PLoS ONE: Long Term Effekt af curcumin i Restaurering af Tumor Suppressor p53 og fase-II Antioxidant Enzymer via Aktivering af Nrf2 Signalering og Modulation for Inflammation i forebyggelse af kræft

abstrakt

Inhibering af carcinogenese kan være en konsekvens af dæmpning af oxidativt stress via aktivering af antioxidantforsvarssystem, restaurering og stabilisering af tumor suppressor proteiner sammen med modulering af inflammatoriske mediatorer. Vi har tidligere afgrænset væsentlig rolle for curcumin under dets langsigtede effekt i regulering af glycolytiske vej og angiogenese, som igen resulterer i forebyggelse af kræft via modulation af stress aktiverede gener. Nærværende undersøgelse var designet til at undersøge langsigtede effekt af curcumin i reguleringen af ​​Nrf2 medierede fase-II-antioxidant enzymer, tumor suppressor p53 og betændelse under oxidative tumor mikromiljø i lever af T-celle lymfom, der bærer mus. Inhibering af Nrf2 signalering observeret under lymfom progression, resulterede i nedregulering af fase II antioxidant enzymer, p53 samt aktivering af inflammatoriske signaler. Curcumin potenseret signifikant stigning i Nrf2 aktivering. Det restaurerede aktivitet af fase-II-antioxidant enzymer som GST, GR, NQO1, og tumor suppressor p53 niveau. Desuden curcumin moduleret inflammation via opregulering af TGF-β og gensidig regulering af iNOS og COX2. Undersøgelsen tyder på, at i løbet af langsigtet effekt, curcumin fører til forebyggelse af kræft ved at inducere fase-II-antioxidant enzymer via aktivering af Nrf2 signalering, restaurering af tumor suppressor p53 og modulering af inflammatoriske mediatorer som iNOS og COX2 i lever af lymfom bærende mus.

Henvisning: Das L, Vinayak M (2015) Long Term Effekt af curcumin i Restaurering af Tumor Suppressor p53 og fase-II Antioxidant Enzymer via Aktivering af Nrf2 Signalering og Modulation for Inflammation i forebyggelse af kræft. PLoS ONE 10 (4): e0124000. doi: 10,1371 /journal.pone.0124000

Academic Redaktør: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore

Modtaget: December 3, 2014 Accepteret: 24. februar, 2015; Udgivet: April 10, 2015

Copyright: © 2015 Das, Vinayak. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. arbejdet blev støttet af tilskud fra Institut for Videnskab og Teknologi (Grant nr-SR /S0 /AS-97/2007), Indiens regering til MV. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nuclear faktor E2-relateret faktor 2 (Nrf2) er en kritisk transkriptionsfaktor som binder til promotorområdet af et antal gener, der koder fase-II antioxidant enzymer [1]. Nrf2 er korreleret med rutinemæssig afgiftning proces og dens forøgede ekspression er blevet beskrevet i murin lever, tarm, lunge og nyre. Der eksisterer stor lighed mellem Nrf2 bindende sekvens (NF-E2 konsensus sekvens) og antioxidant responselement (ARE), der regulerer elementer i promotorområdet af fase-II-antioxidant enzymer såsom GST og NQO1. GST har beskyttende rolle mod oxidative processer og spiller en afgørende rolle i afgiftning af forskellige xenobiotika i maligne celler eller væv. GST også udviser flere ikke katalytiske funktioner som intracellulær transport af et bredt spektrum af hydrofobe ligander og modulation af signaltransduktionsvej, som fører til sekvestrering af kræftfremkaldende stoffer [2]. NQO1 er en cytosolisk flavoprotein udtrykt konstitutivt i en lang række af mammale væv og cellelinier. Det katalyserer to-elektron reduktion af adskillige miljømæssige elektrofile stoffer og endogene forbindelser, forhindrer generering af ROS, indfanger oxygenradikaler og dermed viser en direkte rolle i beskyttelse mod oxidativt stress. NQO1 regulerer stabilitet af p53 som reaktion på oxidativ stress [3]. Tumor suppressor p53 begrænser unormale celler ved induktion af vækststandsning /udløser apoptose. p53 viser også antioxidant egenskab, der beskytter genomet fra oxidation af ROS, hvilket er en væsentlig årsag til DNA-skader og genetisk ustabilitet, der fører til oncogen transformation [4, 5]. Nrf2 er afgørende for at opretholde glutathion (GSH) redox tilstand via transkriptionel regulering af GR [6]. GSH er en fremherskende intracellulær thiol indeholdende antioxidant i leveren. Den udviser alsidige funktioner som regulering af genekspression, apoptose og antioxidant forsvar i retning modulering af celleproliferation. p53 deficiente cancerceller er rapporteret at udvise reduceret induktion af Nrf2 målgener sammenlignet med p53 dygtige celler, hvilket antyder vigtig rolle af p53 i aktivering af Nrf2 i cancerceller [7].

vildtype p53 og TGF β er centrale tumorsuppressorer som regulerer en række cellulære responser. p53 fysisk interagerer med Smads og co-ordinately inducerer transskription af en række centrale tumor undertrykkende gener [8]. TGF-p fungerer som en anti proliferativ faktor på tidlige stadier af kræft og regulerer cellecyklus via nedstrøms target gener involveret i kørsel celleproliferation [9, 10]. Det inducerer apoptose i humane lymfomceller og undertrykker inflammation [11, 12, 13]. Fremme af inflammation reguleres af COX2 via syntese af PGE2 i forskellige væv. Ekspression af COX2 samt PGE2 produktion reguleres af TGF-β1 [14, 15, 16]. COX2 ofte co-udtrykkes med iNOS og begge er involveret i udviklingen af ​​kræft ved at regulere proliferation, apoptose og angiogenese osv iNOS spiller en central rolle i formidling af inflammation via nitrogenoxid (NO) biosyntesen, som igen modulerer COX2 udtryk og PGE2-syntese i inflammatorisk tilstand [17]. Moderat forøget niveau af iNOS-ekspression fremmer tumorvækst, hvorimod rapporteres yderligere stigning i niveauet at være cytotoksisk for tumorceller, således iNOS viser dobbeltrolle under tumorudvikling [18]. Leveren er rapporteret at besidde en særegen egenskab, hvor tumorceller inducerer endogen NO-frigivelse via opregulering af iNOS, hvilket fører til drab af sinusformet tumorcelle og reduceret hepatisk metastase [19]. At være en stor metaboliske og afgiftende organ i kroppen, lever tager aktiv rolle i anti oxidative forsvarssystem og er stærkt påvirket i fremskreden kræft. Metastase og malignitet har tidligere været bekræftet i lever af Daltons lymfom leje (DL) mus [20].

Anvendelse af hele ekstrakt af plantestoffer kilde eller enkelt-isolerede bestanddel eller en metabolit af en isoleret bestanddel, for at opnå ønskelige sundhedsmæssige fordele har været et problem for de sidste mange år. Curcumin er et polyphenolisk phytochemical rapporteret at hæmme kemisk induceret carcinogenese på flere orgel websteder i forskellige dyremodeller. Hurtig metabolisme og elimination er vigtige faktorer med lav biotilgængelighed af curcumin på vævsniveauer, uanset indgivelsesvejen, selvom metabolitter af curcumin forblive længere tid i forskellige væv. Men langsigtet effekt af curcumin, efter fjernelse af administration er endnu ikke rapporteret. Det er ikke klart, om anti-kræftfremkaldende virkning af curcumin er forårsaget af den kumulative virkning af dets metabolitter eller på grund af selve curcumin. Endvidere er det bevist, at forbruget af hele eller delvist oprensede fødevareekstrakter er mere fordelagtig i single-isoleret bestanddel på grund af eksistensen af ​​synergistiske interaktioner blandt fytokemikalier i hele fødevarer [20, 21]. Tidligere har vi rapporteret, at anticarcinogenic virkning af curcumin under dets langsigtede effekt er medieret via regulering af glycolytiske vej og angiogenese, som et resultat af konsekvensen af ​​modulation af stress aktiverede gener [20]. Present studiet er designet til at undersøge langsigtede effekt af curcumin i reguleringen af ​​Nrf2 medieret fase-II-antioxidant enzymer, tumor suppressor p53 og betændelse under oxidative tumor mikromiljø i metastatisk lever af Dalton lymfom bærer mus.

Materialer og metoder

kemikalier

Alle kemikalier var af analytisk og molekylær biologi klasse samt endotoksin gratis, og anvendes uden yderligere rensning. Curcumin, blev reagenser til RNA-isolering, Taq polymerase, PMSF, menadion, Sephadex G50 og HRP konjugeret anti-β actin antistof købt fra Sigma-Aldrich. Revers transkriptase, ribonucleaseinhibitor, tilfældige primere (hexamerer), 100 bp Plus DNA stigen og Klenow enzym fra Fermentase Life Science og TURBO DNA-Free

TM Kit jeg blev købt fra Ambion. Genspecifikke primere for RT-PCR blev syntetiseret fra Metabion. Anti-muse p53-antistof fra Imgenix, anti-muse iNOS og COX2 antistof fra Cayman og HRP-konjugeret gede-anti-kanin sekundært antistof fra Bangalore Genie. Radioaktivt mærket α

32P-dCTP fra bestyrelse Stråling og Isotop Technology (BRIT) og ECL (Super signal Kit) blev købt fra PIERCE Biotechnology HYSEL India Pvt. Ltd

Dyr og induktion T-celle lymfom (Dalton lymfom)

Mus (

Mus musculus

, AKR stamme) blev avlet og opretholdt under standard laboratorieforhold med korrekt human pleje, som pr retningslinjerne i den institutionelle dyr etisk komité, ved 25 ± 2 ° C under 12 timers lys /12 timer mørke tidsplan og forsynet med standard mus foder, drikkevand

ad libitum

. Alle eksperimenter dyr blev udført med godkendelse af Institutional Animal Komité, Banaras Hindu University. Sunde voksne hanmus (30 ± 2 g, 16-20 uger gamle) blev anvendt i det eksperimentelle arbejde. Dalton lymfom ascites-celler blev transplanteret i voksne hanmus gennem intraperitoneal (i.p.) seriel transplantation, som tidligere [20] beskrevne. Dalton lymfom ascites celler blev begavet af prof Ajit Sodhi, School of Biotechnology, Banaras Hindu University, Varanasi, Indien. Dalton lymfom er en transplanterbar non-Hodgkins murine T-celle lymfom, opstod i thymus af DBA /2 mus ved National Cancer Institute, Bethesda, MD, i 1947. [22].

Udvikling af DL var bekræftet ved abdominal hævelse og øget kropsvægt, som var synlige tydeligt på 10-11 dage efter transplantation og DL mus overlevede i 20 ± 2 dage. Vækst af Daltons lymfom viste ikke nogen større ændring i kropsvægt og ascites væskeophobning under første 7-9 dage startende fra næste dag i DL transplantation (S1 Fig). Således første 7-9 dage kan sammenlignes med nølefase /forberedende fase af S-formede kurve for vækst ascites cellepopulation. Derfor tidsplan for curcumin behandling til DL-mus blev valgt i overensstemmelse hermed i 9 dage startende fra næste dag i DL transplantation og mus blev aflivet på dag 18 af post DL transplantation (før DL mus dør naturligt) for at få den langsigtede effekt af curcumin. Hvis curcumin administreres gennem i.v /i.p, er det metaboliseres til dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin og hexahydrocurcuminol. forventes curcumin at være fuldstændig metaboliseres til dets metabolitter under sidste 9 dage efter behandling. Derfor bør effekten ikke skyldes direkte virkning af curcumin, men kan skyldes metabolitter af curcumin [20].

Planlæg af curcumin behandling til DL mus og væv samling

Seks grupper af mus blev taget med 6 mus i hver gruppe (n = 6) og curcumin behandling til DL-mus var planlagt som tidligere [20] beskrevne. Alle mus blev aflivet på dag 18 post DL transplantation (for at undgå septisk tilstand før DL mus dør på grund af tumor) ved humant euthanization (cervikal dislokation efter bedøvede; mus blev eksponeret til ether præsenteret på en bomuldsgaze inde i et lille kammer og ether koncentration var ca. 80 pi /liter volumen af ​​beholderen). Leveren blev udskåret umiddelbart efter aflivning og vasket i afkølet normal saltopløsning og væv fra hver gruppe (n = 6) blev samlet og hakket aseptisk ved 4 ° C i gennemsnit resultat. Vævet blev anvendt øjeblikkeligt eller opbevaret ved -80 ° C til yderligere undersøgelse.

Elektroforetisk mobilitet (EMSA)

Nuclear protein blev ekstraheret og bindingsaffinitet til Nrf2 sekvenser blev bestemt ved elektroforetisk mobilitet (EMSA) som beskrevet tidligere [23, 24, 25]. Renset syntetisk oligonukleotidprober svarende til NF-E2-konsensussekvens (sense 5′-TGGGGAACCTGTGCTGAGTCA-3 ‘, antisense 5′-CTCCAGTGACTCAGCACAGGTTCC-3′ eller ER-konsensussekvens (sense 5’-AGTCACAGTGACTCAGCAGAAT-3 ‘, antisense 5’-AGATTCTGCTGAGTCACTGTGA -3) blev udglødet, ende mærket med [α-32P] CTP hjælp Klenow enzym. Titrering for specificitet og bindende affinitet syntetiseret oligonukleotid svarende til ARE og NFE2 bindende element blev bestemt ved hjælp af umærket probe som bestemt konkurrent og poly-dI /dC som ikke-specifik konkurrent henholdsvis. intensiteten af ​​kompleks på autoradiogram blev fotograferet og analyseret ved densitometrisk scanning under anvendelse Alpha Image Analyser System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

RNA-isolering og RT-PCR

RNA-isolering, cDNA-syntese og amplifikation blev udført som beskrevet tidligere [20, 23, 24, 25]. Ekspression af Nrf2, isozymer af GST, GR, NQO1, p53, TGF-β1, iNOS og COX2 gener blev undersøgt ved semi-kvantitativ RT-PCR under anvendelse af syntetiserede cDNA. De passende primerpar (S1 tabel) blev anvendt til PCR-reaktioner ved anvendelse Termocycler (Applied Biosystem). Band intensiteten af ​​amplificerede produkter blev visualiseret, fotograferet og analyseret ved hjælp af Gel Doc System (Alpha Innotech

EF) og værdier blev normaliseret med β-actin som intern kontrol.

Aktivitet gel assay

aktivitet af GR og NQO1 samt aktivitets- og isozym mønstre af GST blev målt ved i gel aktivitet farvning. Ikke-denaturerende PAGE-analyse af antioxidant enzymer blev foretrukket frem immunodetektion, fordi ændringer i aktiviteten af ​​et enzym er forbundet med metaboliske ændringer og fremgangsmåde anvender substratspecificitet baseret detektion af kun aktiv del af enzymer i den samme gel. Det anses yderst relevant for at korrelere en ændring i niveauet af en specifik isozym med den af ​​metaboliske forandringer på celleniveau [20].

Glutathion-S-transferase (GST).

Aktiviteten gel blev udført ved ikke-denaturerende PAGE, som pr fremgangsmåden ifølge Ricci et al. med mindre modifikation [26]. Samme mængde protein fra hver prøve blev separeret ved 10% ikke-denaturerende PAGE ved 4 ° C. Gelen blev inkuberet i 100 mM kaliumphosphatbuffer (pH-6,5) indeholdende 4,5 mM GSH, 1 mM CDNB og 1 mM NBT ved 37 ° C i 10-15 minutter under forsigtig omrøring. Derefter blev gelen vasket i vand og overført til en opløsning af 100 mM Tris-CI (pH-9,6) indeholdende 3 mM PMS i 3-5 min og belyst i lyset indtil fremkomsten af ​​blå formazen komplekse bånd på gelen. Bandet intensiteten af ​​forskellige isozymer blev synliggjort, fotograferet og analyseret ved hjælp af Gel Doc System (Alpha Innotech

EF).

Glutathion-reduktase (GR).

Aktiviteten farvning af GR blev udført ifølge fremgangsmåden af ​​Hou et al. [27]. Samme mængde protein fra hver prøve blev separeret med 8% ikke-denaturerende PAGE ved 4 ° C. Efter fuldstændig elektroforese blev gelen gennemvædet i 50 mM Tris-CI (pH-7,9) indeholdende 4 mM GSSG, 1,5 mM NADPH og 2 mM DTNB i 30 minutter ved stuetemperatur, skyllet med 50 mM Tris-CI (pH-7,9) og overført til 1,2 mM NBT og 1,6 mM PMS. GR-aktivitet blev negativt farvet i mørke i 10-15 minutter ved stuetemperatur under forsigtig omrysten og derefter udsat for lys, indtil fremkomsten af ​​klare zoner af GR-aktivitet band. Gelen blev vasket i vand til affarvning og båndintensitet blev visualiseret, fotograferet og analyseret under anvendelse Gel Doc System (Alpha Innotech

EF)

NAD (P) H:.. Quinin oxidoreductase (NQO1)

-gel blev udført aktivitet farvning af NQO1 som beskrevet af Wrobel et al. [28]. Samme mængde protein fra hver prøve blev separeret ved 10% ikke-denaturerende PAGE ved 4 ° C. Efter elektroforese blev gelen farvet i 50 mM Tris-CI (pH-7,5), 0,3 mg /ml MTT, 1 mM NADH og 30 uM menadion under forsigtig skvulpen i mørke, indtil farven udvikles (10-15 min) i de områder, der har NQO1 aktivitet. Reaktionen blev standset ved at overføre gelen til en 5% (v /v) opløsning af eddikesyre. Band intensitet blev visualiseret, fotograferet og analyseret ved hjælp af Gel Doc System (Alpha Innotech

EF).

Estimering af redox status

Samlet glutathion og reduceret glutathion blev bestemt som total sulfhydryl (T- SH-indhold) og ikke-protein-sulfhydryl (NP-SH) indhold henholdsvis anvendelse af molære absorptionskoefficient 13100 M

-1 cm

-1, og blev udtrykt i mikro mol pr mg protein [29]. Redox status blev beregnet i forhold til NP-SH til indhold proteinbundet sulfhydryl (P-SH).

Western blotting

Lige mængde protein fra hver prøve blev separeret i 10% SDS PAGE og overført til PVDF-membran natten over ved 4 ° C. Membranen blev blokeret i 5% fedtfri mælk i PBS (pH 7,4) i 2 timer ved stuetemperatur. Blottet blev inkuberet natten over ved 4 ° C med kanin-anti-muse p53 (1: 500 fortynding, Imgenix) eller kanin-anti-muse iNOS (1: 200 fortynding, Cayman) eller kanin-anti-muse COX2 (1: 500 fortynding, Cayman) i 1% BSA og 0,05% Tween-20 i PBS (pH 7,4). Blottet blev vasket og inkuberet med HRP-konjugeret gede anti-kanin IgG (1: 2500 fortynding, Bangalore Genei) i PBS (pH 7,4) indeholdende 1% BSA og 0,05% Tween-20 i 2 timer ved stuetemperatur. Immunreaktive proteiner blev påvist med ECL super signal kit (Pierce Biotechnology) i røntgenfilm. Band densitetsværdier blev normaliseret med β-actin

nitrogenoxid (NO) Indhold

NO niveau i leveren blev estimeret ved hjælp af Griess reagens.; 100 pi leverhomogenat blev blandet med 100 pi Griess-reagens (0,1% naphthylethylendiamin-dihydrochlorid, og 1% sulfanilamid i 5% phosphorsyre), inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur og absorbansen blev målt ved 540 nm med en pladeaflæser (ECL ELISA-læser) . Koncentrationen af ​​NO blev bestemt ved hjælp af en standardkurve, der genereres ved at tage kendte mængder af natriumnitrit og værdier blev udtrykt i mg ækvivalens NaNO2 /mg protein

Statistisk analyse

Statistisk analyse var udført af SPSS-software ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af Tucky test. Værdier blev udtrykt som middel ± S.E.M. opnået fra tre forskellige sæt af eksperimenter, s. 0,05 blev taget som statistisk signifikant (95% konfidensinterval) sammenlignet med N-gruppe (#) og DL + DMSO-gruppen (*)

Resultater

Effekt af curcumin på binding af Nrf2 med eR konsensus sekvens

Specificitet og bindende affinitet syntetiseret oligonukleotid svarende til antioxidant respons element (eR konsensus sekvens) blev valideret. Titrering med umærket sonde (kold probe) som bestemt konkurrent og med ikke-specifik konkurrent (poly-dI /dC) bekræftede specificitet og affinitet henholdsvis [Fig 1A og 1B]. Intensiteten af ​​specifikke DNA-protein-kompleks (ER-Nrf2) opnået i DL og DL + DMSO mus, var ca. 60% og 56% af normale mus hhv. Betydelig aktivering og nuklear translokation af Nrf2 blev induceret ved curcumin behandling op til 148%, 164% og 143% af DL + DMSO mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis [Fig 1 (C)].

Effekt af curcumin på DNA bindende aktivitet af Nrf2 med ER konsensus-sekvenser. (A) Titrering med umærket probe så specifik konkurrent. (B) Titrering med poly-dI /dC som ikke-specifik konkurrent. (C) Autoradiogram viser Nrf2-ER kompleks (D) Densitometrisk scanning af Nrf2-er komplekse. Lever af alle seks dyr i hver gruppe blev samlet separat og anvendes til ekstraktion af kerneprotein. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. # Og * betegner signifikant forskel i forhold til N og DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin og legemsvægt er kropsvægt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 betegner normal, Dalton lymfom bærende, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Daltons lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt opløst i DMSO hhv.

Effekt af curcumin på binding af Nrf2 med NF-E2 konsensus sekvens

Titrering med umærket probe som bestemt konkurrent og poly-dI /dC som ikke-specifik konkurrent bekræftede specificitet og affinitet henholdsvis [fig 2A og 2B]. Intensiteten af ​​specifikke DNA-protein-kompleks (NF-E2 med Nrf2) i DL og DL + DMSO mus, var ca. 32% og 70% af normale mus hhv. Intensiteten af ​​komplekset viste sig at være signifikant induceret med 100 mg curcumin /kg legemsvægt, som var omtrent op til 144% af DL + DMSO mus [Fig 2 (c)].

Virkning af curcumin på DNA binding aktivitet af Nrf2 med NFE2 konsensussekvenser. (A) Titrering med umærket probe så specifik konkurrent. (B) Titrering med poly-dI /dC som ikke-specifik konkurrent. (C) autoradiogram, der viser Nrf2-NFE2 kompleks (D) densitometrisk scanning af Nrf2-NFE2 kompleks. Lever af alle seks dyr i hver gruppe blev samlet separat og anvendes til ekstraktion af kerneproteiner. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. # Og * betegner signifikant forskel i forhold til N og DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin og legemsvægt er kropsvægt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 betegner normal, Dalton lymfom bærende, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Daltons lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt opløst i DMSO hhv.

Effekt af curcumin på ekspressionen af ​​Nrf2 mRNA

udtryk for Nrf2 blev nedreguleret i DL og DL + DMSO mus op henholdsvis ca. 63% og 73% af normale mus, som var signifikant op reguleret mod normalt niveau ved curcumin behandling. Udtrykket af Nrf2 var 107%, 127% og 108% af DL + DMSO med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis [Fig 3].

Effekt af curcumin på mRNA ekspressionen af ​​Nrf2. (A) RT-PCR af Nrf2 og β-actin. (B) densitometrisk scanning af Nrf2 efter normalisering med β-actin. Lever af alle seks dyr i hver gruppe blev samlet separat og anvendes til ekstraktion af total RNA. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. # Og * betegner signifikant forskel i forhold til N og DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin og legemsvægt er kropsvægt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 betegner normal, Dalton lymfom bærende, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Daltons lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt opløst i DMSO hhv.

Effekt af curcumin på mRNA-ekspression og enzymatiske aktivitet af GST isozymer

Der blev observeret udtrykket og aktivitet af fem isozymer af GST nemlig GSTa, GSTm, GSTP, GSTt og GSTo i mus leveren, hvor GSTa viser sig at være den mest rigelige isozym. Sammenlignet med normale mus, ekspression af GSTa, GSTm, GSTP, GSTt og GSTo blev nedreguleret omtrent op 30%, 71%, 80%, 50% og 71% i DL-mus og ca. 35%, 61%, 82% , 68%, og 76% i DL + DMSO mus. Curcumin behandling induceret ekspression af fem isozymer med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt i forhold til DL + DMSO, der var som følger-GSTa: 137%, 180%, 150%; GSTm: 117%, 110%, 125%; GSTP: 113%, 107%, 108%; GSTt: 102%, 122%, 115%; GSTo:. 107%, 108% og 102% henholdsvis [Fig 4 (A)]

Effekt af curcumin på ekspression amp; enzymatisk aktivitet af GST isozymer (A) RT-PCR af GST isozymer og β-actin (B) densitometrisk scanning af GST isozymer efter normalisering med β-actin. (C) Specifik farvning viser aktiviteten af ​​GST isozymer. (D) densitometrisk scanning af aktiviteten bånd af GST isozymer. Lever af alle seks dyr i hver gruppe blev samlet separat og anvendes til ekstraktion af total RNA og proteiner. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. # Og * betegner signifikant forskel i forhold til N og DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin og legemsvægt er kropsvægt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 betegner normal, Dalton lymfom bærende, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Daltons lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt opløst i DMSO hhv.

aktiviteterne i fem isoenzymer af GST ligesom GSTa, GSTm, GSTP, GSTt og GSTo fulgte ikke samme variation mønster som udtryksform. Aktiviteten af ​​GSTa, GSTm og GSTP blev reduceret i DL og DL + DMSO-mus, hvor som GSTt og GSTo isozymer viste induceret aktivitet i DL og DL + DMSO-mus i sammenligning med normale mus. Faldet i aktiviteten af ​​GSTa: 46%, 41%; GSTm: 59%, 67% og GSTP: 35%, 21% i DL og DL + DMSO-mus henholdsvis sammenlignet med normale mus. Men GSTt og GSTo isozymer viste induceret aktivitet op 172% og 123% i tilfælde af GSTt og 145% og 126% i tilfælde af GSTo henholdsvis i DL og DL + DMSO-mus i sammenligning med normale mus. Curcumin moduleret aktivitet af isozymer af GST mod normale niveau. GSTa, GSTm og GSTP blev stimuleret forskelligt med forskellige doser af curcumin behandling. Alle doser af curcumin forhøjet aktivitet GSTa og GSTP. GSTa blev ophøjet op ca. 132%, 155%, 143% og GSTP op ca. 247%, 366%, 420% af DL + DMSO mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt hhv. Imidlertid blev aktiviteten af ​​GSTm stimuleret signifikant op 156%, 106% med 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis. Fald i aktivitet GSTt var op ca. 94%, 81% med 50 og 100 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis og GSTo op ca. 75% med 50 mg curcumin /kg legemsvægt i forhold til DL + DMSO mus [Fig 4 (C)] .

Effekt af curcumin på mRNA-ekspression og enzymatiske aktivitet af GR

udtryk for GR i leveren hos DL og DL + DMSO mus nedreguleret op ca. 58% og 72% af den normale mus henholdsvis. Curcumin behandling induceret ekspression af GR på en dosisafhængig måde. Op regulering af ekspressionen af ​​GR ved curcumin er ca 118%, 129%, 134% af DL + DMSO mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis [Fig 5A og 5B]. Aktiviteten af ​​GR blev fundet at være nedsat i DL og DL + DMSO-mus op ca. 69% og 70% af normale mus. Behandling af curcumin signifikant forhøjede aktivitet GR op ca. 126%, 136%, 109% af DL + DMSO mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis [Fig 5C og 5D].

Effect af curcumin på ekspression enzymatiske aktivitet af GR (A) RT-PCR for GR og β-actin (B) densitometrisk scanning af GR efter normalisering med β-actin. (C) Specifik farvning viser aktiviteten af ​​GR. (D) densitometrisk scanning af aktiviteten bånd af GR. Lever af alle seks dyr i hver gruppe blev samlet separat og anvendes til ekstraktion af total RNA og proteiner. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. # Og * betegner signifikant forskel i forhold til N og DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin og legemsvægt er kropsvægt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 betegner normal, Dalton lymfom bærende, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Daltons lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt opløst i DMSO hhv.

redox status

redox status i leveren af ​​lymfom bærende mus blev målt i form af reduceret versus oxiderede form af glutathion (NP-SH /P-SH), som redox status er også en vigtig indikator for oxidativt stress. Den status blev observeret at være 51% og 58% af normale mus i DL og DL + DMSO mus hhv. Alle tre doser forhøjede redox status betydeligt, hvilket var op ca. 131%, 159% og 124% af DL + DMSO mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis [Fig 6].

Effect af curcumin på cellulær redox status i form af NP-SH /P-SH. Lever af alle seks dyr i hver gruppe blev samlet separat og anvendes til ekstraktion af totale proteiner. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. # Og * betegner signifikant forskel i forhold til N og DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin og legemsvægt er kropsvægt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 betegner normal, Dalton lymfom bærende, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Daltons lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt opløst i DMSO hhv.

Effekt af curcumin på mRNA-ekspression og enzymatiske aktivitet NQO1

lymfom bærer mus viste reduceret ekspression af fase II antioxidant enzym NQO1. Ekspressionen blev nedreguleret i DL og DL + DMSO-mus op omkring 66% og 77% af normale mus. Curcumin behandling betydeligt op reguleret udtryk mod normale niveau (95% af normal) med en dosis på 100 mg curcumin /kg legemsvægt. Den øgede ekspression af NQO1 ved curcumin var ca. 104% og 123% af DL + DMSO mus med 50 og 100 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis [Fig 7A og 7B]. Aktiviteten af ​​NQO1, observeret af aktivitet gel assay følger variationen mønster af dets ekspression. Det viste sig at være nedsat i DL og DL + DMSO-mus op henholdsvis ca. 52% og 51% af normale mus. Curcumin behandling med 100 og 150 mg /kg legemsvægt forhøjet aktivitet NQO1 betydeligt, hvilket var ca. op 134% og 115% af DL + DMSO mus henholdsvis [Fig 7C og 7D].

Effekt af curcumin på mRNA udtryk enzymatiske aktivitet af NQO1 (A) RT-PCR af NQO1 og β-actin (B) densitometrisk scanning af NQO1 mRNA efter normalisering med β-actin. (C) Specifik farvning viser aktivitet NQO1. (D) Densitometrisk scanning af aktiviteten bånd af NQO1. Lever af alle seks dyr i hver gruppe blev samlet separat og anvendes til ekstraktion af total RNA og proteiner. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. # Og * betegner signifikant forskel i forhold til N og DL + DMSO gruppe hhv. Cur er curcumin og legemsvægt er kropsvægt. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 og DLT150 betegner normal, Dalton lymfom bærende, Dalton lymfom bærende mus behandlet med DMSO og Daltons lymfom bærende mus behandlet med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt opløst i DMSO hhv.

Effekt af curcumin på mRNA-ekspression og protein niveau af p53

p53 er et labilt protein, nedbrydes hurtigt under oxidativ stress. MRNA ekspression af Trp53 (p53-genet) viste sig at blive nedreguleret i DL og DL + DMSO-mus op omkring 43% og 40% af normale mus. Alle tre doser af curcumin induceret ekspression af Trp53 betydeligt. Op regulering af Trp53 udtryk var ca. op 200%, 240% og 223% af DL + DMSO mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis [Fig 8A og 8B]. Niveauet af tumor suppressor p53 protein følger tilsvarende variation mønster af dets ekspression. Proteinniveau blev reduceret i tilfælde af DL og DL + DMSO-mus op henholdsvis ca. 47% og 50% af normale mus. Curcumin behandling resulterede i betydelig forøgelse af niveauet af p53, hvilket var ca. 158%, 200% og 195% af DL + DMSO mus med 50, 100 og 150 mg curcumin /kg legemsvægt henholdsvis [Fig 8C og 8D].

< Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M.