PLoS ONE: Tumor Suppressiv Funktion og Modulation af programmeret celledød 4 (PDCD4) i æggestokkene Cancer

Abstrakt

Baggrund

Programmeret celledød 4 (PDCD4), der oprindeligt identificeret som den neoplastiske transformation inhibitor, var svækket i forskellige cancertyper. Vores tidligere undersøgelse viste en kontinuerlig nedregulering af PDCD4 ekspression i sekvensen af ​​normal-borderline-maligne ovarie vævsprøver og en betydelig korrelation mellem PDCD4 udtryk med sygdomsfri overlevelse. Formålet med den aktuelle undersøgelse var for yderligere at undersøge funktion og modulering af PDCD4 i æggestokkene cancerceller.

vigtigste resultater

Vi viste, at ektopisk PDCD4 udtryk signifikant hæmmede celledeling ved at inducere cellecyklus arrest på G

1 fase og opregulering af cellecyklus hæmmere af p27 og p21. Cell migration og invasion blev også hæmmet af PDCD4. PDCD4 over-udtrykkende celler udviste forhøjet phosphatase og tensin homolog (PTEN) hæmmede proteinkinase B (p-Akt). Derudover blev ekspression af PDCD4 opreguleret og det blev eksporteret til cytoplasmaet ved serum tilbagetrækning behandling, men det blev hurtigt udtømt via proteasomalaktivitet nedbrydning ved serum re-administration. Behandling af en phosphoinositid 3-kinase (PI3K) inhibitor forhindrede nedbrydningen af ​​PDCD4, hvilket indikerer inddragelse af PI3K-Akt pathway i modulering af PDCD4.

Konklusion

PDCD4 kan spille en kritisk funktion arrestere cellecyklusprogression på tasten checkpoint, således inhiberer celleproliferation, samt undertrykke tumormetastase. Den PI3K-Akt pathway blev stiltiende at være involveret i reguleringen af ​​PDCD4 nedbrydning i æggestokkene cancerceller. Som reaktion på stress tilstand, endogene PDCD4 var i stand til at shuttle mellem celle rum til at udføre sine omdirigeret funktioner

Henvisning:. Wei N, Liu SS, Chan KKL, Ngan HYS (2012) Tumor Suppressiv Funktion og Graduering af programmeret celledød 4 (PDCD4) i kræft i æggestokkene. PLoS ONE 7 (1): e30311. doi: 10,1371 /journal.pone.0030311

Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget: 12. maj 2011; Accepteret: December 13, 2011; Udgivet: januar 17, 2012 |

Copyright: © 2012 Wei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en intern bevilling fra University of Hong Kong Seed Finansiering program for grundforskningen [til KKLC], og ved en donation fra Wong Check Hun Charitable Foundation [til HYSN]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

PDCD4 blev oprindeligt identificeret som neoplasmic transformation inhibitoren i JB6 muse epidermal cellelinie model [1]. PDCD4 transgene mus udviste lavere tumorforekomst og papilloma-til-carcinom konvertering frekvens [2]. Senere rapporter har underforstået PDCD4 s hæmmende rolle på protein oversættelse gennem hæmning af eukaryote indledning faktor 4A (eIF4A) helicase, samt forstyrre sammenslutningen af ​​eIF4A med eIF4G, hvilket resulterer i svigt i dannelsen af ​​translationsinitiering kompleks [3], [4 ], [5]. Siden da er der gennemført flere undersøgelser for at undersøge den rolle, PDCD4 under tumorudvikling. PDCD4 viste sig at være stand til at regulere transkription. Over-ekspression af PDCD4 resulterede i undertrykt carcinoid celleproliferation gennem undertrykke transkriptionen af ​​mitose-fremmende faktor cyclin-afhængig kinase (CDK) 1 /cdc2 via opregulering af p21

WAF1 /Cip1 [6], [7]. PDCD4 inhiberede coloncancer celleinvasion gennem undertrykke mitogenaktiveret proteinkinase kinase kinase kinase 1 (MAP4K1), hvilket fører til undertrykte AP-1 afhængig transskription [8]. Rolle PDCD4 i celle apoptose er også blevet undersøgt i forskellige undersøgelser. PDCD4 blev foreslået at være en proapoptotiske molekyle involveret i transformerende vækstfaktor beta-1 (TGF-beta-1) inducerede apoptose i hepatocellulært carcinom (HCC) [9]. Formindsket PDCD4 ekspression dereguleret den normale DNA-skade respons, hvilket forhindrer DNA-beskadigede celler i at undergå apoptose [10].

Trods tumor suppressor egenskaber nævnt ovenfor, rolle PDCD4 i tumorudvikling er blevet foreslået at være celletypespecifik [11]. Over-ekspression af PDCD4 havde ingen virkning på hverken proliferation eller apoptose i HEK293-celler [12], samt i RKO coloncancerceller [8]. Tidligere undersøgelser rapporterede forarmet PDCD4 udtryk i kræft sammenlignet med normale væv [13], [14], [15], og PDCD4 blev målrettet til nedbrydning under tumorpromotion [16], men de mekanismer for modulation af PDCD4 ikke var klart endnu.

undersøgelserne om betydningen af ​​PDCD4 i ovariecancer carcinogenese var temmelig begrænset. Ifølge vores tidligere resultater, blev tabet af PDCD4 udtryk findes i de grænsetilfælde og maligne æggestokkene vævsprøver, og er forbundet med en negativ sygdom resultat [17]. For yderligere at undersøge den rolle, PDCD4 i ovariecancer, i den aktuelle undersøgelse, vi undersøgte de potentielle tumor suppressor funktioner PDCD4 i æggestokkene kræftceller, og det plausible mekanisme, der regulerer PDCD4.

Resultater

PDCD4 hæmmede ovariecancer celledeling og cellecyklus progression

for at undersøge funktionen af ​​PDCD4 i kræft i æggestokkene, to PDCD4 over-udtrykkende stabile kloner 433-PDCD4c1 og 433-PDCD4c2 blev etableret i æggestokkene kræftcelle OVCA433. En PDCD4 over-udtrykkende stabil klon SKOV3-PDCD4, blev etableret i æggestokkene kræftcelle SKOV3 (figur 1A). Etableringen af ​​PDCD4 over-udtrykkende stabile kloner blevet identificeret af den ekstra bånd i forhold til forældrenes celler. pEGFP over-udtrykkende stabile kloner (433-EV og SKOV3-EV) blev også etableret som den tomme vektor kontrol og anvendt i de følgende eksperimenter. Den kvantificering af de vestlige blotting bands blev præsenteret i data S1.

(A) PDCD4 over-udtrykkende stabile kloner 433-PDCD4c1, 433-pdcd4c2, og SKOV3-PDCD4 blev etableret i æggestokkene kræftceller OVCA433 og SKOV3 . 433-EV og SKOV3-EV: GFP over-udtrykkende tomme vektor stabile kloner til kontrol. (B) 433 PDCD4c1 og 433 PDCD4c2 udviste signifikant langsommere proliferationshastighed sammenlignet med kontrol (* p 0,01 og ** p 0,05, henholdsvis) ifølge XTT (venstre felt) og klongenicitetsassayet (p 0,05) (højre panel). (C) PDCD4 inducerede standsning af cellecyklus ved G1 fase. Repræsentative data er fra en af ​​de tre uafhængige forsøg. Procentdelen af ​​celler, der var i G1 scenen for OVCA433 C1 og C2 var 84,6% (± 2,1%) og 80,9% (± 2,2%), hhv. Begge var signifikant højere sammenlignet med kontrol (69,9% ± 3,1%) (p = 0,004 og P = 0,01, henholdsvis). Procentdelen af ​​celler, der var i G1 fase for SKOV3-PDCD4 var 66,7% (± 1,8%), hvilket var signifikant højere sammenlignet med kontrollen (37,5% ± 2%) (p = 0,008). (D) PDCD4 overudtrykkende stabile kloner samt kontrolforanstaltninger tom vektor stabile kloner blev opretholdt i MEM med 10% FBS, og derefter høstet for protein ekstraktion. Protein udtryk for et panel af cellecyklus regulatorer herunder p53, p21, p27, Cdc25A blev cyclinA og cyclin analyseret. Intensiteten af ​​båndet blev bestemt ved densitometrisk scanning. Den kvantificering af båndene blev præsenteret i data S1. GAPDH blev inkluderet som intern belastning kontrol. blev udført tre uafhængige forsøg.

Cell proliferation blev vurderet ved XTT og klongenicitetsassayet. Ifølge XTT resultater, begge de to OVCA433-PDCD4 celler udviste signifikant langsommere proliferationshastighed sammenlignet med kontrollen (p 0,05 for OVCA433-PDCD4c1 og p 0,01 for OVCA433-PDCD4c2 henholdsvis figur 1B, venstre panel). Klongenicitetsassayet tydede også lignende resultater: antallet af dannede kolonier for OVCA433-PDCD4c1 og c2 var 33% og 58% mindre sammenlignet med kontrolgruppen (GFP kun tom vektor kontrol), (p 0,05, figur 1B, højre panel).

at udforske de underliggende mekanismer for de hæmmende virkninger af PDCD4 på kræft i æggestokkene celledeling, vurderede vi effekten af ​​PDCD4 på cellecyklusprogression hjælp flowcytometri analyse. I kontrol OVCA433, procentdelen af ​​celler i G1 fase var 69,9% (± 3,1%). Forholdsvis, de procentdele af celler i G1 fase var 84,6% (± 2,1%) og 80,9% (± 2,2%) for OVCA433-PDCD4c1 og C2 henholdsvis som begge betydeligt højere end kontrol (p = 0,004 og P = 0,01, henholdsvis). Der var et tilsvarende fald i procentdelen af ​​celler i S fase i OVCA433-PDCD4c1 (10,3% ± 2,4%) og c2 (15,7% ± 2%)) sammenlignet med kontrol (25,9% ± 2,1%, figur 1C).

over-ekspressionen af ​​PDCD4 i SKOV3 også påvirket sin cellecyklusprogression. I kontrolgrupperne SKOV3 celler, procentdelen af ​​cellerne i G1 fase var 37,5% (± 2%). Forholdsvis, i SKOV3-PDCD4 celler, procentdelen af ​​celler i G1 etape var 66,7% (± 1,8%), hvilket var betydeligt højere end kontrol (p = 0,008). Der var et tilsvarende fald i procentdelen af ​​celler i S fase i SKOV3-PDCD4 celler (20,9% ± 2,5%) sammenlignet med kontrol (46,2% ± 1,9%).

flowcytometri-analyse viste, at over -expression af PDCD4 induceret cellecyklusstop hovedsageligt på G1 fase; 1.2 (p = 0,01) og 1,8 (p 0,01) fold stigning i procentdelen af ​​cellerne på G1 etape i OVCA433-PDCD4 og SKOV3-PDCD4 ovariecancer celler, (p = 0,01).

for at identificere potentielle molekyler involveret i de ovennævnte hæmmende virkninger af PDCD4 på cellecyklusprogression, vi vurderede udtryk for flere cellecyklus regulatorer herunder p21, p27, p53, cyclinA, cyclin, Cdc25A. I OVCA433-PDCD4c1 og c2, blev p53 udtryk knapt ændret, og p21 blev markant op reguleret, mens der i p53-nul SKOV3-pdcd4 celler blev p21 ikke detekteret. P27-ekspression blev opreguleret i begge OVCA433-PDCD4 og SKOV-PDCD4 celler. Derudover observerede vi en stigning på Cdc25A ekspression i to 433 PDCD4 over-udtrykkende stabile kloner, og en stigning på cyclinA ekspression i 433 PDCD4 c2 men ikke i c1 (figur 1D). Det er dog kun et svagt fald i Cdc25A blev observeret i SKOV-PDCD4 celle, og cyclinA niveau blev forblevet den samme i både stabil klon og vektor kontrol over SKOV3 celler. Den kvantificering af de vestlige blotting bands blev præsenteret i data S1.

PDCD4 hæmmede ovariecancer celle migration og invasion

At udforske de mulige virkninger af PDCD4 på kræft i æggestokkene celle migration, var to forskellige tilgange anvendt. For det første blev sårheling assay anvendes til at overvåge den tid, der kræves til lukning af såret i kontrol og PDCD4 overudtrykker ovariecancerceller. Før assayet blev celler forbehandlet med mitomycin C, et DNA-syntese og kernedeling inhibitor, for at sikre lukningen af ​​såret udelukkende skyldtes cellevandring men ikke celleproliferation. Resultaterne viste, at PDCD4 over-udtrykkende celler udviste langsommere vandringshastighed. Den ridsede sår i begge kontrolceller blev lukket i 23 timer efter indførelsen af ​​såret, mens et hul stadig blev observeret i den PDCD4 over-udtrykkende celler (figur 2A).

(A) Både kontrol og PDCD4 over-udtrykkende celler blev behandlet med mitomycin C (10 ug /ml) i tre timer før indførelsen af ​​såret. Billeder blev taget ved angivne tidspunkter (0, 5, 8 og 23 h). PDCD4 over-udtrykkende stabile kloner udviste langsommere sårheling proces sammenlignet med kontrollen. (B) Æggestokkræftceller fik lov til at migrere gennem den mikroporøse membran i 9 timer i Transwell migration assay. Antallet af celler migreret gennem for PDCD4 over-udtrykkende stabile kloner var signifikant færre sammenlignet med kontrol (* p 0,01 og ** p 0,05, henholdsvis). (C) Æggestokkræftceller fik lov til at invadere gennem ECMatrix i 72 timer i Transwell invasion assay. Antallet af celler invaderet igennem for PDCD4 over-udtrykkende stabile kloner var signifikant færre sammenlignet med kontrol (* p 0,05). Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer.

For at kvantitativt vurdere migration sats celle, transwell migration assay blev anvendt. OVCA433-PDCD4c1 og c2 viste 35% og 63% mindre migration henholdsvis end kontrolceller (p 0,01 Figur 2B). SKOV3-PDCD4 celler viste 22% mindre migration end for kontrol celler (p 0,05, figur 2B)

PDCD4 har også effekt på kræft i æggestokkene celleinvasion demonstreret ved transwell invasion assay.. OVCA433-PDCD4c1 og c2 viste 27% og 30% mindre invasion sammenlignet med kontrol (p 0,05 Figur 2C). SKOV3-PDCD4 viste 19% mindre invasion i forhold til kontrol (p 0,05, figur 2C).

Modulation af PDCD4

PDCD4 blev rapporteret som en oversættelse inhibitor. Som proteintranslation kunne blive stimuleret af serum og inhiberes, når cellerne blev udsultet i fravær af vækstfaktorer, vi derved undersøgt virkningerne af serum på overflod af PDCD4. Både OVCA433 og SKOV3 blev sultet i serumfrit medium i 48 timer før serum blev igen indlagt ved angivne tidsintervaller, herunder 1 time, 2 timer, 6 timer og 24 timer. I begge celler blev PDCD4 forhøjet, når udsultes. Men ved re-administration af serum, PDCD4 faldt, efterhånden på en tidsafhængig måde i SKOV3 og hurtigt forsvandt inden for 1 time i OVCA433 (figur 3A). Den kvantificering af de vestlige blotting bands blev præsenteret i data S2.

(A) OVCA433 og SKOV3 blev berøvet fra serum (SD) i 48 timer, før serum blev re-administreret i 1 time, 2 timer, 6 timer og 24 timer. Der var en dramatisk stigning af PDCD4 proteinekspression ved serum frakendelse behandling. PDCD4 hurtigt forsvandt efter serum blev re-administreret. P-Akt og p-ERK blev nedreguleret, når serum blev trukket tilbage og gradvist genoptaget efter serum blev tilføjet tilbage. Total Akt og ERK blev ikke påvirket under behandlingen. (B) PDCD4 var forhøjet i serum berøvet celler (SD) og forarmet når serum sattes tilbage (SA, serum tilsætning) i 2 og 4 timer. Administrationen af ​​enten proteasominhibitor MG132 (S + MG132), eller PI3K-inhibitor LY294002 (S + LY294002) forhindrede udtømning af PDCD4. DMSO blev også inkluderet som kontrol (S + DMSO). Negativ kontrol (-ve) indiceret til celler dyrket med medium indeholdende serum. (C) Udtrykket af PTEN, p-Akt og p-ERK blev ændret i alle PDCD4 overekspression stabile kloner, mens udtryk for total Akt og ERK forblev uændret. Der blev udført tre uafhængige forsøg. Den kvantificering af de vestlige blotting bands blev præsenteret i data S2.

For at udforske de potentielle veje involveret i modulering af PDCD4 i ovennævnte behandling, de udtryk for PTEN, p-Akt og p-ERK ( ekstracellulært signal-regulerede kinase) blev undersøgt. PTEN var forhøjet efter serummet blev fjernet, og der var ingen yderligere ændring efter fornyet tilsætning af serummet Til op til 24 timer. Der var et signifikant fald af p-Akt når serum blev fjernet i begge OVCA433 og SKOV3-celler, efterfulgt af genoptagelse ved 6 timer efter serum re-tilsætning i OVCA433. I SKOV3, inddrivelse af p-Akt var hurtigere 1 time. En mindre fald af p-ERK blev observeret i begge celler i fravær af serum, og en yderligere reduktion blev også observeret i begge celler, når serum blev genindlagt i 1 time. Ekspressionen af ​​p-ERK blev genoptaget efter 2 timer af serum administration og gradvist nået til det oprindelige niveau ved 24 timer. Ingen dybtgående ændring blev observeret i enten total Akt eller ERK (figur 3A).

For at bekræfte den potentielle inddragelse af PI3K-Akt og MEK-ERK veje i reguleringen af ​​PDCD4, Specifik PI3K-inhibitor LY294002, og MEK-inhibitor U0126 blev indført til de udsultede celler sammen med serum og inkuberet i 2 timer og 4 timer efter 48 timers udsultning behandling. Når p-Akt blev specifikt nedreguleret ved behandlingen af ​​LY294002 blev udtømningen af ​​PDCD4 forhindret (figur 3B). Men administrationen af ​​U0126 ikke udviser nogen effekt på forebyggelse af PDCD4 nedbrydning (Figur S1). Hertil kommer, når proteasominhibitor MG132 blev introduceret til de udsultede celler, udtømningen af ​​PDCD4 blev også forhindret (figur 3B). Ingen virkning blev observeret i DMSO kontrolceller. Vores resultater indikerede, at nedbrydningen af ​​PDCD4 efter re-tilsætning af serum i ovariecancerceller skyldtes proteasomet-medieret nedbrydning. Den kvantificering af de vestlige blotting bands blev præsenteret i data S2.

I PDCD4 overekspression æggestokkene celler, PTEN blev op reguleret, og p-Akt og p-ERK var signifikant nedreguleret, mens total Akt og ERK blev ikke påvirket (figur 3C). Den kvantificering af de vestlige blotting bands blev præsenteret i data S2.

Intracellulær translokation af PDCD4

Vores tidligere immunhistokemi undersøgelse viste en differentieret cellulær lokalisering mønster af PDCD4 mellem normale og maligne æggestokkene celler [17] , hvilket antyder, at PDCD4 kan translokere fra kernen til cytoplasmaet under ovarieudvikling kræft. Andre undersøgelse viste også den intracellulære translokation af PDCD4 under nogle stress betingelser [18]. Vi undersøgte derefter den endogene PDCD4 lokalisering i ovariecancerceller. To ovarian cancer cellelinjer, OV2008 og C13, har højt ekspressionsniveau af det endogene PDCD4, som blev fundet udelukkende lokaliseret i kernen under normale dyrkningsbetingelser (figur 4). Efter serumudsultning behandling i 48 timer blev den endogene PDCD4 fundet at translokeres fra kernen til cytoplasmaet (figur 4).

Endogen PDCD4 i både OV2008 og C13 ovariecancer celler blev udelukkende lokaliseret i kernen, når de dyrkes i medium med serum. Mere cytoplasmatisk lokalisering af PDCD4 blev observeret under serumudsultning behandling. Endogen PDCD4 blev påvist ved immunfluorescensfarvning ved anvendelse PDCD4 primært antistof og FITC-mærket gede-anti-kanin sekundære antistoffer. DAPI-farvning angivet kernelokalisering. Repræsentant translokation blev angivet med pile.

Diskussion

En række undersøgelser har rapporteret de hæmmende virkninger af PDCD4 på protein oversættelse [19], [20], og AP-1 afhængig transaktiveringsfunktion [12], [21]. Undersøgelser af PDCD4 funktion på cellecyklus har genereret inkonsistente resultater. I brystkræftceller, PDCD4 forårsagede en øget befolkning G0 til G1 fasen uden at påvirke andre faser af cellecyklus tyder på en potentiel rolle i apoptose [22]. I gliom-cancerceller, PDCD4 forsinket cellecyklus overgangen fra G1-til-S-fase [23]. En anden gruppe rapporterede, at PDCD4 inducerede celler i både sub-G1 og G2-S-fasen, hvilket indikerer dens virkninger på både apoptose og cellecyklusstandsning [24]. Men i colon cancerceller, PDCD4 ændrede ikke cellecyklusprogression eller inducere apoptose [8]. I den aktuelle undersøgelse, ektopisk PDCD4 ekspression induceret cellecyklusstandsning ved G1 stadium og dermed undertrykt ovariecancer celleproliferation.

Vi vurderede ekspressionen af ​​et panel af cellecyklus regulatorer, der spiller vigtige roller i G1-S overgangen i PDCD4 over-udtrykkende celler. PDCD4 inducerede udtryk for p27 og p21, men ikke de udtryk for cyclin E. Vores resultater var i overensstemmelse med resultaterne, at knockdown af PDCD4 i AML-celler resulterede i nedregulering af p27 [25]; og induktionen af ​​p21 og p27 ved PDCD4 [26]. De cellulære virkninger af PDCD4 blev foreslået for at være anderledes i celle-modeller med eller uden p53 udtryk [10], [27]. To ovarie cellelinjer udvalgt i denne undersøgelse har differentieret p53 status, OVCA433 bærende vildtype p53, og SKOV3 være null p53. Begge cellelinier havde forhøjede P27 udtryk ved overekspression af PDCD4, og opregulering af p21 blev ikke medieret af p53 i OVCA433 celler. Lignende resultater er blevet rapporteret, at induktion af p21 ved PDCD4 i carcinoide celler var uafhængig af p53 [7]. Vores resultater antydede, at en af ​​de potentielle mekanismer for induktion af standsning af cellecyklus ved G1 stadium ved PDCD4 skyldtes den opregulering af p21 og p27. Vi bemærkede, at der ikke var nogen forskel i cyklin A eller Cdc25A udtryk mellem stabil klon og tomme vektor kontrol i SKOV3 cellelinjer. Men for OVCA433 celler observerede vi en stigning på Cdc25A ekspression i de to PDCD4 over-udtrykkende stabile kloner, og en stigning på cyclin A ekspression i 433 PDCD4 c2 men ikke i c1. Den differentielle ekspression af cyclin A kan skyldes de forskellige proliferative og klonogene aktiviteter PDCD4-udtrykkende klon c1 og c2. Ikke desto mindre, vil virkningerne af PDCD4 på cyklin A og Cdc25A brug for yderligere undersøgelse.

Udover spredning, vi også demonstreret de hæmmende virkninger af PDCD4 på kræft i æggestokkene celle migration og invasion. Lignende effekter er også rapporteret i studier udført i tyktarmen og HCC celler [8], [20], [28]. PDCD4 fandtes at blive induceret ved behandling af pro-apoptotiske stoffer [29], [30]. Undersøgelser på dens rolle i apoptose har genereret inkonsistente resultater. PDCD4 er blevet demonstreret at inducere apoptose i bryst- og lungecancer-celler [22], [26] I modsætning hertil blev der ikke observeret nogen apoptotiske virkning af PDCD4 i andre undersøgelser [8], [12]. Derudover er der rapporteret højere PDCD4 udtryk til at være korreleret med øget følsomhed over for geldanamycin og tamoxifen [31]. Desuden er en nylig undersøgelse foretaget i prostatacancerceller foreslog en øget cisplatin og paclitacel følsomhed ved overekspression af PDCD4 [32]. I den foreliggende undersøgelse har overekspression af PDCD4 ikke inducere apoptose ifølge flowcytometri og western blot-assay gennem PARP-ekspression (figur S2). Vi vurderede også potentielle rolle PDCD4 på cisplatin følsomhed. Der blev imidlertid ikke observeret nogen signifikant forskel mellem PDCD4 over-udtrykkende celler og kontrolcellerne som respons på cisplatin-behandling (figur S2), hvilket var i overensstemmelse med vores tidligere offentliggjorte data, at ingen korrelation af PDCD4 udtryk med kemosensitivitet status ovariecancerpatienter blev observeret [17]. Eftersom mekanismen for cisplatin til at dræbe kræftceller er at initiere celle apoptose, og PDCD4 viste ingen apoptotisk virkning i ovariecancerceller, dette kan være en af ​​grundene, der bidrager til den ovennævnte observation.

Som bemærket fra vores resultater, størrelsen af ​​undertrykkelse af kræft i æggestokkene proliferation, migration og invasion var ikke i forhold til de over-udtryk niveauer af PDCD4 protein i disse stabile kloner. Lignende resultater blev også rapporteret i undersøgelsen foretaget af Yang et al. i mus epidermale JB6 RT101 celler [21]. Vi foreslog, at der kan være en koncentration tærskel, når overskrides, vil der opstå den hæmmende funktion PDCD4 på tumor progression. Ifølge vores flowcytometri vurdering overekspression af PDCD4 i både OVCA433 og SKOV3-celler induceret cellecyklusstandsning ved G1 fase. Selv om der blev observeret en undertrykkende virkning på celleproliferation og kolonidannelse i PDCD4 overudtrykker SKOV3-celler, effekten var ikke statistisk signifikant, når man sammenligner med de parentale kontrolceller (Figur S3). Om det var på grund af den genetiske baggrund af SKOV3 celler eller inddragelse af andre mekanismer og faktorer var i øjeblikket ikke klart, og krævede yderligere undersøgelser.

De observationer af nedregulering af p-Akt og p-ERK i PDCD4 over-udtrykkende celler foreslog en potentiel inddragelse af p-Akt og p-ERK veje i reguleringen af ​​PDCD4. For at løse det spørgsmål, hvorvidt disse to veje faktisk er involveret, vi fortsatte med at studere samtidige udtryk for p-Akt, p-ERK og PDCD4 under serum tilbagetrækning og re-tilføjelse behandling. Der var en dramatisk stigning af PDCD4 upon serum tilbagetrækning, efterfulgt af hurtig udtømning af PDCD4 efter serum blev igen indgivet. I samme proces, en omvendt tendens i ekspression af både p-Akt og p-ERK, de to vigtige celleproliferation regulatoriske molekyler, blev observeret: en indledende reduceret ekspression efterfulgt af en gradvis genoptagelse. Ændringen af ​​p-Akt og p-ERK måske blot konsekvenserne af serum frakendelse behandling. Og stadig i betragtning af de samtidige ændringer i udtrykkene for PDCD4 og p-Akt og p-ERK, og ændret ekspression niveau for begge molekyler observeret i PDCD4 over-udtrykkende celler, der er en mulighed for, at p-Akt og p-ERK veje var involveret i reguleringen af ​​PDCD4. For yderligere at bekræfte det, vi anvendte PI3K-inhibitor LY294002 (som efterfølgende blokerer Akt fosforylering) sammen med serum, og fandt PDCD4 protein ikke længere var nedbrudt. Indførelse af MEK-inhibitor forhindrede ikke udtømning af PDCD4. Vores resultater viste, at p-Akt men ikke p-ERK var nødvendig for nedbrydningen af ​​PDCD4 upon serum stimulation, og således PI3K-Akt pathway kan spille en direkte rolle i modulering af PDCD4 nedbrydning i ovariecancerceller. Men inddragelse af p-ERK vej er ikke klart på nuværende og krævede yderligere undersøgelser. Der har været undersøgelser rapporterer p-Akt pathway om reguleringen af ​​PDCD4. Dorrello undersøgelse impliceret rolle S6K1 i reguleringen af ​​PDCD4 nedbrydning som reaktion på mitogen [23]. Behandling med tumor promotor 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) faldt PDCD4 udtryk, der kan henføres til proteasomalaktivitet nedbrydning medieret af PI3K-Akt-mTOR-p70

S6K og lettes af MEK-ERK signalvej [16] . En omvendt korrelation af PDCD4 og p-Akt ekspression er blevet rapporteret i kolorektale cancer vævsprøver [33]. shRNA PDCD4 aktiverede Akt pathway, hvilket fører til den øgede udtryk for p-Akt, mTOR og p70S6K i lungerne hos mus [34]. Vores resultater var i konkordans til disse resultater og indebar inddragelse af p-Akt pathway i reguleringen af ​​PDCD4 i æggestokkene cancerceller.

Ved at kombinere det fænomen, at nedreguleringen blev observeret af p-Akt udtryk i PDCD4 løbet udtrykkende celler, og det faktum, at blokering af p-Akt af PI3K-inhibitor forhindrede nedbrydningen af ​​PDCD4 under serumudsultning og re-tilsætning proces, foreslog vi en potentiel feedback kontrol af PDCD4 gennem p-Akt pathway: etablering af PDCD4 over- udtrykkende stabile kloner kunne kun opnås, når nedbrydning af PDCD4 blev inhiberet, hvilket krævede undertrykkelse af p-Akt ekspression (figur 5). Imidlertid har de potentielle mekanismer medierende denne feedback kontrol og molekyler involveret ikke blevet identificeret, og der er behov for yderligere undersøgelser.

Forhøjet PTEN og undertrykt p-Akt blev fundet i PDCD4 overekspression stabile kloner. Når celler blev udsultet med serum-frit medium, PDCD4 var un-phosphoryleret grund undertrykt p-Akt ekspression. Un-phosphoryleret PDCD4 blev ikke anerkendt af proteasom hvilket fører til akkumulering af PDCD4. Når serum blev re-administreret til cellerne, opreguleret p-Akt phosphoryleret PDCD4, som derefter blev depleteret gennem proteasom nedbrydning. Administration af enten PI3K-inhibitor LY294002, kan forhindre PDCD4 i at blive phosphoryleret af p-Akt, eller proteasominhibitor MG132, forhindrer udtømningen af ​​PDCD4, hvilket fører til akkumulering af PDCD4.

Vores nuværende resultater viste en translokation af endogen PDCD4 fra kernen til cytoplasmaet ved serumudsultning. Vi antager, at PDCD4 måske shuttle til cytoplasmaet at udstille sin hæmmende funktion på protein translation, når celler var under ugunstige vækstbetingelser. Ifølge vores tidligere resultater, blev der observeret en differentieret lokalisering af PDCD4 mellem normale og maligne æggestokkene vævsprøver: mere cytoplasmatisk lokalisering af PDCD4 blev observeret i æggestokkene kræft vævsprøver [17]. Når tumor vokser, kan der være nogle områder, hvor iltindholdet er betydeligt lavere end i de normale væv, og tumorceller er under en hypoxisk stress. En hypotese er, at i disse celler, PDCD4 kan shuttle til cytoplasmaet til at inhibere translation og efterfølgende cellevækst. I det hele PDCD4 fungerer som tumorsuppressor i kernen i normale celler, men når cellerne var under visse miljømæssige stress eller undergår potentiel transformation fra normal til malign, en af ​​det cellulære respons kan være transportere PDCD4 til cytoplasmaet. Dette gør lokaliseringen af ​​PDCD4 som indikator for celler under unormal vækst miljø eller neoplasmic transformation. Ikke desto mindre er translokation mekanisme PDCD4 er stadig ikke klar og hypotesen skal evalueres yderligere.

Materialer og metoder

Cell kultur, serum sult behandling og medicinsk behandling

kræft i æggestokkene cellelinjer OVCA433 og SKOV3 anvendt i denne undersøgelse var gave fra Prof. SW Tsao, Anatomisk Institut, University of Hong Kong. Kræft i æggestokkene cellelinjer C13 og OV2008 var gave fra Prof. BK Tsang, Institut for Obstetrik og Gynækologi, University of Ottawa, Canada. Disse cellelinier blev dyrket i MEM med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA).

celler under serum sult behandling blev dyrket i MEM uden FBS. Phosphoinositid 3-kinase (PI3K) inhibitor LY294002 (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA), MEK-inhibitor U0126 (Cell Signaling), proteasominhibitor MG132 (cellesignalering) blev opløst i DMSO (Sigma Co., St. Louis, MO ) og yderligere fortyndet før introduceret til celler. Medium med DMSO alene var også inkluderet som kontrol.

Antistoffer og western blot-analyse

Protein ekstraktion og Western blot fremgangsmåder var de samme som tidligere beskrevet [17]. PDCD4 antistof var fra Rockland (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA); antistoffer af p21, cyclinA, cyclin og p53 var fra Santa Cruz; antistoffer af PTEN, p-Akt, Akt, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, Cdc25A, mTOR var fra cellesignalering; antistof p27 var fra BD Transduction laboratorier.

Konstruktion af PDCD4 cDNA ekspressionsvektor

PDCD4 fuld-længde cDNA blev opformeret ved PCR ved hjælp af human PDCD4 cDNA klon (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) (Genebank accessionsnummer NM_014456.3) som template og de følgende primerpar 5’gaattccATGGATGTAGAAAATGAGCAGA 3 ‘(sense) og 5’gtcgacTCAGTAGCTCTCTGGTTTAAGA 3’ (antisense), som indeholdt EcoRI- og Sall-restriktionsenzymsteder. En 1,5-kb, fuld længde PDCD4 PCR produkt blev derefter klonet i ramme, ind i pEGFP-C1 (Clontech laboratorier, Mountain View, Californien).

Etablering af PDCD4 over- udtrykke stabile kloner

PDCD4 plasmid eller GFP-C1 vektor blev transficeret i OVCA433 og SKOV3 ovariecancerceller under anvendelse Fugene HD transfektionsreagens (Roche Molecular Biochemicals, Manniheim, Tyskland) ifølge fabrikantens protokol.