PLoS ONE: En genetisk indkodede FRET Laktat sensor og dens anvendelse til påvisning af Warburg Effect i Single Cancer Cells

Abstrakt

Laktat er pendlet mellem og i celler, spille metaboliske og signalering roller i sundt væv. Lactat er også et forvarsel om ændret metabolisme og deltager i patogenesen af ​​inflammation, hypoxi /iskæmi, neurodegeneration og kræft. Mange tumorceller viser høje lactat produktion i nærvær af oxygen, et fænomen kendt som Warburg effekten, som har diagnostiske og muligvis terapeutiske implikationer. I denne artikel introducerer vi Laconic, en genetisk kodet Forster Resonance Energy Transfer (FRET) -baseret laktat sensor designet på den bakterielle transkriptionsfaktor LldR. Lakonisk kvantificeret lactat fra 1 uM til 10 mM og blev ikke påvirket af glucose, pyruvat, acetat, betahydroxybutyrate, glutamat, citrat, α-ketoglutarat, succinat, malat eller oxalacetat i koncentrationer, der findes i pattedyr-cytosol. Udtrykt i astrocytter, HEK-celler og T98G gliomceller, sensoren tillod dynamisk estimering af lactat niveauer i enkelte celler. Anvendes i kombination med en blokker af den monocarboxylat transportør MCT, sensoren var i stand til at skelne, om en celle er en netto lactat producent eller en netto lactat forbruger. Anvendelse af MCT-blok-protokollen viste, at den basale rate af laktat produktion er 3-5 gange højere hos T98G gliomceller end i normale astrocytter. I modsætning hertil satsen for lactat akkumulering i afhængighed mitokondrie inhibering med natriumazid var 10 gange lavere i gliom end i astrocytter, i overensstemmelse med defekt tumor metabolisme. Et forhold mellem antallet af laktat produktion og hastigheden af ​​azid-induceret laktat ophobning, som kan estimeres reversibelt og i enkelte celler, blev identificeret som en meget følsom parameter i Warburg effekten, med værdier på 4,1 ± 0,5 til T98G gliom celler og 0,07 ± 0,007 for astrocytter. Sammenfattende denne artikel beskriver en genetisk kodet sensor til laktat og dens anvendelse til at måle laktat koncentration, laktat flux, og Warburg effekten i enkelte pattedyrceller

Henvisning:. San Martín A, Ceballo S, Ruminot I , Lerchundi R, Frommer WB, Barros LF (2013) En genetisk indkodede FRET Laktat sensor og dens anvendelse til påvisning af Warburg Effect i Single kræftceller. PLoS ONE 8 (2): e57712. doi: 10,1371 /journal.pone.0057712

Redaktør: Mika Jekabsons, University of Mississippi, USA

Modtaget: September 24, 2012; Accepteret: 24 Jan 2013; Publiceret: 26 feb 2013

Copyright: © 2013 San Martín et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Delvist understøttet af Fondecyt tilskud 1100936. den Centro de Estudios CientÍficos (central- og østeuropæiske lande) er finansieret af den chilenske regering gennem Centers of Excellence Basal Finansiering Program for CONICYT og Gobierno Regional de Los Rios. WBF blev understøttet af en bevilling fra National Institutes of Health (NIDDK, 1RO1DK079109). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lactat er et organisk anion, der deltager i den intermediære metabolisme af eukaryote og prokaryote celler. I mammale celler, er lactat fremstillet af pyruvat ved det cytosoliske enzym lactatdehydrogenase (LDH) og udveksles med det interstitielle rum og mellem subcellulære afsnit via monocarboxylat transportører (MCT). Hypoksiske væv og tumorer frigiver store mængder af lactat, og det var engang troede, at lactat frigivelse var altid patologisk, men det er nu ved at blive klart, at ud over dets rolle i hypoxi, lactat har vigtige funktioner hos raske oxygenerede væv. Intercellulære og subcellulære udveksling af lactat, betegnet lactat pendulkørsler, er en integreret del af den normale energimetabolisme af muskel og hjerne [1], [2]. I hjernevæv, trods normale eller forhøjede oxygen vævsniveauer, er neurale aktivitet ledsaget af en akut stigning i væv lactat. Hvorvidt og når neuroner producerer eller forbruger laktat under neurale aktivitet fortsat et kontroversielt spørgsmål [3] – [7], som vil få stor gavn af lactat målinger i de enkelte celler. Desuden lactat støtter myelinering proces [8], kan opføre sig som et intercellulært signal i neurovaskulære kobling og natrium sensing [9], [10], styrer sin egen produktion [11] og er nødvendig for langtidshukommelse formation [12 ], [13]. Patofysiologiske roller for laktat omfatter inflammation, sårheling, mikrobiel infektion, neurodegeneration og kræft [14] – [18].

Standard metoder til at måle laktat er baseret på enzymatiske reaktioner, der er efterfulgt af fotometrisk eller amperometriske procedurer. Disse fremgangsmåder er begrænsede, da de skal forbruge substrat og /eller kræver destruktion af prøven; ingen af ​​dem er i stand til at detektere intracellulær lactat ikke-invasivt i realtid eller med enkelt celle opløsning. Denne artikel beskriver en genetisk kodet reporter for lactat, brug af denne reporter til bestemmelse af laktat transport og metabolisk flux med forbedret Spatiotemporal opløsning, og udformningen af ​​en følsom parameter for kræft stofskifte.

Resultater

LldR flankeret af FRET Pair mTFP-Venus Reports [Laktat]

Genetisk kodet Förster Resonance Energy Transfer (FRET) nanosensorer er blevet udviklet til at måle de dynamiske ændringer i koncentrationen af ​​flere molekyler af biologisk interesse med forbedret Spatiotemporal opløsning. FRET sensorer er fusionsproteiner sammensat af en ligand-bindende del, elementet anerkendelse, og en fluorescerende par med overlappende emissions- og excitationsspektre, typisk CFP og YFP. Binding af test-molekylet forårsager en konformationel ændring, der påvirker den relative afstand og /eller orientering mellem de fluorescerende proteiner, der forårsager en stigning eller et fald i FRET effektivitet. Den her beskrevne nanosensor er baseret på LldR, en bakteriel transskription regulator, der består af to moduler, et lactat-binding /regulatorisk domæne og et DNA-bindende domæne [19], [20]. For at generere en laktat sensor, valgte vi LldR gener fra

Corynebacterium glutamicum

fra

Escherichia coli

som potentielle elementer anerkendelse. Den tredimensionelle struktur af to lactat bindende proteiner er næsten overlejres (fig. 1A), men de er kun 19,4% identiske, afviger i adskillige ladede rester, der kan ændre overfladen-charge scanning og eventuelt ændringen i FRET effektivitet [21] . Som et FRET-par, vi har valgt mTFP [22] og Venus [23], som, når man sammenligner med den fælles fiskeripolitik og YFP, er lysere og mindre pH-følsomme. Den generelle arkitektur af sensorerne er afbilledet i fig. 1B, med mTFP placeret ved N-terminus, det LldR flankeret af linkere, og Venus placeret ved C-terminalen. Otte varianter blev konstrueret for hver af de to gener ved anvendelse stedspecifik rekombination. Varianterne forskellige med hensyn til tilstedeværelsen af ​​DNA-bindende domæne og linkeren længde /sammensætning (sekvenser er tilgængelige i fig. S1). En sammenlignende analyse viste, at som svar til lactat

E. coli

og

C. glutamicum kimærer

ændret deres fluorescens-forholdet i modsat retning, og at konstruktionerne fra

E. coli

var mere lydhøre over for laktat. Overraskende, DNA-bindende domæne var vigtigt for FRET forandring. Som vist tidligere for glucose nanosensorer [21], lactat sensorer mangler kunstige linkere klaret sig bedre (Fig. 1C). Varianten med den højeste absolutte forhold ændring blev valgt til yderligere karakterisering. Denne nanosensor betegnes Laconic (Laktat Optical Nano Indicator fra central- og østeuropæiske lande) indeholder den fulde længde LldR fra

E. coli

uden kunstige linkere. Emissionen spektrum af Laconic var præget af de forventede tinder mTFP og Venus fluorescens ved 492 nm og 526 nm, henholdsvis og et fald i FRET effektivitet på laktat binding (Fig. 2A). Kinetikken for LldR for L-lactat er ikke kendt. Figur 2B viser, at Laconic opdaget laktat over fire størrelsesordener (fra 1 pM til 10 mM), i stedet for de to ordrer ydes af én-site sensorer såsom glucose nanosensorer [24]. Ved analyse

in vitro

, Laconic er mindst lige så følsomt som den bedste kommercielt tilgængelige enzym-baserede kit. Lactat-dosis-respons-kurver blev bestemt ved forskellige pH-værdier (fig. 2C), hvilket viser en lille effekt ved sure værdier og en mere markant effekt ved alkaliske værdier. Specificitet blev undersøgt ved at udsætte sensoren til et panel af metabolitter og påvistes nogle interferens for pyruvat og citrat (fig. 2D-I). Pyruvat ændrede ikke FRET-forholdet (Fig. 2D), men ved høje koncentrationer, pyruvat blokeret effekten af ​​lav lactat (fig. 2G). Den fysiologiske koncentration af pyruvat i pattedyrceller er lavere end 100 um og 10-50 gange lavere end den for lactat [1], og derfor endogent pyruvat bør ikke påvirke lactat sensing under fysiologiske betingelser. Citrat ved 1 mM øgede FRET ratio med 6% (fig. 2D) og reducerede respons af sensoren til høj lactat (fig. 2H). Ingen effekter blev observeret ved 10 uM eller 100 uM citrat (fig. 2D og 2H). Cytosolisk citrat er lavere end 100 uM [25] – [27], og forventes derfor ikke at interferere med laktat sensing i cytosolen. Dog kan mitokondrie sensing blive påvirket som mitokondrie citrat er 10 gange højere. Ekstreme redox-forhold opnås med kombinationer af NADH og NAD

+ [28], var uden synlig effekt på laktat sensing (fig. 2I).

(A) krystallografiske struktur af LldR fra

Corynebacterium glutamicum

[19], og 3D-strukturen af ​​LldR fra

Escherichia coli

forudsagt ved hjælp LldR fra

C. glutamicum

og FadR fra

E. coli

som skabeloner (M4T Server 3.0 fra Fišer Laboratory https://www.fiserlab.org/servers_table.htm). (B) Generel design: transkriptionel regulator LldR er klemt inde mellem fluorescerende proteiner mTFP og Venus, med kunstige peptider adskiller proteiner (blå og orange linkere). (C) Effekt af 10 mM lactat på fluorescensforholdet af 8 varianter af lactat sensor baseret på LldR fra enten

E. coli

eller

C. glutamicum

. Den mest responsiv af konstruktionerne, der er angivet med pilen, blev anvendt i resten af ​​undersøgelsen.

(A) Emission spektre i fravær og nærvær af 10 mM lactat. (B) Forholdet mellem mTFP og Venus fluorescens (ved 430 nm excitation) blev målt ved 0, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5 og 10 mM lactat. Den fuldt optrukne linje svarer til den bedste tilpasning af en dobbelt rektangulær hyperbel til dataene, med tilsyneladende dissociationskonstant (K

D) værdier på 8 ± 2 um og 830 ± 160 pM, og respektive maksimale ΔR værdier på 8 ± 0,4% og 11 ± 0,4%. (C) lactat dosisresponskurver blev målt ved de angivne pH-værdier. Den fuldt optrukne linje svarer til den bedste pasform af en dobbelt rektangulær hyperbel til dataene ved pH 0,4. (D) Respons af sensoren til 5 mM lactat, pyruvat, acetat, glutamat, β-hydroxy-butyrat og glucose, 1 mM af α-ketoglutarat, succinat, malat eller oxalacetat, eller stigende koncentrationer af citrat (0,01, 0,1 og 1 mM). I paneler E til I blev lactat dosisresponskurver målt i nærvær af 1 mM acetat, glutamat, β-hydroxy-butyrat eller glucose (E), i 1 mM af α-ketoglutarat, succinat, malat eller oxalacetat (F) , i 0,25, 1 mM eller 10 mM pyruvat (G), i 0,01, 0,1 mM eller 1 mM citrat (H), og i 0,2 pM NADH, 100 uM NAD +, eller 0,2 uM NADH plus 100 uM NAD + (i). De kontinuerlige linjer svarer til den bedste pasform af en dobbelt rektangulært hyperbel at kontrollere data.

Laconic Rapporter Cytosoliske Laktat i pattedyrceller

Sensoren viste den forventede cytosoliske fordeling med nukleare udelukkelse, når udtrykt i HEK293-celler (fig. 3A). Selv om de fleste af sensoren blev fundet i cytosolen, kan muligheden for, at en lille fraktion lokaliserer til nucleus ikke udelukkes. Imidlertid forekommer det ikke sandsynligt, at sensoren binder til pattedyr-DNA, da denne type helix-turn-helix transkriptionel regulator ikke udtrykkes i pattedyrceller. Mere direkte, bindingen af ​​LldR at prokariotic DNA kræver 17-nukleotidsekvensen AATTGGCCCTACCAATT [20], som ifølge en blast-analyse er fraværende i pattedyrs genom. Rækkefølgen er også fraværende i eukaryote promotorer (EPD, eukaryote Initiativtagere Database, ExPASy). Muligheden for sensor forstyrrelse transskription, som vi ikke favorisere, kan løses ved at erstatte Ile 23 med serin, for nylig rapporteret at fjerne DNA-bindende aktivitet LldR [29].

(A) HEK293 celler udtrykker Laconic afbildet ved 440 excitation /535 emission). Scale bar er 20 um. (B) Fluorescens-forholdet blev målt til 0,01, 0,1, 1 og 10 mM ekstracellulær laktat i HEK293 celler behandlet med metaboliske hæmmere og permeabiliserede til H

+ som beskrevet i Materialer og Metoder. (C) Tidsforløbet for mTFP og Venus fluorescenser blev målt i nærvær af 2 mM glucose /1 mM lactat eller 10 mM pyruvat, som angivet. En celle med lav ekspression af sensoren kræver stærke belysning blev valgt til at demonstrere ufølsomhed af fluorescensforholdet til fotoblegning. Fluorescensforholdet blev omdannet til lactat koncentration anvendelse af forholdet i pyruvat (nul lactat) som beskrevet i teksten.

Til kalibrering, glykolyse blev blokeret med iodeddikesyre og mitokondriel metabolisme blev blokeret med rotenon, i fravær af glucose, og cellen blev pH-fastspændt med proton ionophor nigericine i et kalium-rige buffer. Med lactat flux standset og ingen pH-gradient, blev MCT anvendt til ækvilibrering lactat over plasmamembranen. Den resulterende kalibreringskurve (fig. 3B) var ens i form til den observeret med renset protein, hvilket tyder på, at sensoren

in situ

opfører sig som

in vitro

. Men ændringen i mTFP /Venus-forholdet på alle laktat koncentrationer var omkring dobbelt der observeret

in vitro

. Vi ved ikke, hvorfor det dynamiske område for sensoren er højere i celler. Mulige forklaringer omfatter negativ indblanding fra histidin tag bruges til

in vitro

rensning, og /eller bedre stabilisering af proteinet i det intracellulære miljø. Sensoren kunne ikke kalibreres i astrocytter, fordi i disse celler glucosemangel ikke nedbryder lactat, som vist ved en robust respons på pyruvat (se nedenfor) og mangel på svar på lave koncentrationer lactat (data ikke vist), muligvis forklares med vedvarende lactat produktion fra glycogen og /eller forskellige MCT affinitet. Selv i HEK celler, MCT permeabilitet er ikke lineær og alvorlige celle skader påført af kalibreringen kan have ændret sensoren protein. Af denne grund blev en mindre invasiv single-point kalibreringsprotokol udtænkt som kan påføres i løbet af eksperimenter uden at beskadige celler. For at tømme celler af laktat, tog vi fordel af en ejendom af MCT og andre befordrende transportører betegnes trans-acceleration eller accelereret udveksling [30]. Termodynamisk ligevægt for MCT afhænger af gradienter af lactat og pH, men er også påvirket af gradienten af ​​enhver anden substrat. En tvungen indad pyruvat gradient blev påført til at øge antallet af indadvendende tomme bindingssteder og formindske antallet af udadvendende tomme bindingssteder, øget lactat efflux og faldende lactat tilstrømning. En ny termodynamisk ligevægt kan kun nås, når intra: forholdet ekstracellulær laktat lig intra: extracelullar pyruvat-forhold. Som ekstracellulær laktat blev holdt tæt på nul ved overhældning af en laktat-fri løsning, er intracellulær laktat forventes at falde, som observeret i fig. 3C. Monochloracetate (MCA), en MCT substrat reduceret fluorescensforholdet i et tilsvarende omfang som pyruvat (Fig. S2), der angiver, at lactat produktion fra pyruvat er ubetydelig i forhold lactat ekstrudering gennem MCT. Dette kan forklares ved det faktum, at kombinationen af ​​høj pyruvat og ingen glucose alvorligt udtømmer NADH [28], [31], hvilket begrænser LDH reaktionen. Måling med en enzymatisk kit bekræftede, at MCA reducerer astrocytisk lactat (fig. S2). Med værdien for fluorescensforholdet på “nul” lactat, de kinetiske konstanter bestemmes

in vitro

, og under antagelse af en maksimal ændring af fluorescens-forhold på 38% (fra dosisresponskurven monteret på HEK datacelle) blev fluorescensdata omdannes til lactat koncentrationer som vist i fig. 3C. Yderligere validering af nul lactat protokol blev tilvejebragt af den iagttagelse, at man efter længere glucose /lactat berøvelse i HEK-celler, havde pyruvat ikke påvirke fluorescensforholdet (data ikke vist), i overensstemmelse med fuld lactat depletion og en meget lav NADH: NAD

+ forhold stede i glucose-berøvet celler [28], [31]. Ovennævnte beviser plus

in vitro

iagttagelse, at sensoren ikke reagerer på lavt lactat i nærvær af høj pyruvat (fig. 2G), tyder på, at fluorescensforholdet i nærvær af høje pyruvat er et godt estimat på nul lactat. Alligevel kan selv en lille residual signal indføre en betydelig skævhed og forsigtighed tilrådes ved brug af sensoren at kvantificere laktat, især i astrocytter.

Ved at styre udvekslingen af ​​laktat mellem celler og det interstitielle rum, MCT’er er nodal punkter af vævsmetabolisme. Optagelsen af ​​5 mM lactat af astrocytter blev inhiberet med 65 ± 3% og 62 ± 7% i nærvær af MCT blokkere phloretin og parachloromercurybenzoate (pCMBS; søjlediagram i figur S3.). Transformation af lactat til pyruvat af LDH vil nedsætte hastigheden af ​​lactat akkumulering, men fordi pyruvatforbindelser koncentrationer er en størrelsesorden lavere end lactat, bør denne virkning være lille. Vi forventer ikke laktat buffering af LDH eller af selve sensoren at være en væsentlig faktor, fordi intracellulær laktat, typisk i intervallet hundredvis af mikromolære at millimolære, er mere rigelig end enten [32], [33].

Måling af lactat Produktion og Forbrug

flux diagram i fig. 4A viser, hvordan den intracellulære koncentration af lactat påvirkes af glycolytisk produktion, mitokondriel forbrug og eksport /import gennem MCT. Hastigheden af ​​glykolyse ved dens indgang er anslået med en FRET glukosesensor ved at blokere glucosetransporter GLUT under overvågning af hastighed, hvormed hexokinase udtømmer den intracellulære pool af glucose [34], en teknik, der har tjent til at detektere hurtige ændringer i astrocytisk glycolysen reaktion på neuronale signaler [11], [35], [36]. Efter et lignende princip, blev laktat udveksling undersøgt i HEK293 celler ved at forstyrre den steady state med en MCT blokker under måling cytosolisk laktat med Laconic. I nærvær af glucose som eksklusiv brændstof, phloretin forårsagede en ophobning af intracellulær lactat, indikerer netto lactatproduktion, men hvis glucose blev erstattet af lactat, var resultatet lactat depletion (Fig. 4B), der indikerer netto lactat import. I HEK celler phloretin hæmmede kun 57 ± 5% af MCT-aktivitet (fig. S3), og undervurderer derfor de reelle satser i produktionen eller forbruget med ca. 40%. pCMBS var en mere effektiv MCT blocker end phloretin i HEK-celler, med 96 ± 1% inhibition (fig. S3), hvilket giver en mere præcis vurdering af lactat-produktion (fig. 4C). I astrocytter, hastigheden af ​​laktat produktion beregnet med kalibrering beskrevet i fig. 3C var 2 ± 0,5 um /s (n = 22 celler i tre forsøg), der falder i den rigtige størrelsesorden betragtning af, at under identiske kultur og eksperimentelle betingelser astrocytter forbruges glukose på 2 um /s [34], og at nogle glukose er oxideret til CO

2. Akut inhibering af oxidativ phosphorylering (OXPHOS) med azid stimuleret lactat produktion af flere fold (Fig. 4D), der passer den observerede stimulering af glucose forbrug [34]. Kontrol pH-målinger med BCECF viste at azid forårsagede en lille forsuring, der i astrocytter nåede 0,1 pH-enheder i perioden, hvor laktat ophobning blev bestemt (fig. S4). Ved 2 min af azid eksponering, havde de tre celletyper stabiliseret ved et pH omkring 0,2 pH-enheder lavere end kontrolværdier. Virkningerne af phloretin og pCMBS på intracellulær pH ​​var mindre. I betragtning af den beskedne følsomhed af lactat-sensor til en lille forsuring (fig. 2C), er pH ikke synes at være en væsentlig faktor i de differentielle virkninger af inhibitorerne til lactat sensing i astrocytter, HEK293 og T98G-celler.

(A) Diagram af laktat stofskifte. Den cytosoliske koncentration af lactat afhænger af balancen mellem glycolytiske produktion, mitokondriel forbrug af pyruvat og lactat, og udvekslingen med det ekstracellulære lactat poolen via MCT’er. (B) Intracellulær lactat blev overvåget i individuelle HEK293-celler under transiente eksponering til phloretin (50 uM), i nærvær af 25 mM glucose (øverste felt) eller 1 mM lactat (nederste panel). (C) Svarene fra intracellulær lactat til forbigående hæmninger af MCT med phloretin (50 uM) eller pCMBS (500 uM) blev sekventielt målt på samme HEK293 celle i nærvær af 25 mM glucose. De lige linjer repræsenterer skråninger af laktat ophobning monteret ved lineær regression i det første minut af eksponering. Søjlediagrammet opsummerer data fra tre forsøg. (D) Virkningen af ​​5 mM natriumazid blev målt i en astrocyt under eksponering til 50 uM phloretin.

Single-celle Real-Time påvisning af kræft Metabolisme

Kræftceller har defekte mitokondrier og stærk glycolyse, et fænomen kendt som Warburg effekten, som også er til stede i cellelinier [15]. I overensstemmelse med en mindre rolle for mitokondrier i ATP-produktion i cancerceller, real-time glucose måling med FRET glukosesensoren [37] viste, at glykolyse i T98G gliomceller er meget mindre reagerer på OXPHOS inhibering end glycolyse i astrocytter (Fig. S5) . Således kan en robust glykolytisk reaktion på azid tolkes som et tegn på, at mitokondrier har en væsentlig rolle i cellulær ATP-produktion. Reversibiliteten af ​​virkningerne af azid og phloretin tilladt sekventielle applikationer af azid, phloretin og pCMBS til den samme celle. Resultaterne viser astrocytter og gliomceller frembyder modstående mønstre, med astrocytter reagerer stærkt til azid men svagt til phloretin /pCMBS og T98G-celler reagerer svagt til azid og stærkere på phloretin /pCMBS (fig. 5A-D). En analyse af frekvensen af ​​erhvervelsen kræves til nøjagtig vurdering af reaktionen på azid er beskrevet i fig. S6. Kontrolforsøg viste, at som observeret i HEK-celler, i T98G gliomceller pCMBS er en bedre inhibitor af MCT end phloretin (95 ± 5% og 53 ± 3% inhibering, fig. Fig S3). Et forhold mellem basal lactat produktion og reaktionen på OXPHOS inhibering måles på samme række fluorescensforhold og i den samme celle skal være ufølsom over for lactat koncentration og derfor mindre påvirket af mulige forskelle i hvilende lactat koncentration eller sensor adfærd mellem celletyper. Et sådant forhold, som vi har kaldt Warburg Index, var meget følsomme over for den metaboliske forskel mellem astrocytter og gliomceller. Beregnet med phloretin, der undervurderer lactatproduktion mere i glioma-celler og HEK-celler end i astrocytter (fig. S3), den Warburg Index var 0,07 ± 0,01 i astrocytter, 0,74 ± 0,15 i HEK-celler og 1,7 ± 0,2 i gliomceller. Beregnet med pCMBS, den Warburg indeks var 0,07 ± 0,01 i astrocytter, 0,94 ± 0,08 i HEK celler og 4,1 ± 0,6 i gliom celler (Fig. 5E). Mere specifikke MCT-hæmmere bliver introduceret i forskning og i kliniske forsøg, der kan bruges i mikromolære koncentrationer eller lavere. AR-C155858, en specifik inhibitor af MCT1 og MCT2 [38], viste sig at inhibere optagelsen af ​​5 mM lactat i astrocytter med 87% (fig. S7). Brug AR-C155858 den Warburg Index anslået i astrocytter var 0,07 ± 0,006 (fig. S7). Kontrol viste, at phloretin, azid og AR-C155858 var uden effekt på laktat sensing

in vitro

(fig. S8). pCMBS forventes ikke at interagere med sensoren som den ikke træder pattedyrceller.

(A) En astrocyt udtrykker Laconic blev successivt udsat for 5 mM azid, 50 uM phloretin og 500 uM pCMBS. De lige linjer repræsenterer indledende skråninger af laktat ophobning monteret ved lineær regression inden for samme område af forholdet værdier. (B) A T98G gliom celle, der udtrykker Laconic blev successivt udsat for 5 mM azid, 50 uM phloretin og 500 uM pCMBS. De lige linjer repræsenterer indledende skråninger af laktat ophobning monteret ved lineær regression inden for samme område af forholdet værdier. (C) Oversigt over de indledende skråninger (Δ-forhold /min) opnået i tre eksperimenter af typen vist i A og B. (D) Sammenhæng plot mellem satserne for laktat ophobning (Δ-forhold /min) i azid og i pCMBS. Symboler udgør enkeltstående astrocytter (hvid), HEK293 celler (grå) eller T98G celler (sort). (E) The Warburg Index blev estimeret som forholdet mellem hastighederne for lactat produktion med pCMBS og lactat akkumulering med azid og anvendt til at farve silhuet af hver celle ifølge 16-farve opslagstabel. Det indsatte viser en isoleret celle, der var placeret ca. 100 pm fra bundtet. Søjlediagrammet opsummerer data fra 3 eksperimenter i hver celletype. Scale barer er 20 pm. *, P 0.05 mellem hver celletype.

Diskussion

Vi har brugt den bakterielle transkriptionelle regulator LldR som anerkendelse element til at generere Laconic, en genetisk kodet biosensor, der registrerer laktat i fysiologiske område. Udtrykkes i pattedyrceller, sensoren var i stand til sensitiv vurdering af lactattransporter aktivitet og laktat produktion og blev anvendt til at generere et hidtil ukendt encellede parameter i Warburg retning metaboliske varemærke af cancerceller. Udviklingen af ​​en sensor baseret på LldR tilvejebringer grundlaget for at skabe en bred vifte af nye indikatorer fordi GntR superfamilien, hvoraf LldR er medlem, omfatter mindst 270 andre transkriptionsfaktorer, som binder pyruvat, fedtsyrer, aminosyrer, TCA-cyklus mellemprodukter, etc. [19], [39], som er mulige anerkendelse elementer for genetisk kodede nanosensorer.

sensoren var i stand til at kvantificere laktatniveauer i området mellem 1 pM og 10 mM. Den udvidede sortiment af afsløring var uventet som tidligere udviklede metabolit sensorer spænder kun to størrelsesordener [40] – [43]. Affinitet er hovedsagelig bestemt af egenskaberne af elementet anerkendelse og ikke af de fluorescerende partnere, så den karakteristiske kinetiske opførsel af denne LldR-baserede sensor og dens følsomhed over mM niveauer af pyruvat kan være af interesse for forskere, der arbejder på transkriptionel regulering. Lakoniske tilbyder fordele i forhold alternative metoder, den første er beslutningen. Enzymatiske assays og HPLC kræve et stort antal celler, rendering meningsfyldte data, hvis der er metabolisk homogenitet. Rigtige væv og endda primære vævskulturer er komplekse blandinger af celler, der vokser og differentierer bedst i nærvær af hinanden, en populær eksempel er co-kulturer af neuroner og astrocytter. Som med andre genetisk kodede nanosensorer kan Laconic udtrykkes

in vivo

i identificerede celletyper hjælp transgenese eller viral transduktion og kan målrettes til subcellulære organeller. Et andet plus af optiske målinger er, at de ikke kræver destruktion af prøven, således at udformningen af ​​statistisk kraftfulde før-og-efter typen eksperimenter. Ud over at blive transporteret af MCT’er, hvis aktivitet kan estimeres ved anvendelse af et pH-følsomt farvestof, er lactat også transporteres uafhængigt af protoner gennem gap junctions [44] og eventuelt gennem connexin hemichannels og pannexin kanaler, flusmidler som er usynlige for pH-målinger og at kan nu gribes an.

Selv om lignende form af kalibreringskurverne opnåede

in vitro

i HEK celler opmuntrende, den nødvendige hårdhed af den fulde kalibreringsprotokol er en anledning til bekymring, og det er ikke på nuværende tidspunkt muligt at sikre, at de kinetiske parametre opnået

in vitro

repræsenterer opførslen af ​​sensoren i celler. Dataene kan derfor betragtes som semi-kvantitativ og udtrykt i Δ-forhold ved hjælp af nul-laktat punkt som en reference, ideelt set i før-og-efter eksperimenter med satser sammenlignet med lignende forholdet værdier. En anden begrænsning ved Laconic er dens pH-følsomhed i det alkaliske område. Under fysiologiske betingelser den cytosoliske pH fleste celler svinger mellem 7,0 og 7,4, rækkevidde, hvor sensoren viste lille ændring, men i betragtning af den bredt område af koncentrationer, der er omfattet, selv en relativt lille ændring i pH kan indføre en fejl i lactat bestemmelse. Hvis en stærk pH-ændring er til stede, kan en korrektion opnås med rød pH-følsomme proteiner eller farvestoffer, co-loaded i de samme celler eller med parallelle BCECF eksperimenter. Et stående spørgsmål i cellens stofskifte er, i hvilket omfang mitokondrier metabolisere laktat i stedet for pyruvat [45] – [47], et fænomen, der kan behandles med laktat sensor udtrykt i cytosolen. Lactat målinger i den mitokondriske matrix kan vise sig mere vanskelig på grund af den reducerede følsomhed Laconic til pH 7,8-8,0 miljøet af dette rum og mulig indblanding fra citrat. Disse begrænsninger kan måske overvindes ved mutagenese, som vist for pH følsomheden af ​​NADH sensor Peredox [28].

Den protokol til at vurdere laktat produktion /forbrug bør ideelt bruge en reversibel inhibitor stand til at blokere laktat permeabilitet uden at påvirke andre membranproteiner eller intracellulære processer. Hverken pCMBS eller phloretin opfylde en sådan beskrivelse, men de supplerer hinanden. pCMBS ikke kommer ind i cellen, men er rettet mod mange overfladeproteiner og dens virkning er irreversibel, er til hinder design af før-og efter forsøgene. Vi ved ikke, hvorfor astrocytter var mere modstandsdygtige over for pCMBS. Differentiel følsomhed MCT isoformer er muligt, men vi kunne ikke finde beviser på, at der i litteraturen. forventes den partielle inhibering med pCMBS at undervurdere lactat produktion i astrocytter med omkring 35%, med en tilsvarende forspænding indført i Warburg indekset. Virkningen af ​​phloretin er reversibel, men mindre effektiv og er ikke specifik enten. P-værdier