PLoS ONE: Mitose Phase Berigelse med Identifikation af Mitotisk Centromer-associeret kinesin Som et terapeutisk target i kastrationsresistent Prostata Cancer

Abstrakt

Den nyligt beskrevet transkriptom skifte til en mitose program i kastrationsresistent prostatacancer ( CRPC) antyder, at mitotiske proteiner kan rationelt målrettet denne dødelige stadium af sygdommen. I denne undersøgelse viste vi opregulering af mitose-fasen på proteinniveauet i vores kohorte af 51 kliniske CRPC tilfælde og fundet centrosomal aberrationer til også forekomme fortrinsvis i CRPC sammenlignet med ubehandlet, høj Gleason-grade hormon-sensitiv prostatacancer (

P

0,0001). Ekspression profilering af kemoterapi-resistent CRPC prøver (n = 25) blev udført, og resultaterne blev sammenlignet med data fra primær kemoterapi-naive CRPC (n = 10) og hormon-sensitive prostatacancer tilfælde (n = 108). Vores resultater viste berigelse af mitose-fase gener og pathways, med progression til både kastrationsresistent og kemoterapi-resistent sygdom. Den mitotiske centromer-associerede kinesin (MCAK) blev identificeret som et nyt mål mitose-fasen i prostatacancer, der blev overudtrykt i flere CRPC gen-ekspression datasæt. Vi fandt overensstemmende genekspression af MCAK mellem vores moderselskab og murine CRPC xenograft par og øget MCAK proteinekspression med klinisk progression af prostatakræft til en kastrationsresistent sygdom scenen. Knockdown af MCAK anholdt væksten af ​​prostata kræftceller tyder dens anvendelighed som et potentielt terapeutisk target

Henvisning:. Sircar K, Huang H, Hu L, Liu Y, Dhillon J, Cogdell D, et al. (2012) Mitose Fase Berigelse med Identifikation af Mitotisk Centromer-associeret kinesin Som et terapeutisk target i kastrationsresistent prostatakræft. PLoS ONE 7 (2): e31259. doi: 10,1371 /journal.pone.0031259

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: 10. juli 2011; Accepteret: 4 januar 2012; Publiceret: 17 feb 2012

Copyright: © 2012 Sircar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette papir understøttes af institutionelle midler fra MD Anderson Cancer center (KS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den anden hyppigste årsag til. kræft dødelighed i USA [1], med de fleste dødsfald sker efter svigt af androgen-deprivation terapi, når tumoren vokser som kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), dræbe patienten inden for en median periode på 18 måneder. Docetaxel kemoterapi er blevet etableret som standard for pleje i CRPC, med en lille, men konkret overlevelse fordel [2], [3]. Identificering mål for denne terminal kastrationsresistent og kemoterapi-resistent fase af sygdom udgør således et udækket behov i prostatakræft [4], [5].

En vigtig seneste fremskridt på dette område var demonstrationen, at androgen receptoren aktiverer en distinkt mitose-fasen transkriptionel program i CRPC men ikke i hormon-sensitive prostatacancer (HSPC) [6], delvist forklare den relative succes af docetaxel, et anti-mitotisk kemoterapeutisk middel anvendes til behandling af CRPC. Disse resultater antyder også, at andre mitose-fase proteiner kan være potentielle mål for terapier, der behandler dette stadium af sygdommen.

Vi søgte først validere opregulering af mitose-fasen transkriptionel program på proteinniveauet i CRPC hjælp klinisk CRPC og høj kvalitet HSPC sager. Vi næste sammenlignede transkriptom profiler af lokaliserede CRPC prøver, der var kemoterapi-resistent med CRPC kemoterapi-naive tumorer og hormon-følsomme prostatakræft. Pathway analyse af data fra vores interne prøver og offentligt tilgængelige databaser identificerede berigelse af mitose-relaterede gener som sygdommen skred frem til både en kastrationsresistent og kemoterapi-resistent stadie. Den mitotiske centromer-associerede kinesin (MCAK), hvis genekspression blev opreguleret i flere CRPC kemoterapi-resistent datasæt, blev udvalgt til klinisk og funktionel validering. MCAK proteinekspression var forbundet med klinisk progression af prostatakræft, og dens knockdown anholdt væksten af ​​prostata kræftceller.

Resultater

CRPC tumorer viser augmented mitose-fase protein-ekspression og centrosomal afvigelser i forhold til høj kvalitet HSPC

for at validere den formodede transkriptom skifte til en mitose-fase program i CRPC på proteinniveauet, vi brugte nukleare phosphohistone H3 immunfarvning som mitose-fase markør, som histoner phosphoryleres i slutningen af profase og deres phosphoryleringsbegivenheder toppe ved metafase [7]. Vi kvantitativt undersøgte væv-microarray sektioner af HSPC og CRPC med ARIOL billedanalysesystem. Vores væv arrays omfattede 557 kerner og 250.000 kerner fra 75 kliniske tilfælde. Vores resultater viste signifikant opregulering af phosphohistone H3 i kastrationsresistent prostatacarcinom sammenlignet med HSPC (figur 1G-1I og tabel S2). Disse resultater dokumenterer, at mitose-fase proteiner opreguleret i CRPC. Vigtigere, high-grade hormon-følsomme tumorer med Gleason kvaliteter af 4/5 viste også signifikant lavere phosphohistone H3 ekspression end kastrationsresistent tumorer i adenocarcinom eller småcellet carcinom histologier (P 0,0001) (fig 1G-1J og tabel S2) . I betragtning af de meget forskellige transkriptionelle profiler og langt mere aggressiv klinisk adfærd høj Gleason-grade (Gleason kvaliteter 4/5) prostatakræft sammenlignet med lav Gleason-kvalitet (Gleason grad 3) prostatakræft, vores data understreger særpræg CRPC fra alle histologiske undertyper af HSPC

hematoxylin og eosin (H 0,0001) og high-grade HSPC (P = 0,008) (Figur 1D-1F og 1K og tabel S3). Dette fund er i overensstemmelse med den kendte rolle centrosom amplifikation og genetisk ustabilitet i progressionen af ​​andre kræftformer [8], [9], [10], [11].

opregulering af det mitotiske apparat CRPC tumorer med progression til kastration modstand og kemoterapi modstand

Vi macrodissected tumorceller, der var kastrationsresistent og kemoterapi-resistent fra lokaliserede ikke-metastatiske frosne kirurgiske prøver fra 20 unikke patienter og fem xenotransplantater afledt heraf (tabel S1). Transkriptomisk profilering af totalt RNA blev udført på disse tumorprøver og fem benign prostata prøver, der blev anvendt til at normalisere vores udtryk data. Vores vifte rå der forelægges data til GEO (GSE 33.277). Da vore data blev afledt af begge terminale kastrationsresistent og docetaxel kemoterapi tumorer, sammenlignede vi mRNA-ekspression profil af disse prøver med prøver fra tidligere stadier af prostatacancer progression. Konkret har vi sammenlignet vores data til offentlige gen-udtryk data fra ubehandlet HSPC (GSE 21.032, n = 108) og kemoterapi-naive CRPC (GSE 6811, n = 10). Sådanne metaanalyser udfordrer betragtning af de talrige variabler, der kan påvirke intensiteten af ​​hybridiseringssignal. For en mere pålidelig sammenligning, valgte vi specifikt datasæt lokaliserede, ikke-metastatiske HSPC og kemoterapi-naive CRPC prøver, der var blevet normaliseret til data fra puljede godartet prostata prøver eller hvor gen-udtryk data fra godartede prostata prøver, der er tilladt en sådan normalisering blev leveret . Som forventet fandt vi overekspression af mitose-fase gener og veje i forhold til ubehandlede HSPC prøver fra Memorial Sloan Kettering Cancer Center datasæt (GSE 21.032). Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere rapporter [6], men bruge uafhængige datasæt og metoder.

The University of Tokyo datasæt (GSE 6811) er en af ​​meget få, der omfatter CRPC kemoterapi-naive prøver. Betydningen af ​​microarray (SAM) analyse sammenligner den CRPC kemoterapi-naive gruppe med vores CRPC kemoterapi-resistent gruppe identificerede to informative gen sæt, der bestod af 2490 opreguleres og 2121 nedreguleret gener i kemoterapi-resistente gruppe. Pathway analyse af disse to gensæt udført under anvendelse Ingenuity Pathway Analyse viste, at adskillige celle-cyklus regulering veje var signifikant beriget med opreguleret gensæt (figur 2A). Især kemoterapien-resistente gruppe udviste signifikant overekspression af mitose-involverede pathway (figur 2B) i forhold til kemoterapien-naive gruppe (figur S1). Desuden overlapper analyse af disse to gen-sæt, som vurderet af en hypergeometriske fordeling model (Figur 2C) ved hjælp af mitose-fase (M-fase) gener opnået fra MSigDB databasen (https://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb /index.jsp), viste signifikant overlapning med kun de gener, der blev opreguleret i kemoterapien-resistente gruppe (n = 27;

P

= 5,0 × 10

-7). Generne nedreguleret i kemoterapi-resistent gruppe ikke væsentlig grad overlapper M-fase-gener (n = 9;

P

= 0,416). Denne observation blev understøttet af gen set-berigelse analyse (GSEA; https://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp, Version 3.7), som viste, at M-fase gensæt var signifikant beriget med kemoterapi-resistent gruppe på en falsk opdagelse sats (FDR) af 10% (figur 2D). Disse analyser tyder på, at mitose-associerede gener og pathways kan være involveret i formidling kemoterapi modstand.

(A) Cell-cyklus regulering veje er betydeligt opreguleret i den CRPC kemoterapi-resistent (TX) gruppe sammenlignet med den CRPC kemoterapi -naïve gruppe. (B) Ingenuity Pathway Analysis. (IPA) i opreguleret gen sæt viser, at den kanoniske vej af mitotiske roller polo-lignende kinase er signifikant associeret med den CRPC kemoterapi-resistent gruppe (

P

= 0,004).

P Drømmeholdet værdi beregnes ved Fishers eksakte test. De gener, der er opreguleret i den CRPC kemoterapi-resistente gruppe og er involveret i denne vej er farvekodede i rødt. De andre gener, der er inkluderet i denne vej, men som ikke er i opreguleret gen sæt er angivet i hvidt. (Se tekst til identifikation af upreguated gen indstilles i detaljer). (C) betydelig overlapning af opreguleret gensæt i CRPC kemoterapi tumorer med M-fase (n = 27,

P

= 5.00E-7) i forhold til nedreguleret gensæt (n = 9,

P

= 0,416). (D) GSEA viste, at M-Phase betydeligt blev beriget i CRPC kemoterapi-resistent gruppe på FDR. 10%

Mitotisk CENTROMER-associeret kinesin er forbundet med progression til terapi modstand, mens dens lyddæmpning hæmmer prostatakræft cellevækst

Undersøgelse af de specifikt ændrede mitotiske regulatorer i vores transkriptom data førte os til at identificere gener, der koder for mitotiske kinesin familien af ​​motordrevne proteiner som værende opreguleret i CRPC kemoterapi-resistent prøver. Disse mitotiske kinesiner blev også opreguleret i to andre store CRPC kemoterapi-resistent datasæt fra University of Michigan (GDS 1439) og Memorial Sloan Kettering Cancer Center (GSE 21.032). Vi valgte den mitotiske centromer-associerede kinesin (MCAK) som et mål i prostatacancer, fordi det var nyt, og der var markant overekspression af MCAK genet (

P

= 1,55 × 10

-15) i lokaliserede CRPC fra MD Anderson Cancer center datasæt sammenlignet med hormon følsomme sager prostatakræft (n = 108) fra Memorial Sloan Kettering Cancer center datasæt (GSE 21.032). MCAK blev også opreguleret med progression til metastatisk CRPC inden for Memorial Sloan-Kettering Cancer Center kohorte (

P

= 3,73 × 10

-10) (Figur S2). Desuden fandt vi samstemmende udtryk for MCAK i både vores menneskelige forældre CRPC tumorer og murine xenografter afledt af disse tumorer (

r

= 0,428), som vist i figur S3. Vi måles efterfølgende MCAK proteinekspression ved immunhistokemisk analyse af væv microarrays af uafhængige hormon-følsomme (n = 38) og kastrationsresistent (n = 51) tilfælde. Vi fandt MCAK cytoplasmatisk farvning at være signifikant associeret med klinisk progression til kastrationsresistent sygdom (P 0,0001). (Figur 3A-D og tabel S4)

MCAK-immunfarvet sektioner af kastrationsresistent adenocarcinom (A) , kastrationsresistent småcellet carcinom (B), og hormon-sensitiv prostata carcinom (C). D) Markant øget mærkning for mitotiske centromer-protein MCAK med progression til CRPC, angivet med en asterisk.

For at bestemme virkningerne af banker ned MCAK i HSPC og CRPC, vi brugte to forskellige sæt lille interfererende RNA (siRNA) specifikt for MCAK til tavshed udtryk i hormon-følsomme LNCaP og kastrationsresistent kemoterapi-naive C4-2B prostata cancer cellelinjer. Både CRPC og HSPC cellelinier viste rigelige iboende MCAK proteinekspression og begge viste vækstinhibering efter 3 dages MCAK knockdown med den første siRNA (si-MCAK # 1) som bedømt ved en MTT assay (figur 4A-D) (C4-2B : 3 d, P = 5,45 × 10

-7, 4 d, P = 4,85 × 10

-10, 5 d, P = 3,78 × 10

-8, LNCaP: 3 d, P = 1,43 × 10

-3, 4 d, P = 3,86 × 10

-5, 5 d, P = 1,48 × 10

-5). Lignende resultater fra det andet sæt af siRNA (si-MCAK # 2) er vist i figur S4.

A) Western blot bekræfter knockdown af MCAK ved si-MCAK 1 #. Helcellelysater fra LNCaP-celler transficeret med si-kontrol (C) eller si-MCAK # 1 (M) blev opsamlet på forskellige tidspunkter efter transfektion, som angivet. Tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. B) MTT cellevækst assay. LNCaP-celler blev behandlet på samme måde som i A), og efter en 24-h transfektion blev 4.000 celler udsået i hver brønd i en plade med 96 brønde (n = 10 for hver gruppe), og MTT-assayet blev udført i en 24 timer interval. C) Western blot bekræfter knockdown af MCAK med si-MCAK # 1. Helcellelysater fra C4-2B celler transficeret med si-kontrol (C) eller si-MCAK # 1 (M) blev opsamlet på forskellige tidspunkter efter transfektion, som angivet. Tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. D) MTT cellevækst assay. C4-2B celler blev transficeret med si-kontrol og si-MCAK # 1 hhv. Efter en 24-h transfektion blev 4.000 celler udsået i hver brønd i en plade med 96 brønde og inkuberet i forskellige tidsrum som angivet, efterfulgt af MTT-assayet (n = 10 for hver gruppe).

diskussion

i denne undersøgelse har vi udvidet resultaterne af Wang et al [6] ved at validere, på proteinniveauet, den transkriptom skifte til en mitose program i et uafhængigt sæt CRPC kliniske prøver og viser, at forskellene mellem kastration resistente og ubehandlet hormon følsomme prostatakræft bevares, selv når man sammenligner høje Gleason kvalitet prostatakræft. Dette er et vigtigt resultat i betragtning af de forskellige transkriptom programmer ses i prostatakræft med lav og høj Gleason kvaliteter [12], der afspejler deres dramatisk forskellige kliniske adfærd. Vi har også vist centrosomal aberrationer at forekomme fortrinsvis i CRPC, i overensstemmelse med den unormale celledeling set i andre fremskredne kræftformer. Disse resultater understøtter konceptet, at CRPC er biologisk forskellige og ikke blot en forlængelse af høj kvalitet hormon følsomme prostatakræft, på trods af deres histologiske ligheder og tilbøjelighed til klinisk aggressivitet.

Ved at sammenligne transkriptom profiler af CRPC kirurgiske prøver, der var kemoterapi-naive med vores CRPC kemoterapi-resistent data, fandt vi berigelse af mitotiske-fase proteiner og veje i kemoterapi-resistente tumorer. Blandt de mitose-relaterede gener, valgte vi den mitotiske kinesin familie af motordrevne proteiner til yderligere undersøgelse-navnlig MCAK, som ikke tidligere er blevet undersøgt i prostatacancer. Mitotiske kinesiner vides at spille en afgørende rolle i regulering mitosespindelen apparat under celledeling. De er involveret i cellulær proliferation og reguleres af aurora-B kinase [13]. Progression af lunge, hjerne, og kolorektal cancer [14] [15] er blevet forbundet med augmented kinesin ekspression, mens dets inhibering har resulteret i celle-cellecyklusstandsnings i mitosen fase [16], [17]. Mitotisk centromer-associeret kinesin er rigeligt i centrosomer, depolymeriserer mikrotubuli, og medierer overgangen fra prometafasen til metafase [18], blandt andre væsentlige funktioner i forbindelse med ordentlig kromosom adskillelse [19] under celledeling. Overekspression af mitotiske kinesiner, som postuleres at virke ved at modvirke mikrotubulus-stabiliserende virkning af taxan kemoterapi, er blevet forbundet med docetaxel modstand i brystcancer [20], og MCAK overekspression er blevet kausalt relateret til paclitaxel resistens [21].

Målretning mitotiske kinesiner således fremstår som en attraktiv behandling modalitet i kræftsygdomme, som er refraktære over for taxan-baserede kemoterapi, der virker på mitosespindelen, da hæmning af kinesin motoriske proteiner ikke direkte rettet mod mikrotubuli. Desuden er mitotiske kinesiner ikke udtrykkes af neuroner [22] og er dårlige substrater for P-glycoprotein udstrømningspumpen [23], som resulterer i docetaxel er dosisbegrænsende neurotoksicitet og multiresistens. Derfor er mitotisk kinesin hæmning hypotese at fremkalde mitose-specifik celle-cyklus anholdelse, der kan supplere de nuværende kemoterapeutiske protokoller med færre bivirkninger [18].

Forskellige mitotiske kinesiner tjener specifikke funktioner, og den rolle af disse proteiner i prostatacancer er kun blevet undersøgt med hensyn til den mest veletablerede medlem af denne familie, kinesin spindle protein (KIF11 /EG5), hvis nedregulering har vist sig at hæmme væksten af ​​LNCaP og PC3-cellelinjer

in vitro

og

in vivo

[24], [25]. Tidlig-fase kliniske forsøg i CRPC patienter, der bruger den første generation EG5 inhibitor, ispinesib, har haft begrænset succes [26] [27]. Imidlertid er der rapporteret nyere generation EG5 hæmmere til at udvise større effektivitet

in vitro

[28], og en tredje klinisk forsøg er i øjeblikket rekruttere patienter fra en række af maligniteter, herunder kastrationsresistent prostatacancer (# NCT01065025) .

sammenfattende har vi vist berigelse af mitose-fase veje og proteiner som prostatakræft udvikler sig til både en kastrationsresistent og kemoterapi-resistent tilstand. Vi undersøgte rollen som MCAK for første gang i prostatakræft og viste, at MCAK ekspression korrelerer med klinisk progression af denne sygdom. Desuden viste vi væksthæmning i MCAK-lyddæmpet kastrationsresistent prostatacancer cellelinjer. Sammen vore resultater antyder, at MCAK er et funktionelt vigtigt protein i terminal prostatacancer. Opfølgning studier baseret på denne rapport bør indeholde bruge syntetiske inhibitorer mod MCAK (fx patent # 7.294.640, Merck) i prækliniske modeller og i fremtidige kliniske forsøg med prostatakræft.

Materialer og Metoder

Etik erklæring

hormon-følsomme og kastrationsresistent prostatacancer vævsprøver blev opnået med godkendelse fra den fra de institutionelle anmeldelse bestyrelserne for The University of Texas MD Anderson Cancer center (Houston, Texas) og McGill University (Montreal, QC, Canada). De vævsprøver bruges til at udvikle MDA PCa 79, MDA PCa 117-9, MDA PCa 124, MDA PCa 130, MDA PCa 149-1, og MDA PCa 180-30 xenotransplantater blev afledt fra tumor prøver af kirurgiske prøver (cystoprostatectomy, radikal prostatektomi , eller bækken eksenteration) af en progressiv primær kastrationsresistent prostatacancer. Skriftligt informeret samtykke var opnået fra patienter før overtagelsen prøve, og prøver blev behandlet i henhold til en protokol godkendt af MD Anderson institutionelle Review Board, herunder godkendelse fra dyret pleje og brug udvalg. De lab protokol tal, der omfattede brugen af ​​disse prøver er MDACC LAB 03-0336 og LAB 09-0213.

Patient vævsprøver

molekylært profilerede væv blev afledt fra MD Anderson frosne tumorprøver fra patienter med kastration-og kemoterapi-resistent prostatacancer (n = 20) og fra godartet prostata kontroller væv (n = 5). De kastrationsresistent kemoterapi-resistente prøver blev taget fra bjærgning cystoprostatectomies eller bækken exenterations. Murine xenotransplantater afledt fra fem af disse 20 tumorer viser adenocarcinom histologi blev også vurderet. Kliniske data for de genomisk profilerede prøver er medtaget i tabel S1. Fire væv microarrays blev anvendt til at validere genomiske data og bestod af formalin-fikserede paraffin-indlejrede prøver fra 58 patienter med HSPC og 51 patienter med CRPC.

Expression profilering og analyse

Tumor-mRNA-ekspression var vurderes under anvendelse af en human hel-genom oligonukleotid microarray kit fra Agilent (prod # G4112F) ifølge producentens protokol og som beskrevet tidligere [29]. Vores CRPC data blev normaliseret til de gennemsnitlige gen-ekspression værdier fra fem godartede prostata prøver at finde opreguleres eller nedreguleres gener ved hjælp af en log-forhold værdi 0,3 som cut-off til informative gener til stede i mere end to tredjedele af tilfældene. Vi sammenlignede vores udtryk profilering af data til University of Michigan (GDS 1439), University of Tokyo (GSE 6811), og Memorial Sloan Kettering Cancer Center (GSE 21.032) datasæt. For disse datasæt, blev normalisering udført mod deres interne kontroller (godartede prøver).

immunhistokemisk analyse

Standard 3,3′-diaminobenzidin (DAB) immunhistokemisk analyser af væv mikroarrays blev udført med en Dako Autostainer Plus (Dako) ved anvendelse af en muse-anti-humant monoklonalt MCAK antistof (Abgent AT2621a) ved fortynding 1:50, en phospho-histoneH3 antistof (Santa Cruz SC-8656) ved 1:100 fortynding, og en gamma-tubulin-antistof (Abcam AB27074) ved 1:400 fortynding som beskrevet tidligere [30]. Farvning for gamma-tubulin og MCAK blev evalueret manuelt ved at tildele en procent positiv værdi i hvert enkelt tilfælde baseret på den samlede immunhistokemisk mærkning af alle væv kerner der tilhører denne sag.

Automatiseret billedanalyse

phosphohistone H3-positive kerner blev kvantitativt vurderet ved hjælp automatiseret billedanalyse med ARIOL software fra Applied Imaging (Genetix Ltd.). En specialfremstillet, automatiseret nukleare kvantificering algoritme, der anvender den ARIOL software blev udarbejdet på grundlag af farvevariationer af den brune plet i DAB-positive celler versus negative nukleare hæmatoxylin baggrund for at opnå en procent positiv pr forhånd udvalgt område af repræsentation i hvert dias .

Cellekultur

C4-2B celler deponeret ved MD Anderson blev udviklet efter seriel passage af LNCaP-celler i kastrerede værter, når cellerne ikke længere var der reagerer på androgen manipulation hos dyr (PMID: 8.168.083 ). LNCaP-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Begge cellelinier blev dyrket i RPMI1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med en atmosfære af 5% CO

2.

xenografundersøgelser

vævsprøver anvendt til udvikle MDA PCa 79, MDA PCa 117-9, MDA PCA 124, MDA PCA 130, og MDA PCA 149-1 xenografter var resterende væv fra kirurgisk resektion (cystoprostatectomy eller bækken eksenteration) af progressiv primær CRPC. Små tumorstykker blev implanteret i subkutane lommer af 6- til 8-uger gamle mandlige CB17 SCID-mus (Charles River Laboratories). Tumorer udviklet inden for 6 måneder og blev holdt i musene, som cellerne ikke kunne dyrkes

in vitro

. Passagen og tumor forarbejdningsmetoder bruges var de samme som tidligere rapporteret (PMID: 18.618.013).

SiRNA transfektion

LNCaP eller C4-2B celler blev podet i en 6-brønds plade på en densitet på 5 x 10

4 celler /brønd og dyrket i RPMI1640-medium suppleret med 10% FBS under normale væv dyrkningsbetingelser. Efter 20-24 timers inkubation blev siRNA transfektion udført under anvendelse LipofectamineRNAiMax Reagens fra Invitrogen (Invitrogen, cat # 56.532) ved at følge fabrikantens protokol. To sæt af si-MCAK siRNA blev anvendt til forsøgene. si-MCAK # 1 blev erhvervet fra Ambion (Ambion, cat # 4.390.824) og si-MCAK # 2 blev købt hos Dharmacon (Chicago, IL, USA, cat # L-004.955 til 00). Den universelle Negativ kontrol # 1 siRNA fra Sigma (cat # SIC-001) blev anvendt som kontrol. Slutkoncentrationen af ​​siRNA var 50 nM.

Western blot-analyse

MCAK monoklonalt antistof blev opnået fra Abgent (cat # AT2621a) og både β-actin (kat # sc-1616) og β-tubulin (cat # sc-9104) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Western blotting blev udført som beskrevet [31]. Kort fortalt blev celleekstrakter indeholdende 30 ug protein opløst ved 10% SDS-PAGE-elektroforese, overført til Hybond ECL nitrocellulosemembraner (Amersham Pharmacia Biotech) eller polyvinylidenfluorid membraner (Cat # IPVH20200) fra Millipore (Millipore Corporation, kat. # IPVH20200) , blokeret i 5% fedtfri mælk i 1 × Tris-bufret saltvand plus 0,05% Tween-20 (pH 8,0) og probet med primære antistoffer i koncentrationer på 1:1000 for MCAK og 1:2500 for β-actin eller β-tubulin. De sekundære antistoffer blev anvendt ved koncentrationer på 1:10,000. Proteinerne blev visualiseret ved anvendelse af SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Prod # 34.708) eller SuperSignal West Femto maksimal følsomhed Substrat (Prod # 34096) fra Pierce (Pierce Chemical, Rockford, IL, USA).

celleproliferation assays

Cell proliferation blev bestemt ved en MTT absorbans assay. Cellerne transficeret med enten kontrol siRNA (si-kontrol) eller MCAK siRNA (si-MCAK) blev trypsinbehandlet fra skålene ved 24 timer efter transfektion og 4.000 celler i 200 pi komplet medium blev podet i hver brønd på en plade med 96 brønde ( n = 10). Cellerne lodes binde i 24 timer i komplet medium, og MTT-assayet blev udført ved 24 timers intervaller efterfølgende. Efter en 2,5 timers inkubation med 50 pM MTT-reagens under normale celledyrkningsbetingelser blev brøndene tømt af vakuumaspiration, og 200 pi DMSO blev tilsat til hver brønd. Absorbansen blev målt ved 590 nm med en mikropladelæser. (MRX, Danatech Laboratory)

Statistisk analyse

Data er udtrykt som middelværdien +/- s.d. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Students

t

-test og Wilcoxon rank-sum test. Forskelle i midler blev vurderet ved hjælp af en to-tailed

t

-test, forudsat ulige varianser. En P value≤0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Støtte oplysninger

figur S1.

Mitosis veje er ikke forbundet med den nedreguleret gen sat i CRPC kemoterapi-resistent sygdom. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) i nedreguleret gen sæt viser, at den kanoniske vej af mitotiske roller polo-lignende kinase ikke er signifikant associeret med den CRPC kemoterapi-resistent gruppe (

P

= 0,16).

P Drømmeholdet værdi beregnes ved Fishers eksakte test. De gener, der er nedreguleret i CRPC kemoterapi-resistente gruppe og er involveret i denne vej er farvekodede i grønt. De andre gener, der er inkluderet i denne vej, men er ikke medtaget i nedreguleret gen sæt er angivet i hvid

doi:. 10,1371 /journal.pone.0031259.s001

(TIF)

Figur S2.

Øget MCAK transkriptniveauer med progression til CRPC. (A) MCAK viser transkriptom opregulering i lokaliseret CRPC (

P

= 1,55 × 10

-15) og (B) metastatisk CRPC (

P

= 3,73 × 10

– 10) i forhold til HSPC

doi:. 10,1371 /journal.pone.0031259.s002

(TIF)

Figur S3.

Overensstemmelse af MCAK genekspression mellem CRPC mus xenografter (MDA-79, MDA-117, MDA-130, MDA-149) og deres tilsvarende humane forælder tumorer (

r

= 0,428).

doi: 10,1371 /journal.pone.0031259.s003

(TIF)

Figur S4.

Vækst hæmning af LNCaP- og C4-2B celler ved si-MCAK # 2. A) Western blot bekræfter knockdown af MCAK ved si-MCAK # 2. Helcellelysater fra LNCaP-celler transficeret med si-kontrol (C) eller si-MCAK # 2 (M) blev opsamlet på forskellige tidspunkter efter transfektion, som angivet. Actin blev anvendt som indlæsning kontrol. B) MTT cellevækstfaktorer assays. LNCaP-celler blev behandlet på samme måde som i A), og efter en 24 timers transfektion blev 4.000 celler udsået i hver brønd i en plade med 96 brønde (n = 6 for hver gruppe) og efterfulgt af MTT-assayet. C) Western blot bekræfter knockdown af MCAK med si-MCAK # 2. Helcellelysater fra C4-2B celler transficeret med si-kontrol (C) eller si-MCAK # 2 (M) blev opsamlet på forskellige tidspunkter efter transfektion, som angivet. Actin blev anvendt som indlæsning kontrol. * Angiver ikke-specifikke bånd. D) MTT celle vækstassays. C4-2B celler blev transficeret med si-kontrol og si-MCAK # 2. Efter en 24 timer transfektion blev 4.000 celler udsået i hver brønd i en plade med 96 brønde og inkuberet i forskellige tidsrum som angivet, efterfulgt af MTT-assayet (n = 5 for hver gruppe)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0031259.s004

(TIF)

tabel S1.

Forkortelser: CXPX – cystoprostatectomy; PE – bækken eksenteration; TURP – transuretral resektion; TAB – total androgen blokade (Lupron + Casodex); LHRH – Lupron; ORCH – bilateral orchiektomi; XRT – strålebehandling. * Lille celle karcinom komponent blev profileret fra en blandet histologi småcellet /adenocarcinom tumor

doi:. 10,1371 /journal.pone.0031259.s005

(DOC)

tabel S2.