra Patologisk Institut, Queen Mary Hospital, University of Hong Kong. Alle patienter blev opereret og 67 patienter med ovariecancer blev også behandlet med kemoterapi, herunder platin /paclitaxel. Opfølgningen periode varierede fra fem til 209 måneder (gennemsnit 63 måneder). Tredive tre tilfældigt udvalgte kliniske prøver af æggestokkene tumorer og deres tilsvarende normale modparter, herunder æggeledere og /eller kontralaterale æggestokke, med tilgængelige frosne blokke blev også hentet. Informeret samtykke blev opnået ved alle patienter og brugen af ​​disse kliniske prøver blev godkendt af Institutional Review Board fra University of Hong Kong /Hospital Myndighed Hongkong West Cluster (HKU /HA HKW IRB) (Institutional Review Board nummer: UW10-129) . Hæmatoxylin eosin farvede sektioner af de frosne blokke af hver prøve blev anmeldt af to af os (ANYC og PPCI) for at bekræfte diagnosen og for at sikre, at mere end 80% tumorceller var til stede i tumorblokke.

To udødeliggjort ovarieepitelceller cellelinjer, HOSE 6-3 og HOSE 17-1, og ni æggestokkene kræft cellelinjer, SKOV-3, OVCAR-3, OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626 (ATCC, Manassas, VA). blev dyrket som tidligere beskrevet [22], [23]

Real-time PCR (qPCR)

Total RNA fra frosne kliniske prøver og kræft cellelinjer var ekstraheret ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen). Genomisk DNA-kontaminering blev fjernet ved behandling med DNase I (Invitrogen) behandling. 2,5 pg totalt RNA blev revers transskriberet af SuperScript revers transkriptase (Invitrogen, San Diego, CA). Genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af phenol /chloroform (Invitrogen). qPCR blev udført med ABI Prism 7700 påvisning sekvens-system (Applied Biosystems, Foster City, CA), som beskrevet [22], [23], [24]. Primer sekvenser til evaluering mRNA ekspressionen af ​​FRα, RFC og GAPDH (som intern kontrol) var som følger: FRα forstand, 5’AAGTGCGCAGTGGGAGCT -3 “, og antisense, 5’CATTGCACAGAACAGTGGGTG -3« RFC forstand, 5’CGAAACCTCGGCTTCGGAGC -3 “, og antisense, 5’GCACGTAGTAGACCACCAGG -3« GAPDH forstand, 5’TCCATGACAACTTTGGTATCGTG -3 “, og antisense, 5’ACAGTCTTCTGGGTGGCAGTG -3”. PCR renhed blev bekræftet ved gelelektroforese. Primersekvenser (sense, 5′- GTATGCATGGCTTCCTGCAGG 3 ‘, og antisense, 5’ACTTGTTAAACCCTGTAGAGAGG 3’) til evaluering FRα genkopital blev udformet baseret på den genomiske sekvens af intron 3 og intron 4 af FRα (Ensemble database). TRAT1 blev anvendt som reference-genet [25]. Ovariecancer prøver med ≥ fordobling fra deres tilsvarende normale modstykker blev betragtet som positive for FRα genamplifikation.

immunblotting

Celler blev høstet med lysepuffer (0,125 M Tris, pH 6,8 ved 22 ° C indeholdende 1% NP-40 (v /v), 2 mM EDTA, 2 mM N-ethylmaleimid, 2 mM PMSF, 1 mM natriumorthovanadat og 0,1 uM natrium okadate], og klaret ved centrifugering ved 4 ° C. Protein koncentrationen blev bestemt ved DC (detergent kompatibel) proteinassay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 20 ug protein blev løst ved SDS-PAGE, overført til polyvinylidendifluoridmembran, og hybridiseret med antistoffer specifikke for FRα (1:1000.; Alexis Biokemiske, San Diego, Californien, ALX-804-439), RFC (1:1000, Affinity bioreagenser, Golden, CO, PA1-9553), E-cadherin (1:5000; BD Biosciences, Palo Alto, CA, 610.182 ), og actin (1:1000; Sigma, St. Louis, MO;. A5060), og passende sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) blottene blev udviklet af forøget kemiluminescens (ECL) Plus detektionssystem (Amersham, Arlington Heights, UK), og visualiseret med røntgenfilm (Galen Medical Group, Chattanooga, TN) [22], [23], [24].

Immunhistokemi

immunhistokemisk farvning var udført som beskrevet i tidligere rapporter [22], [23], [24]. For FRα immunhistokemi blev paraffinsnit behandlet med gede-anti-folat receptor-antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (1:200; Abcam, Cambridge, MA; ab20572). Da anti-FRα antistof fra Alexis Biochemical anvendes til immunoblotting ikke har tilfredsstillende resultat på immunfarvning under anvendelse paraffinsnit blev et andet antistof fra Abcam anvendes. Selvom dette antistof kan anerkende andre isoformer af FR, blev rapporteret beta- og GamME isoformer af FR skal overvejende udtrykt i placenta og hæmatopoetiske celler, men ikke i andre væv [26], [27]. Dette antistof kan derfor anvendes til at detektere FRα immunreaktivitet i ovariecancere. For RFC immunhistokemi, kylling anti-RFC antistof (1:200; Affinity Bioreagents) blev anvendt, efterfulgt af biotin-kanin-anti-kylling IgG (H + L). 3-diaminobenzidin-hydrogen peroxid blev anvendt som chromogen. Microwave antigen genfinding ved hjælp citratpuffer (pH 6,0) blev udført. Udeladelse eller erstatning af det primære antistof med præimmunt IgG serum blev anvendt som en negativ kontrol. Intensitet i farvede epitelceller blev scoret som 0 (negativ), 1 (svag), 2 (moderat) og 3 (kraftig). Procentdelen af ​​farvede celler blev bedømt som 0 ( 5%), 1 (5% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%) og 4 ( 75%) . Immunreaktivitet blev bedømt ved at multiplicere farvningsintensitet med procentdelen af ​​farvede celler for at give et sammensat et sammensat “Histoscore” [22], [23]. Høje og lave niveauer af FRα og RFC blev defineret af “HistoScores” cut off på middelværdien.

Demethylering behandling

SKOV-3 og OVCA420 celler blev behandlet med 0, 5 eller 10 pM 5- aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dc, en DNA-methyleringsinhibitor) i 72 timer [28]. Kontrolceller blev behandlet med samme volumen dimethylsulfoxid (DMSO). Totalt RNA blev ekstraheret fra celler. Transkriptionsaktiviteten RFC blev bestemt ved qPCR.

DNA-fremstilling, bisulfitbehandling og methylering-specifik PCR (MSP) analyse

Genomisk DNA fra frosne kliniske prøver blev ekstraheret under anvendelse phenol /chloroform. Bisulfitbehandling blev udført som beskrevet [28]. Primere specifikke for methylerede (forstand, 5’TTCGTCGTAGTTTGCGAATG -3 “, og antisense, 5’CAACACGTACCTAAACGCGA -3”) og umethyleret (sense, 5’TTTGTTGTAGTTTGTGAATGG -3 “, og antisense, 5’ACAACACATACCTAAACACAA -3 ‘ ) RFC promotor A blev rapporteret tidligere [29]. Annealeringstemperaturen var 52 ° C og 56 ° C i methyleret og umethyleret promotor A hhv. MSP-produkter blev påvist ved elektroforese på 2% agarosegel med ethidiumbromid-farvning. Normal lymfocyt DNA methyleres med SSSL methyltransferase blev anvendt som positiv kontrol. Ubehandlede genomiske DNA og vand råemner uden DNA blev anvendt som negative kontroller.

Stabil knockdown af FRα, ektopisk overekspression af RFC og folat behandling i SKOV-3

SKOV-3, en ovariecancercelle linje med relativt høj FRα og lav RFC ekspression, blev anvendt. Til stabil knockdown FRα blev cellerne transficeret med et sæt shRNA konstruktioner mod human FRα, PRS-sh FRα (Origene, Rockville, MD), er udvalgt med puromycin (1,5 ug /m) [22], [23], [24] . PRS vektor blev anvendt som kontroller. Til forbigående overekspression RFC blev pcDNA3-RFC plasmid (venligst stillet til rådighed af professor L Matherly, Michigan Cancer Foundation) og den tomme pcDNA3 vektor (kontrol) transficeret i kontrol SKOV-3 celler ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) [22], [23] , [24]. Celler blev dyrket i Medium 199 (Invitrogen) /MCDB 105 (Sigma) medium indeholdende 22,7 nM folinsyre og suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) [22], [23]. shFRα celler og RFC overudtrykker celler (2 dage efter transfektion) blev forbehandlet med folat-frit RPMI 1640-medium (Invitrogen) suppleret med 10% dialyseret FBS indeholdende 0,6 nM folinsyre (Invitrogen) i 2 dage, trysinized, talt udpladet for funktionelle assays og derefter behandlet med forskellige doser af folinsyre, en syntetisk folat, herunder 0, 6, 12 og 60 nM. De folinsyre anvendte koncentrationer er baseret på den fysiologiske område i plasma, der spænder fra 7 nM hos personer med en negativ folat balance til 50 nM i personer med 400 mg /d af folat forbrug [30], som er den anslåede folat indtag ved supplement nonusers i Nordamerika [13]. Den folinsyremangel koncentration valgt (12 nM) var baseret på den iagttagelse, at en sådan koncentration er den laveste krav til cellevækst [31]. Protein blev ekstraheret 2 dage efter behandling.

MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid) assay

Celleproliferation blev bestemt ved MTT-assay (Sigma) som beskrevet [22], [24]. Celler blev podet i plader med 96 brønde med 2000 celler /brønd. På specifikke tidspunkter blev 10 pi MTT tilsat til hver brønd. Plader blev inkuberet ved 37 ° C i 4 timer, efterfulgt af tilsætning af 100 pi DMSO til hver brønd for farvestof ekstraktion. Celleproliferation blev bestemt ved at måle absorbansen af ​​prøver ved 570 nm med 630 nm som reference bølgelængde.

In vitro

migration og invasion analyser

In vitro Salg migration og invasion-assays blev udført som beskrevet [22], [23], [24]. 1,25 × 10

5-celler blev udpladet på oversiden af ​​et Transwell indsætte og fik lov at migrere gennem et 8-um porestørrelse membran (migration assays) eller invadere gennem en Matrigel-coatede membran (invasions-assays). Celler ved den øvre side af membranen blev fjernet, og migrerede eller invaderede celler blev fikseret med methanol, farvet med 0,5% krystalviolet og talt under et lysmikroskop i 5 tilfældige områder efter 24 timer eller 48 timer respektivt.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS 15.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL). Mann-Whitney-test blev anvendt til sammenligning mellem to grupper henviser Kruskal-Wallis rank test blev anvendt til sammenligning mellem flere grupper. Overlevelse analyse blev udført af Kaplan-Meier-analyse og log-rank test. Cox regressionsanalyse blev anvendt til multivariate overlevelse analyse.

P

værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Overekspression af FRα var forbundet med æggestokkene tumor progression

Efter qPCR, signifikant højere FRα mRNA blev fundet i prøver cancerpatienter i sammenligning med de tilsvarende ikke-tumor modparter efter normalisering med GAPDH (

P

= 0,015) (figur 1A). Ved immunhistokemi, var stærk FRα immunoreaktivitet observeret i ovariecancer i modsætning til moderat farvning af FRα i grænsetilfælde tumorer og svag eller fravær af farvning i godartede cystadenomas /integration cyster (figur 1C). Faktisk var signifikant højere FRα immunreaktivitet påvist i æggestokkene og borderline tumorer end i benigne cystadenomas /integration cyster (alle

P

0,05, tabel 1). Ved cellelinjer niveau, seks ud af ni æggestokkene kræft cellelinjer viste også opregulering af FRα mRNA og protein udtryk med SKOV-3, OVCAR-3 og SW626 viser stærkt udtryk, mens OVCA 420, Dov13 og TOV21G viste svag udtryk sammenlignet med to normale ovarieepitelet cellelinier hvor ingen FRα mRNA og proteinekspression blev detekteret (figur 1B).

(A) qPCR analyse af FRα mRNA i ovariale tumorer, og de tilsvarende ikke-tumor modstykker. (B) mRNA (øverste panel) og protein (nederste panel) udtryk for FRα i to udødeliggjort ovarieepitelceller cellelinjer, SLANGE 6-3 og slange-17-1, og ni æggestokkene kræft cellelinjer, OVCAR-3, SKOV-3 , OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626, som vurderet af qPCR og immunblotting henholdsvis. (C) immunreaktivitet FRα i serøs (a) og mucinøs (e) godartede ovariale cystadenomas, serøs (b) og mucinøs (f) borderline ovarietumorer og serøs (c), mucinøs (g), clear cell (d) og endometrioide (h) ovariecarcinomer. Scale bar = 100 um. (D) Kaplan-Meier samlet (venstre panel) og sygdomsfri (højre panel) overlevelse kurver for æggestokkene kræftpatienter med høje og lave niveauer af FRα (afskåret ved middelværdi).

I klinisk prøver blev fundet høje FRα mRNA-ekspression og immunoreaktivitet at være signifikant associeret med fremskredne stadier af sygdommen og dårlig histologisk grad vil faktorer forbundet med tumor aggressivitet (tabel 1 og 2). Der blev imidlertid ikke fundet nogen signifikant forskel på FRα immunreaktivitet mellem chemosensitive og kemoterapi tilfælde (tabel 1). Kaplan-Meier-overlevelse analyser også afslørede ikke sammenhæng mellem høj FRα udtryk og samlet eller sygdomsfri overlevelse (Figur 1D).

RFC blev nedreguleret i ovariecancer og korreleret med god prognose af patienter

I modsætning til FRα, ovariecancer prøver vises signifikant lavere RFC mRNA sammenlignet med de tilsvarende ikke-tumor modstykker som bedømt ved qPCR (

P

= 0,001) (figur 2A). Immunhistokemisk analyse afslørede også stærk RFC immunoreaktivitet i inklusion cyster /godartede cystadenomas og svage udtryk i ovariecancer (Figur 2C). Seks ud af ni æggestokkene cancercellelinier vises også nedregulering af RFC-mRNA og proteinekspression i forhold til to normale ovarieepitelet cellelinier (figur 2B).

(A) qPCR analyse af RFC-mRNA i ovarietumorer og de tilsvarende ikke-tumor modstykker. (B) mRNA (øverste panel) og protein (nederste panel) udtryk for RFC i to udødeliggjort ovarieepitelceller cellelinjer, SLANGE 6-3 og slange-17-1, og ni æggestokkene kræft cellelinjer, SKOV-3, OVCAR-3 , OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626, som vurderet af qPCR og immunblotting henholdsvis. (C) immunreaktivitet RFCin inklusion cyste (a) og serøs ovariecarcinomer (b). Scale bar = 100 um. (D) Kaplan-Meier samlet (venstre panel) og sygdomsfri (højre panel) overlevelse kurver for æggestokkene kræftpatienter med høje og lave niveauer af RFC (afskåret ved middelværdi). (E) Kaplan-Meier samlet (venstre panel) og sygdomsfri (højre panel) overlevelse kurver for høj FRα udtrykte æggestokkene kræftpatienter med høje og lave niveauer af RFC (afskåret ved middelværdi).

RFC mRNA og immunreaktivitet korrelerede ikke med stadier af sygdommen, histologisk bedømmelse og histologiske undertyper (tabel 1 og 2). Interessant, var der en signifikant sammenhæng mellem lav udtryk for RFC, og kortere samlet (

P

= 0,034) og sygdomsfri (

P

= 0,011) overlevelse (figur 2D). Desuden blandt ovariecancer med høj FRα udtryk, den samlede (

P

= 0,007) og sygdomsfri (

P

= 0,008) overlevelse var signifikant længere i dem med høj RFC udtryk (figur 2E).

FRα genamplifikation og RFC promotor methylering bidrog til dysreguleret genekspression i ovariecancer

af qPCR, 11 ud af 33 (33,3%) kræft prøver vises FRα gen (FOLR1, kromosom 11q13.3) amplifikation sammenlignet med de tilsvarende ikke-tumor modstykker. Alle amplificerede tilfælde viste forhøjede mRNA-ekspression. FRα forstærkning var korreleret med dets mRNA-ekspression (

P

0,001, Fishers eksakte test) (tabel 3)

På den anden side, reduceret ekspression af RFC i æggestokkene kræftformer. var relateret til hypermethylering. Efter behandling af SKOV-3 og OVCA420 ovariecancerceller med 5-aza-dc, en DNA-methyleringsinhibitor, to-gange og 2,5 gange forøgelse af RFC-genekspression påvistes henholdsvis (figur 3A). Endvidere blev promotor hypermethylering RFC-genet (kromosom 21q22.2) fundet i 14 ud af 33 (42,4%) kræft i æggestokkene prøver ved MSP. Repræsentative eksempler på MSP blev vist i figur 3B. I modsætning hertil kun 3 ud af 33 (9%) af ikke-tumorprøver viste hypermethylering. Methylerede alleler blev fundet i alle tumor- og ikke-tumorprøver. Promotor hypermethylering af RFC signifikant omvendt korreleret med dets mRNA ekspression (

P

= 0,005, Fishers eksakte test) (tabel 3). Af MSP, vi har registreret også RFC promotor hypermethylering i fem æggestokkene kræftceller SKOV-3, OVCA 420, OVCA433, TOV21G og SW626 (figur 3B), alle af dem viste nedreguleret RFC mRNA og protein-ekspression (figur 2B). I modsætning hertil blev der ikke methylerede alleler påvises (figur 3B) i den normale ovarieepitelet cellelinje HOSE 6-3 og to cancercellelinier OVCAR-3 og OC316, hvilket viste RFC mRNA og proteinekspression (figur 2B),

(A) Den relative mRNA-ekspression af RFC i SKOV-3 og OVCA 420 efter 5-aza-dc behandling med angivne koncentrationer i 72 timer. Hvert eksperiment blev udført tre gange. Barer, hjælp af fold ændring ± SD. *,

P

0,05. (B) Repræsentative ovariecancer (CA) (øverste panel) og æggestokkene cellelinier (lavere panel) af MSP på RFC methylering status. M, DNA-markør; P, positiv kontrol; N, negativ kontrol; M, methylerede alleler; U, umethylerede alleler.

Knockdown af FRα ændret folat-medieret celleproliferation i Skov-3 celler

Efter bekræftelse af specifikke knockdown af FRα mRNA og protein-ekspression i Skov-3 celler (figur 4A), vi først bestemmes virkningerne af FRα på folat-medieret celleproliferation ved MTT-assay. På dag 2 og 4, blev ingen signifikant ændring af celleproliferation fundet i kontrol og shFRα SKOV-3 celler efter folat behandling. Ved dag 6, viste kontrol celler proliferation i 12 og 60 nM folat behandling. På dag 8, 6, 12 og 60 nM folat-behandlede kontrolceller viste gør-afhængig proliferation. I modsætning hertil knockdown af FRα blokeret folat-medieret celleproliferation (figur 4B).

(A) Stabilt knockdown af FRα mRNA og protein i SKOV-3 som detekteret ved qPCR (venstre panel) og immunoblotting (højre panel ) henholdsvis. **,

P

0,005. (B) Cell proliferationshastighed af kontrol og shFRα SKOV-3-celler behandlet med 6, 12 og 60 nM folat ved 2, 4, 6 og 8 dage vises som gange ændring i forhold til kontrol uden folat behandling (0 nM). n = 3; *,

P

0,05. (C)

In vitro

migration (venstre panel) og invasion assays (højre panel) i kontrol og shFRα SKOV-3 celler behandlet med 0, 12 og 60 nM folat hjælp Transwell membran uden eller med Matrigel belægning hhv. Øvre paneler: repræsentative billeder af migrere eller invadere SKOV-3 celler. Lavere paneler: Cell migration eller invasion fra SKOV-3 præsenteret som procent af kontrol behandlet med 0 nM folat; n = 3; *,

P

0,05; **,

P

0,005. (D) Immunoblotting på FRα og E-cadherin hjælp proteinlysater fremstillet fra kontrol og shFRα SKOV-3 (venstre panel). Relativ E-cadherin protein niveau, som analyseres af ImageJ software (amerikanske National Institutes of Health); n = 3; *,

P

0,05; **,

P

. 0,005 (højre panel)

Folat gennem FRα inducerede SKOV-3 celle migration og invasion og ned-reguleret E-cadherin

Dernæst testede vi virkningen af ​​folat og FRα på SKOV-3 cellemigration og invasion. Baseret på virkningerne af folat på celleproliferation, 12 og 60 nM doser blev valgt til behandling af kontrol og shFRα SKOV-3-celler. Transwell migration og invasion analyser viste, at 12 og 60 nM folat betydeligt induceret celle migration og invasion i kontrol celler mens knockdown af FRα blokeret folat-medieret celle migration og invasion (figur 4C). Vi derefter bestemmes den mulige nedstrøms mål for folat medieret effekt på celle migration og invasion. Ekspressionen af ​​E-cadherin, en vigtig celle-celleadhæsionsmolekyle essentiel for regulering cellemotilitet, viste sig at blive reduceret gør-afhængigt efter folat behandling (figur 4D). En sådan nedregulering af E-cadherin efter folat behandling blev også ophævet efter knockdown af FRα.

Ektopisk overekspression af RFC i høj FRα udtrykker SKOV-3 modvirket folat-medieret celleproliferation, migration og invasion og restaureret E -cadherin ekspression

Vi har vist overekspression af FRα og reduceret ekspression af RFC i ovariecancere, hvilket antyder, at de kan udøve modstående roller i udviklingen af ​​kræft i æggestokkene. Endnu vigtigere er, i patienter med høje FRα, den overordnede og sygdomsfri overlevelse var signifikant længere i dem med høj RFC udtryk, implicerer den beskyttende rolle RFC i høje FRα kræftformer. For at belyse en sådan beskyttende rolle,

in vitro

funktionelle foretaget studier FRα-positive SKOV-3 celler med ektopisk udtrykte RFC efter folat behandling. RFC fandtes at modvirke folat-medieret celleproliferation (figur 5A), migration og invasion (figur 5B). Desuden blev nedregulering af E-cadherin i celler efter folat behandling også ophævet efter overekspression RFC (figur 5C).

(A) Cell proliferationshastighed af SKOV-3-celler med ektopisk udtrykt RFC eller kontrol vektor ( kontrol) behandlet med 60 nM folat efter 5 dage vises som gange ændring sammenlignet med kontrol uden folat behandling (0 nM); n = 3; *,

P

0,05. (B)

In vitro

migration (venstre panel) og invasion assays (højre panel) i Skov-3 celler med ektopisk udtrykte RFC eller kontrol vektor behandlet med 0 og 60 nM folat vises som procent af kontrol behandlet med 0 nM folat; n = 3; *,

P

0,05; **,

P

0,005. (C) Immunblotting af RFC og E-cadherin hjælp proteinlysater fremstillet fra SKOV-3-celler med ektopisk udtrykt RFC eller kontrol vektor (venstre panel). Relativ E-cadherin protein niveau, som analyseres af ImageJ software (amerikanske National Institutes of Health); n = 3; **,

P

. 0,005 (højre panel)

Diskussion

I denne undersøgelse, vi demonstrerede den gradvise stigning i FRα mRNA og protein-ekspression fra ikke-tumorvæv, godartede og borderline tumorer til carcinomer. Desuden blev FRα genamplifikation som en mulig mekanisme af dets overekspression også påvist for første gang i ovariecancere. Overekspression af FRα i ovariecancere [19], [20] samt i kræft i nyre, lunge og bryst er tidligere blevet beskrevet [32]. Vore resultater viser også, at en høj FRα ekspression korrelerer med dårlig histologisk bedømmelse og fremskredne stadier af sygdommen, tyder på roller i æggestokkene tumorprogression.

I modsætning til FRα, en lavere RFC mRNA og proteinekspression i ovariecancere var fundet ved sammenligning med normale væv eller benigne tumorer. RFC udtrykkes ubikvitært i normalt væv og er den største folat transportsystem til transport af naturlige folater, såsom 5-methyl eller 5-formyl tetrahydrofolat (THF), og antifolater, såsom methotrexat (MTX) og pemetrexed [16]. 5-methyl THF er en cofaktor essentiel for DNA-methylering, som normalt fører til undertrykkelse af onkogener [33]. Således tab af RFC er blevet beskrevet at bidrage til colon carcinogenese [21]. I denne undersøgelse fandt vi, at en reduceret ekspression af RFC var signifikant associeret med kortere overordnede og sygdomsfrie overlevelse, hvilket antyder, at RFC kan betragtes som en markør for god prognose hos patienter med ovariecancer. Desuden blandt patienter med høje FRα udtrykker ovariecancer, den overordnede og sygdomsfri overlevelse var signifikant bedre i dem med høj RFC udtryk end dem uden, implicerer den beskyttende rolle RFC for patienter med disse tumorer.

Vi viste også, at FRα amplifikation og RFC promotor-methylering korreleret med mRNA ekspression i ovariecancere. I tidligere rapporter har RFC promotor methylering blevet fundet i brystkræftceller [34] og primære lymfomer [35]. Vores resultater viste, at opregulering af FRα (en formodet onkogene folat transporter) og nedregulering af RFC (en formodet tumor suppressor typen folat transporter) blev styret genetisk og epigenetisk henholdsvis under æggestokkene udvikling af kræft.

Som nævnt i indledningen ovenfor, folat er afgørende for DNA-syntese [12], [13], [14], derved indirekte udøver sin virkning på celleproliferation. Overekspression af FRα i NIH /3T3-celler er blevet rapporteret at inducere øget cellevækst in vitro og in vivo [36]. Brug folat ved forskellige doseringer i området fra 12 nM (betragtes som kosten mangelfuld i Nordamerika) til 60 nM (betragtes som normalt for supplere ikke-brugere), var vi i stand til at demonstrere celledeling i FRα-positive SKOV-3 celler [13]. Omvendt, når FRα blev knockdown af shRNA fremgangsmåde, var dette folat-medieret celleproliferation i SKOV-3-celler tabt, hvilket bekræfter det faktum, at folat faktisk transporterer gennem FRα under processen med ovariecancer celleproliferation. Tilsvarende er intracellulær ekspression af anti-FR antistoffer i ovariecancerceller blevet rapporteret at udøve væksthæmmende effekter som vist ved reduceret kolonidannelse i blød agar [37].

Udover dets virkninger på celleproliferation, vi også demonstreret