PLoS ONE: Tyktarmskræft og Human Gut microbiome: reproducerbarhed med Whole-Genome Shotgun sekventering

Abstrakte

mere tyder, at tarmen mikrobiota påvirker kolorektal cancer udvikling, men tidligere undersøgelser har varieret i befolkningen, tekniske metoder og foreninger med kræft. Forståelsen af ​​disse variationer er nødvendig for sammenligninger og for potentielle sammenlægning på tværs af studierne. Derfor udførte vi hel-genom haglgevær sekventering på fækale prøver fra 52 pre-behandling kolorektal kræfttilfælde og 52 matchede kontroller fra Washington, DC. Vi sammenlignede resultaterne fra en tidligere publiceret 16S rRNA undersøgelse til metagenomics-afledte taksonomi inden for samme population. Desuden metagenom-forudsagt gener, moduler og veje i Washington, DC og kontrolpersoner blev sammenlignet med sager og kontroller rekrutteret i Frankrig, hvis prøver blev behandlet ved hjælp af den samme platform. Foreninger mellem tilstedeværelsen af ​​fækal Fusobacteria,

Fusobacterium

, og

Porphyromonas

med kolorektal cancer opdaget af 16S rRNA blev gengivet af metagenomics, mens højere relativ overflod af clostridier i kræfttilfælde baseret på 16S rRNA var blot borderline baseret på metagenomics. Dette viste, at inden for den samme prøve sæt, var de fleste, men ikke alle taksonomiske foreninger set med begge metoder. I betragtning af betydelige kræft foreninger med den relative forekomst af gener, moduler og veje i en nyligt offentliggjort franske metagenomics datasæt, statistisk signifikante sammenhænge i Washington, blev påvist DC befolkning for fire ud af 10 gener, tre ud af ni moduler, og syv ud af 17 pathways. I alt blev der kolorektal cancer status i Washington, DC undersøgelse i forbindelse med 39% af metagenom-forudsagt gener, moduler, og veje er identificeret i den franske undersøgelse. Mere inden for og mellem befolkningsgrupper sammenligninger er nødvendige for at identificere kilder til variation og sygdom foreninger, der kan gengives på trods af disse variationer. Fremtidige undersøgelser bør have større stikprøvestørrelser eller pool data på tværs af undersøgelser for at have tilstrækkelig effekt til at opdage foreninger, der er reproducerbare og signifikant efter korrektion for multiple test

Henvisning:. Vogtmann E, Hua X, Zeller G, Sunagawa S, Voigt AY, Hercog R, et al. (2016) Tyktarmskræft og Human Gut microbiome: reproducerbarhed med Whole-Genome Shotgun sekventering. PLoS ONE 11 (5): e0155362. doi: 10,1371 /journal.pone.0155362

Redaktør: John Parkinson, Hospital for Sick Children, CANADA

Modtaget: November 17, 2015; Accepteret: April 27, 2016; Udgivet: 12 maj, 2016

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Det haglgevær metagenomisk sekventering data er tilgængelige på databasen europæiske Nucleotide Archive med tiltrædelsen nummer PRJEB12449 (https://www.ebi.ac .uk /ena /data /view /PRJEB12449). På grund af restriktioner privatlivets fred, kan det komplette metadata stilles til rådighed for kvalificerede forskere ved at kontakte Dr. Rashmi Sinha ([email protected])

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af Intramural Research Program af National Cancer Institut. GZ, SS, AYV, RH, og PB modtog finansiering gennem CancerBiome projektet (European Research Council projekt henvisning 268.985)

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser: BMI, Body mass index; CRC, Kolorektal cancer; DC, Columbia; HMP, Human microbiome Project; Motu, metagenomisk operationelt taksonomiske enhed; OTU, Operationel taksonomiske enhed; WGSS, Whole-genom haglgevær sekventering

Introduktion

Den menneskelige microbiome er genstand for en voksende forskningsområde, da det sandsynligvis er relateret til menneskers sundhed og sygdom. Der er akkumulerende beviser for, at microbiome spiller en rolle i kolorektal cancer (CRC) udvikling eller progression, eventuelt gennem inflammatoriske veje eller kræftfremkaldende mikrobielle metabolitter [1], og mikrobielle foreninger med CRC er blevet foreslået i en række undersøgelser [2-9] . For eksempel med næste generation sekventering af den universelle bakterielle 16S rRNA-genet i DNA ekstraheret fra afføring, har vores gruppe vist, at sammenlignet med matchede kontroller, CRC tilfælde har lavere samfund mangfoldighed, beskedent lavere relativ overflod af Clostridia og højere forekomst af

Fusobacterium

Porphyromonas

[2]. Af den tidligere microbiome og CRC undersøgelser, hvoraf nogle anvendes 16S rRNA-genet sekventering [2, 4, 5, 7, 9], mens andre anvendes hel-genom shotgun sekventering /shotgun metagenomics (WGSS; [3, 6, 8]). WGSS giver ikke kun profiler af bakteriel sammensætning og mangfoldighed, men også vurderer den funktionelle potentiale microbiome [10].

Vi udførte shotgun metagenomisk sekventering af fækale prøver fra en CRC case-kontrol undersøgelse foretaget i 1980’erne i Washington, DC, som tidligere blev analyseret ved 16S rRNA-genet sekventering [2]. Ved at underkaste de samme prøver til en anden sekventering metode, var vi i stand til at sammenligne de tidligere observerede 16S rRNA foreninger med data fra haglgevær metagenomisk sekventering. Hertil kommer, ved hjælp af denne teknologi, var vi i stand til at undersøge potentielle mikrobielle gen-niveau foreninger med CRC, som ikke var muligt i 16S rRNA-genet sekventering data, og vi sammenlignet gen-niveau foreninger med dem, påvist i en tidligere fransk case-kontrol undersøgelse, der anvendte samme metagenomics DNA-ekstraktion og sekventering platform og bioinformatik rørledning [8].

Materialer og metoder

Primær studiepopulation

de fækale prøver blev opsamlet i en CRC case-control forsøg, der tidligere er blevet beskrevet detaljeret [11] og beskrivelsen af ​​analysen af ​​det respektive 16S rRNA-genet sekventering undersøgelse er tidligere blevet offentliggjort [2]. Kort fortalt blev CRC tilfælde og frekvens matchede kontroller, der ventede operation for ikke-onkologiske og ikke-gastrointestinale tilstande rekrutteret 1985-1987 i Washington DC, USA. Før operation eller anden behandling, deltagerne samlet alle afføring i løbet af en periode på to dag og gemt dem på tøris. På laboratoriet prøverne blev frysetørret, samlet og opbevaret kontinuerligt derefter ved -40 ° C. For den nuværende haglgevær metagenomisk undersøgelse valgte vi prøver fra 52 tilfælde og 52 kontroller (befolkning WGSS DC). De sager og kontroller blev matchet på køn og body mass index (BMI; 20 kg /m

2 eller ≥ 20 kg /m

2). Foreninger i WGSS DC-analyse blev sammenlignet med dem, der i den foregående 16S rRNA-genet sekventering undersøgelse (population 16S DC), som omfattede 47 CRC tilfælde og 94 kontrolpersoner fra samme forælder studiet. Alle 47 CRC sager fra 16S DC blev inkluderet i WGSS DC og 52 kontroller i WGSS DC blev inkluderet i de 94 kontroller fra 16S DC. Deltagerne forudsat skriftligt informeret samtykke, og denne undersøgelse blev godkendt af Kontoret for personmotiver Forskning på National Institutes of Health.

Uafhængig validering befolkning

Vi inkluderede data fra et tidligere offentliggjort undersøgelse (befolkning F ) som en uafhængig validering sæt [8]. Kort fortalt blev CRC tilfælde og tilfældigt udvalgte kontroller rekrutteret 2004-2006 i Paris, Frankrig. Før koloskopi, blev en frisk afføringsprøve indsamlet og nedfrosset ved -20 ° C inden for fire timer efter opsamling. Befolkning F inkluderet 53 CRC tilfælde, 15 store adenom sager, 27 små adenom sager, og 61 normale kontroller. Da kontrollerne fra Washington DC kan også have inkluderet udiagnosticeret små adenomer, sammenligningen case-kontrol sæt fra befolkningen F inkluderet 53 CRC tilfælde og 88 kontroller (dvs. 27 små adenomer og 61 normale kontroller) og udelukkede data fra de 15 store adenomer .

Vi inkluderede også offentligt tilgængelige shotgun metagenomisk data fra 292 MetaHIT deltagere [12, 13] og 94 Menneskelig microbiome Project (HMP) fase i deltagere [14] til sammenligning af den samlede mangfoldighed, rigdom, og ensartethed med vores prøver.

DNA-ekstraktion og hel-genom haglgevær sekventering

de frysetørrede fækale prøver fra WGSS DC blev optøet, resuspenderes i phosphatpufret saltvand, og en portion blev sendt til Genomics Core Facility, Europæiske Molekylærbiologiske Laboratorium i Heidelberg, Tyskland på tøris. Metoderne til dna-ekstraktion, bibliotek forberedelse, og hel-genom haglgevær sekventering er blevet beskrevet i detaljer [8] og var den samme for befolkningen WGSS DC og befolkning F. Kort fortalt DNA blev ekstraheret fra fækale prøver bruger GNOME DNA Isolation Kit (MP Biomedicals) med mindre modifikationer. Whole-genomet haglgevær sekventering af det ekstraherede DNA blev udført under anvendelse af Illumina HiSeq 2000/2500 (Illumina, San Diego, USA). Prøverne blev sekventeret med en 100-bp læse længde for parret endesekvenser på Genomics Core Facility, Europæiske Molekylærbiologiske Laboratorium, Heidelberg, Tyskland med en målrettet sekventering dybde på 5 GBP.

Bioinformatik

den generelle strategi for bioinformatisk behandling af hel-genom sekventering data er tidligere blevet beskrevet detaljeret [8] og var den samme for både WGSS DC og befolkning F. taxonomiske overflod profiler sammenfattet i NCBI taksonomiske rækker spænder fra art til phylum og metagenomisk operationelle taksonomiske enheder (Motu) [15, 16] blev oprettet ved hjælp af MOCAT [17]. MOCAT blev også anvendt til funktionelt annotere gener ekstraheret fra metagenomisk samlinger til Kegg databasen (version 62) [18]. Økologiske indeks (Shannon mangfoldighed, artsrigdom, og fællesskab jævnhed) blev beregnet på grundlag af Motu relative mængder og nedsamples til 2000 indsatse ved hjælp af den veganske R softwarepakke [19]. En deltager fra befolkningen WGSS DC og fire deltagere fra befolkningen F blev udelukket på grund af lavere read dækning.

Statistisk analyse

Vi sammenlignede Shannon mangfoldighed, rigdom, og jævnhed for befolkningen WGSS DC, befolkning F , MetaHIT, og HMP fase i prøver og testede case-kontrol forskelle i befolkningen WGSS DC og befolkning F ved hjælp af Kruskal Wallis test. Så for både den primære undersøgelse befolkning (populationen WGSS DC: 52 sager vs 52 kontroller) og den uafhængige validering befolkning (befolkning F: 53 sager vs 88 kontroller), vi testet for sammenhængen mellem case /kontrol status og både den relative forekomst og tilstedeværelse /fravær af de forskellige taksonomiske niveauer og gen kategorier (dvs. gener, moduler og veje). En logistisk regressionsmodel med justering for alder, køn og body mass index (BMI) blev anvendt, og de p-værdierne blev beregnet baseret på Wald test (S1 tabel). Tre CRC sager fra befolkningen WGSS DC manglede BMI data, så vi medtaget disse værdier ved hjælp af sex-specifikke hjælp af CRC sager. For sammenlignelighed med 16S DC undersøgelse har vi også beregnet ukorrigeret logistisk regressionsmodel for et tosidet Wald chi-squared test og en tosidet ikke-parametrisk Wilcoxon test for tilstedeværelse /fravær og relative forekomst af specifik taksa hhv. Vi genererede QQ afbildninger af-loggen (observeret p værdi) versus-log (p-værdier under en normal fordeling) inden WGSS DC og befolkning F for alle taksonomiske niveauer og gen-kategorier for at konstatere potentielt statistisk signifikante associationer efter korrektion for multiple sammenligninger. For gen kategori data i befolkningen F, brugte vi Bonferroni korrektion af p-værdi for at bestemme statistisk signifikans (dvs. p 0,05 /antal test) og betragtes som en p-værdi 0.05 til at være statistisk signifikant for reproducerbarhed analyser i WGSS DC. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af R (version 3.0.0).

Resultater

Karakteristik af de 52 CRC tilfælde og 52 kontroller fra befolkningen WGSS DC er vist i tabel 1. De var godt matchede efter køn og BMI. Men CRC tilfælde havde en højere andel af ikke-spansktalende sorte (23,1% i tilfælde og 5,8% i kontroller), lavere uddannelsesniveau (15,4% af tilfældene, og 3,8% af kontrollerne havde mindre end en high school uddannelse), og mere strøm rygere (13,5% af tilfældene og 3,8% af kontrol). Inden for CRC tilfælde, 28,8% af tilfældene havde kræft i højre colon og 34,6% havde kræft i venstre colon. De fleste af CRC’er var invasiv med ingen kendte metastaser (40,4%), men 34,6% var metastatisk.

tyktarms kræft foreninger i WGSS DC versus 16S DC

I de foregående 16S rRNA-genet sekventering analyse i denne population (16S DC), blev tilstedeværelsen af ​​fire taxa og den relative forekomst af 3 taxa signifikant associeret med CRC sagen status med falsk opdagelse sats justeret p-værdier mindre end 0,05. Som det ses i tabel 2, vi gengivet en signifikant sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ​​Fusobacteria phyla og CRC tilfælde status (p = 0,003), specifikt, at 76,9% af tilfældene og 48,1% af kontrollerne havde detekterbar Fusobacteria. Dette gengiver sammenslutning af Fusobacteria med sagen status i 16S DC-analyse; selvom påvisning var lavere (36,2% af tilfældene, og 16,0% af kontrol, tabel 2). Sammenlignet med 16S DC, den WGSS havde også højere fremherskende påvisning sats for andre systematiske enheder, og det gengivet en signifikant sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ​​

Fusobacterium

(p = 0,006) og

Porphyromonas

(p = 0,032) med CRC sagen status. Sammenhængen mellem

Atopobium

og CRC fra 16S DC ikke blev gengivet i WGSS (tabel 2). Som det ses af tabel 3, havde vi ikke reproducere associationer mellem den relative forekomst af specifikke taxa og CRC sagen status, selv om sammenhængen mellem den relative forekomst af clostridier tendens til at være lavere i tilfælde (p = 0,092). Især relative forekomst af Clostridia anslået i WGSS var to gange lavere for både og kontrolpersoner sammenlignet med den i 16S DC undersøgelsen. I befolkningen WGSS DC, klassen med en højeste relative overflod var Bacteroidia, som havde en relativ overflod af 53,2% i tilfælde og 50,9% i kontroller (S1 tabel).