PLoS ONE: Hyppig Heterogen missense Mutationer af GGAP2 i prostatakræft: Konsekvenser for Tumor Biology, Klonalitet og Mutation Analysis

Abstrakt

Prostatakræft er den mest almindelige visceral malignitet i vestlige mænd og en væsentlig årsag til kræftdødsfald . Øget aktivering af AKT og NFkB veje er blevet identificeret som kritiske trin i prostatakræft initiering og progression. GGAP2 (GTP-bindende og GTPase aktiverende protein 2) er et multidomain protein, som indeholder en N-terminal Ras homologi domæne (GTPase), efterfulgt af en PH-domæne, et C-terminalt GAP-domæne og et ankyrin repeat domæne. GGAP2 kan direkte aktivere signalering via både AKT og NFkB veje og fungerer som et knudepunkt for krydstale mellem disse veje. Øget GGAP2 udtryk er til stede i tre fjerdedele af prostatakræft. Mutationer af GGAP2 er blevet rapporteret i cellelinier fra andre maligniteter. Vi analyserede derfor 84 prostatakræft væv og 43 benign prostata væv til somatiske mutationer i GGAP2 ved direkte sekventering af individuelle kloner afledt af GAP og GTPase domæner normalt og tumorvæv. Samlet set halvdelen af ​​cancere indeholdt mutante GAP domæne kloner og i 20% af cancere, 30% eller mere af kloner var mutant i GAP-domæne. Overraskende mutationerne var heterogen og nonclonal, med flere forskellige mutationer er til stede i mange tumorer. Lignende resultater blev observeret i analysen af ​​GTPase domæne. Mutante GGAP2 proteiner havde signifikant højere transkriptionsaktivitet under anvendelse AP-1 responsive reporter-konstruktioner sammenlignet med vildtype-proteinet. Desuden blev tilstedeværelsen af ​​disse mutationer associeret med aggressiv klinisk adfærd. Tilstedeværelsen af ​​højfrekvente nonclonal mutationer af et enkelt gen er hidtil ukendt og repræsenterer en ny form for genetisk ændring, der kan fremme tumorudvikling. Analyse af mutationer i cancer er blevet anvendt til at forudsige udfaldet og guide terapeutisk identifikation målet, men sådan analyse har fokuseret på klonale mutationer. Vores undersøgelser viser, at i nogle tilfælde kan være nødvendigt at vurdere såvel højfrekvente nonclonal mutationer

Henvisning:. Cai Y, Wang J, Ren C, Ittmann M (2012) Hyppig Heterogen missense Mutationer af GGAP2 i prostatakræft : Konsekvenser for Tumor Biology, Klonalitet og Mutation Analysis. PLoS ONE 7 (2): e32708. doi: 10,1371 /journal.pone.0032708

Redaktør: Sharon A. Glynn, National University of Ireland Galway, Irland

Modtaget: December 1, 2011; Accepteret: 31 Januar 2012; Udgivet: 28 februar, 2012 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering: blev muliggjort Støtte til MI via Department of Defense Prostata Cancer Research program (W81XWH-07-1-0023; http:. //Cdmrp .army.mil), National Cancer Institute til Dan L. Duncan Cancer center (P30CA125123, www.nih.gov) og ved brug af faciliteterne i Michael E. DeBakey Department of Veterans Affairs Medical center (www.houston .va.gov). Støtte til YC blev muliggjort via Department of Defense Prostata Cancer Research program (W81 WH-07-01-0220, https://cdmrp.army.mil). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

En række genetiske og epigenetiske ændringer er blevet beskrevet i prostatacancer. Talrige undersøgelser har fundet konsistente mønstre af kopi nummer ændringer såsom tab af 8p og 13q14 og gevinst på 8q24 i klinisk lokaliseret og avancerede prostatakræft [1], [2]. Epigenetiske ændringer såsom methylering, er også almindelig i prostatacancer. I modsætning hertil har de fleste undersøgelser til dato kun vist sjældne klonale punktmutationer klinisk lokaliseret prostatacancer [2], [3]. I mere avancerede prostatakræft, klonale punktmutationer af tumorsuppressorgener, såsom PTEN [4] og p53 [3] er mere almindelige, i modsætning til den lave hyppighed af mutation af disse gener i lokaliserede cancer [5], [6], men er stadig ikke almindeligt sammenlignet med de fleste maligniteter. Aktivering klonale mutationer i onkogener, såsom RAS, er ikke almindelige i prostatacancer i USA [3], i modsætning til den mere hyppige mutation observeres i andre almindelige humane cancere, såsom colon og lungekræft. Klonal androgenreceptor mutationer ses i kastrationsniveau resistent prostatacancer og synes at blive udvalgt til som en mekanisme, hvorved prostatacancerceller kan overleve i lav androgen miljøet [3]. Således foreliggende data viser, klonale punktmutationer, især af onkogener, er sjældne i klinisk lokaliseret prostatacancer.

GGAP2 (også kendt som PIKE-A) er en G-protein, som har en stærk GTPase aktivitet, som forventet fra dens RAS homologi domæne. Den indeholder også en GAP domæne kan aktivere GTPase aktivitet via enten intramolekylære eller intermolekylære interaktion. GGAP2 binder til aktiverede AKT og kraftigt øger dens aktivitet og denne interaktion fremmes af GTP binding [7]. Vi har vist, at aktiveret AKT kan binde og phosphorylere GGAP2 i serin 629, som forøger GTP-binding ved GGAP2 og AKT aktivering [8]. Phosphoryleret GGAP2 kan også binde p50-underenheden af ​​NFkB og forøger NFkB transkriptionel aktivitet. Øget aktivering af phosphatidylinositol-3-kinase /AKT og NFkB veje er begge blevet identificeret som kritiske veje i kræft initiering og progression i en række forskellige humane maligniteter, herunder prostatacancer. Vi har demonstreret signifikant forøget ekspression GGAP2 i størstedelen af ​​humane prostatacancer [8]. Når GGAP2 udtrykkes i prostatacancerceller det øger proliferation, fokus-dannelse in vitro og tumorprogression in vivo. Således øgede GGAP2 udtryk, som er til stede i tre fjerdedele af humane prostatakræft, kan aktivere to kritiske veje, der er blevet knyttet til prostatakræft initiering og progression og kan forbedre tumor progression in vivo.

Hu et al har identificeret mutantformer af GGAP2 i sarkom, neuroblastom og glioblastomcellelinier [9]. In vitro studier viser disse muterede former har forbedret GTPase aktivitet og stærkere aktivere AKT end vildtype GGAP2. I overensstemmelse med disse observationer de GGAP2 mutanter fremme væksten af ​​glioblastom celler og transformation af NIH3T3 celler [10]. Vi søgte derfor at identificere mutationer af GGAP2 i humane prostatakræft prøver. Vi har fundet høje frekvenser af missense GGAP2 mutationer i klinisk lokaliseret human prostatacancer. Overraskende mutationerne er heterogene og nonclonal, med flere forskellige mutationer er til stede i mange tumorer. Tilstedeværelsen af ​​disse mutationer var forbundet med aggressiv klinisk adfærd og øget AP-1 transkriptionel aktivitet. , GGAP2 er således den mest almindeligt muterede onkogen i human prostatacancer til dato, men mutationerne er heterogene snarere end klonal, hvilket indebærer markeret klonal heterogenitet i klinisk lokaliserede humane prostatakræft. Tilstedeværelsen af ​​højfrekvente nonclonal mutationer af et enkelt gen er ny og repræsenterer en ny form for genetisk ændring, der kan fremme tumor progression.

Resultater

Mutation analyse af GAP domænet af GGAP2

for at afgøre, om GGAP2 er muteret i prostatakræft vi i første omgang fokuseret på GAP domæne, da denne region er en vigtig negativ regulator af GGAP2 aktivitet. Vi analyserede cDNA’er fra 15 cancere og 9 benign prostata væv fra radikal prostatektomi prøver. GAP-domæne blev amplificeret og individuelle kloner blev isoleret og sekventeret. Resultater er vist i tabel 1. Tolv af femten kræfttilfælde havde mindst én klon med et GGAP2 missense og /eller stoppe mutationer mens kun 2 af 9 godartede tilfælde havde sådanne mutationer. De godartede tilfælde havde kun en enkelt mutant klon hver mens op til 42 procent af kloner i de cancertilfælde var muteret. Samlet 38 af 206 kloner fra kræft væv var mutant versus 2 af 137 i godartet. Denne forskel var yderst statistisk signifikant (p 0,001, chi square). For at udelukke en artefakt på grund af revers transkription eller muligheden for, at mutant udskrifter kan omskrives fortrinsvis eller har øget stabilitet vi direkte analyseret GAP domænet genomiske DNA fra 46 kræftformer og 22 godartede væv. Som vist i tabel 1, 20 af 46 cancervæv indeholdt mindst én mutant klon og i 12 af 46 cancervæv mere end 30% af klonerne indeholdt missense eller stoppe mutationer. Kun en enkelt mutant klon blev identificeret fra de godartede væv. Samlet set 52 af 334 kloner fra kræft væv var mutant versus 1 af 167 fra godartede væv (p 0,001, chi firkant). Kombination cDNA og genomisk analyse, 32 af 61 kræfttilfælde indeholdt kloner med GAP domæne mutationer og i 14 tilfælde 30% eller flere af de kloner var mutant.

Overraskende fandt vi, at missense mutationer var meget heterogen . Der var ingen tilbagevendende missense mutationer involverer mere end to tumorer. I væv med flere mutante kloner var der kun to tilfælde med to identiske mutante kloner. Der var variation i fordelingen af ​​missense mutationer med regionerne mellem aminosyrerne niveauet 640-660 og 700-710, der har relativt hyppigere mutationer, mens mutationer var ualmindeligt fra aminosyrer 540-570, men der var ingen statistisk signifikante “hot spots”. I adskillige kloner fandt vi 2 mutationer i den samme klon. Dette svarer til observationen af ​​Hu et al [9], som fandt multiple mutationer i flere mutante GGAP2 cDNA’er isoleret fra sarcoma og glioblastomcellelinier. Ud over de mange missense mutationer, vi observerede 3 Stop mutationer, alle til den carboxyterminale del af GAP-domæne (aa 703-709), som er placeret mod den carboxyterminale ende af GGAP2 proteinet og ville resultere i et trunkeret protein. Notatet Hu et al [9] fundet en trunkering i aminosyre 756 i GGAP2 cDNA fra CRL-2098 osteosarcomceller.

I betragtning af denne overraskende heterogenitet vi overvejet den mulighed, at det kan udgøre en PCR fejlinkorporering artefakt. Vi fandt imidlertid kun 3 tavse mutationer blandt 540 kloner fra kræft væv (versus 90 missense eller stop), mens i de godartede væv vi fundet 2 tavse mutationer blandt 304 kloner (versus 3 missense mutationer). Andelen af ​​missense og stoppe versus stum mutation var meget højere i cancervæv end i godartet væv og forskellen var statistisk signifikant (p = 0,02, Fisher exact test). Dette er i modstrid med en tilfældig fejlinkorporering. For yderligere at undersøge dette punkt, vi systematisk bestemmes konsekvenserne af overgangen mutationer på aminosyresekvens for alle nukleotider i GAP-domæne. Vi undersøgte kun overgange siden 82% af de observerede mutationer var overgangsmetaller mutationer (data ikke vist). Systematisk overgang mutation af hvert nukleotid i GAP-domæne ville give 273 missense, 15 stop-mutationer og 162 stumme mutationer. Forskellen i andelen af ​​missense og stoppe versus stille mutationer vi observeret (90 og 3) sammenlignet den forudsagte distribution (288 og 167) var yderst statistisk signifikant (p 0,001, chi sq). Endelig overvejede vi muligheden for, at cancervæv havde en stigning på mutation målretning den første og anden baser af hvert kodon resulterer i tilfældig missense mutation i alle gener. Vi undersøgte derfor 5 cancer og 5 godartede væv for mutationer i β-actin. Vi fandt ingen mutationer i 32 kloner fra kræftvæv og 36 kloner fra godartede væv. Andelen af ​​missense og stop kloner i GGAP2 var statistisk signifikant højere end i β-actin (p = 0,02, chi sq). Således de observerede heterogene mutationer i GAP domæne GGAP2 er faktisk ægte.

Mutation analyse af GTPase domæne GGAP2

GTPase domæne er også en vigtig regulator af GGAP2 aktivitet. Vi undersøgte derfor cDNA fra 23 kræftformer og 12 godartede væv til GTPase domæne mutationer. Resultaterne var meget lig dem observeret med GAP domæne (tabel 2). Femten af ​​23 cancere indeholdt missense mutationer versus 1 af 12 benigne væv. I fire kræfttilfælde, 40% eller mere af kloner var mutant, mens kun en enkelt mutant klon blev observeret i godartet væv. Samlet set blev 28 af 188 kloner fra kræft væv muteret versus 1 af 88 i godartet væv (p 0,001, chi sq). Det overordnede mønster af mutationer i cancervæv svarede til GAP-domæne ved, at mutationer var stærkt heterogen, både inden for en enkelt kræftvæv og mellem cancervæv. Vi fandt en dobbelt mutant klon, svarende til GAP-domæne. Notatet blev der ikke stop-mutationer observeret. I betragtning af den aminoterminale placering af GTPase domæne vil eventuelle stop-mutationer næsten helt sikkert give inaktivt protein, da det ville mangle PH-domænet. Vi fandt kun 2 stille mutationer, en i en cancer og en fra godartet væv. I ni væv af 35 analyserede (26%) opdaget vi flere kloner indeholdende en tidligere beskrevet tavs polymorfi (Rs17852479) ved L246, som ikke resulterer i nogen aminosyre forandring. Denne polymorfi forekommer i ca. 28% af individer i tidligere undersøgte populationer, der ligner vores konklusion. Et resumé af mutationen analyse af GGAP2 er vist i tabel 3.

GAP Domain Mutationer Forøg AP-1 transkriptionel aktivitet

Vi har vist, at NFKB kan øge ekspressionen af FOS i prostatacancerceller og dermed AP-1-aktivitet [11]. For at teste, om GGAP2 og mutant GGAP2 påvirket AP-1 transskription vi brugte mutagenese til ingeniør GGAP2 ekspressionskonstrukter indeholdende 9 forskellige missense mutationer. Disse mutante konstruktioner eller vildtype eller tom vektor kontrol blev co-transficeret med en AP-1 reporter konstruktion i 293T-celler og normaliseret luciferaseaktivitet måles. Som vist i figur 1, vildtype GGAP2 beskedent forøger AP-1 drevet transkription. Flere mutante kloner påvist markant forøgelse af AP-1-promotoren transkription i celler transficeret med mutant sammenlignet med vildtype-GGAP2 (fig. 1).

Stjerner angiver statistisk signifikant stigning i forhold til vildtype (WT) GGAP2 ved ANOVA (p 0,05). Gennemsnit +/- SEM. Mutation og antal transfektioner vises.

Foreningen af ​​GAP domæne mutationer med kliniske og patologiske parametre for aggressiv sygdom

For at afgøre, om tilstedeværelsen af ​​missense eller stoppe mutationer i GAP domænet var forbundet med aggressiv sygdom undersøgte vi i andel af sådanne mutante kloner i prostatacancer med forskellige kliniske og patologiske parametre associeret med aggressiv sygdom (figur 2). Tidlig PSA recidiv efter radikal prostatektomi er forbundet med død af sygdom [12]. Kræft med tidlig PSA recidiv havde 49 mutationer blandt 172 kloner analyseret, mens tilfælde uden tidlig PSA recidiv havde kun 34 mutationer i 234 kloner. Denne forskel var statistisk signifikant (p 0,001, chi sq). Konsistent med dette har vi også fundet signifikant forøget andele af GAP mutationer i tilfælde med bækkensmerter lymfeknudemetastase (p = 0,027, chi sq), sædblæren invasion (p = 0,027, chi sq), extracapsular forlængelse (p = 0,015, chi sq ) og højere Gleason score (Gleason 5/6 Versus 7-10, p = 0,002, chi sq). Disse fund støtter stærkt konceptet, at GAP domæne mutationer i GGAP2 kan fremme prostatakræft progression.

brøkdel af kloner indeholdende missense eller stoppe mutationer for sager med hver angivne kliniske eller patologiske parameter vises. Alle forskelle mellem patologiske og kliniske variable var statistisk signifikante. Specifikt: for tidlig PSA recidiv ( 2 år postoperativt) versus ingen eller sent recidiv (p 0,001, chi sq); extracapsular udvidelse (ECE) versus ingen ECE (p = 0,015, chi sq); sædblæren invasion (SVI) versus ingen SVI (p = 0,027, chi sq); bækken lymfeknudemetastase (LN) versus ingen metastaser (p = 0,027, chi sq); Gleason 5/6 versus 7-10 (p = 0,002, chi sq).

Diskussion

Klonale mutationer i klinisk lokaliseret prostatacancer er ualmindelige og normalt involverer tumorsuppressorgener (revideret i [3]). Mutationer i onkogener såsom RAS er ualmindelige i amerikanske mænd med prostatakræft, selvom RAS mutationer er blevet identificeret mere almindeligt i prostatakræft fra japanske mænd [3]. Vi har identificeret hyppige mutationer af GGAP2 i lokaliseret prostatacancer. Samlet set halvdelen af ​​cancere indeholdt mindst én mutant GAP domæne klon og i 20% af cancere, 30% eller mere af kloner var mutant i GAP-domæne. Overraskende, mens der var 10 forskellige tilbagevendende mutationer disse kun gentog 2-3 gange hver, samlet GAP domæne mutationerne var heterogene og nonclonal. Lignende resultater blev observeret i analysen af ​​GTPase domæne. Flere linjer af beviser hævder, at disse fund er ikke en artefakt herunder: sjældenhed mutation i godartede prostata væv; dominans missense mutationer i kræft væv; knapheden på stille mutationer i cancervæv og fraværet af mutationer i β-actin.

Mens både overekspression og nonclonal mutation af GGAP2 er almindelige i prostatacancer forholdet mellem disse to ændringer er uklar. Begge kan potentielt aktivere siganaling aktiviteter GGAP2 i prostatacancer, selvom detaljerede undersøgelser ville være nødvendige for at skelne, om disse aktiviteter er de samme for forskellige specifikke mutationer. I nogle tilfælde overekspression kan potentielt forbedre de biologiske aktiviteter associeret med mutation, selvom det også er muligt at mutation kan kompensere for manglende overekspression. vil være behov for detaljerede studier af GGAP2 udtryk, nonclonal mutation og markører for pathway aktivering i et stort antal tumorer til at forstå konsekvenserne af disse forskellige ændringer i prostatakræft.

intratumoral genetisk heterogenitet involverer punktmutationer af gener såsom p53 eller K-RAS i forskellige regioner af enkelt makroskopiske tumorer er blevet bemærket i kræftformer såsom tyktarmskræft [13] og gliomer [14]. Det skal bemærkes, at alle tumorer i vores tilfælde repræsenterer en enkelt tumor fokus 6 mm og dermed vores cancere alle var fra et enkelt tumor fokus og er således den heterogenitet vi observerede adskiller sig fra denne geografiske genetisk heterogenitet. I vores tilfælde, den observerede heterogenitet afspejler heterogenitet på celleniveau inden for en enkelt tumor fokus.

Er mutationerne vi observerede signifikant? Den missense mutation frekvens observeret i GAP domænet kræft væv var 370 × 10

-6 pr bp sekventeret og for GTPase domæne 298 × 10

-6 pr bp. Bielas et al [15] har vist, at frekvensen af ​​tilfældige mutation i kræft væv er ca. 2,1 × 10

-6 pr bp på tværs af flere typer kræft. Således vores observeret frekvens for missense mutation i GGAP2 er 100 gange højere end baggrunden på mutation, kraftigt indebærer selektiv vækstfordel for de mutante kloner. Vi har også fundet en signifikant sammenhæng mellem frekvensen af ​​mutation i GAP-domæne og kliniske og patologiske parametre associeret med aggressiv sygdom, hvilket indikerer, at de er klinisk signifikant. Det skal bemærkes, at i 20% af tilfældene undersøgt, at mere end 30% af kloner fra kræft var mutant i GAP-domæne. Eftersom de analyserede væv var ca. 80% kræft i gennemsnit, vil mindst 75% af cancerceller indeholder en mutant allel (forudsat en mutation per celle) i sådanne tilfælde. Dette er et minimum tal siden den ikke omfatter GTPase domæne mutationer og potentielle mutationer i andre regioner i GGAP2, som er blevet rapporteret [9]. de observerede højfrekvente heterogene mutationer kunne således bidrage direkte til lokal tumorvækst i mange tilfælde. Derudover kan de mest potente mutationer fremme metastase af specifikke cellulære kloner. Der er beviser for det koncept, at nonclonal p53 mutationer i primær prostatakræft kan give anledning til metastatiske læsioner [16]. Den høje frekvens af diverse nonclonal mutationer i GGAP2 kan give mange potentielle metastatiske kloner.

De fleste studier af mutationer i kræft har med rette fokuseret på klonede mutationer, da det er lettere at se betydningen af ​​sådanne mutationer. Heterogene nonclonal mutationer vil ikke blive opdaget af mange analysemetoder eller ikke yderligere analyseret, da det er uklart, om de kan være PCR artefakter eller blot passager mutationer. Vores resultater viser, at højfrekvente heterogene nonclonal mutationer i nogle tilfælde kan forekomme og kan være klinisk vigtig. Det er endnu ikke fastlagt, hvor ofte det er tilfældet med andre tumorsuppressorgener og onkogener. I nogle tilfælde grupper har analyseret primære prostatakræft for tilstedeværelsen af ​​mutation hjælp enkelt konformationspolymorfisme analyser efterfulgt af sekventering af unormalt migrerende bands og fundet relativt høje mutation i nogle gener. For eksempel ved anvendelse af denne fremgangsmåde, mutationer i plexin-B1 i blev identificeret i 46% af de primære prostatakræft [17], men det er vanskeligt at bestemme den nøjagtige procentdel af tumorceller i en tumor med at mutation. I betragtning af, at mutationerne er hyppige nok til at give en tydelig band på enkelt konformationspolymorfisme analyser skal de være ret hyppige men ikke klonede. Dette er i modsætning til vores resultater i GGAP2 hvori mutationerne er meget heterogene. Således variable niveauer af nonclonal mutationer, fra yderst heterogen at oligoklonale kan eksistere i prostatakræft. På den anden side, ved hjælp af en tilgang ligner vores, Steinkamp et al [18] sekventeret androgen receptor mRNA fra kastrationsniveau resistent prostatacancer metastaser. De fandt høje niveauer af heterogenitet i mutationerne med mange mutationer er til stede i kun 5-10% af klonerne. Dette fund svarer til, hvad vi observeret i GGAP2. Androgenreceptoren spiller en central rolle i prostatakræft patogenese og overlevelse, så der er stærkt selektivt pres for at bevare mutationer, der fører til aktivitet over for anti-androgen terapier. Vi har vist, at GGAP2 ofte overudtrykkes i prostatacancer og kan aktivere to centrale veje i prostatakræft progression dvs. NFKB og AKT pathways. Desuden har det en forholdsvis stor negativ regulatorisk domæne, der kan være modtagelige for forstyrrelser, hvilket kan gøre det langt lettere at aktivere end nogle onkogener såsom RAS der kræver specifikke punktmutationer. Yderligere analyser vil være behov for at bestemme, i hvilket omfang andre gener, herunder tumorsuppressorgener og andre onkogener, har høj frekvens ikke-klonal missense eller stoppe mutationer.

Potentialet for høj frekvens nonclonal mutation tilføjer endnu et lag af kompleksitet til den komplekse mutations landskab af almindelige kræftformer, der er blevet afsløret af stor skala sekventering [19], [20], [21]. Af note, er det blevet vist, at nonclonal mutationer i K-RAS i lungekræft behandles med tyrosinkinaseinhibitorer signifikant indvirkning overlevelse [22]. Det vil således være vigtigt at fastslå, i hvilket omfang nonclonal mutationer forekommer på tværs af en bred vifte af gener i prostata og andre kræftformer, og om de påvirker overlevelse og respons på behandling.

Materialer og metoder

Humane vævsprøver

Normale zone og kræft væv perifere blev indsamlet med skriftligt informeret samtykke fra mænd, der gennemgår radikal prostatektomi ved Baylor College of Medicine Prostata Cancer Program Tissue Bank og lynfrosset som tidligere [23] beskrevet. Patienterne var i alderen fra 43-73 år og var overvejende kaukasisk. I alle tilfælde præoperativ billeddiagnostik og klinisk undersøgelse afslørede klinisk lokaliseret sygdom. Patologisk iscenesættelse af radikal prostatektomi prøver og bækken lymfeknuder viste ca. 30% etape 2 (T2N0); 50% Trin 3 (T3N0) og 20% ​​Etape 4 (Enhver T, N1). Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke til at donere væv til forskning og disse undersøgelser blev godkendt af Baylor College of Medicine Institutional Review Board. Godartede væv blev bekræftet at være fri for cancer og cancer væv indeholdt mindst 70% carcinoma. RNA’er og DNA’er blev ekstraheret som tidligere beskrevet [24], [25]. PSA recidiv blev defineret som serum PSA . 0,2 ng /ml, med tidlig recidiv være tilbagefald inden for 2 år efter kirurgi

Mutation analyse

N-terminale GTPase domæne og det C-terminale GAP domæne af GGAP2 genet blev amplificeret ved anvendelse af PCR og klonet ind i PCR 2.1 TOPO vektor ved anvendelse TOPO TA kloning kittet (Invitrogen). PCR blev udført under anvendelse af Platinum Taq (Invitrogen) for at minimere fejlinkorporering. Primere anvendt til kloning var: for GTPase domæne Fremad: CCGCTCCATTCCTGAACTG; Omvendt: GTTGCTGCTTGCGCAAG for GAP domæne: Fremad: CACAGACAGCCAAAGCGA; Omvendt: CCAAAAGCAGGAGAACGGTAG. DNA’er blev sekventeret i begge retninger og alle baseparændringer kaldes af maskinen læst af sekvensen blev bekræftet ved visuel undersøgelse af sekventering spor. Kloner med dårlig kvalitet sekventering spor blev ikke analyseret. Der blev ikke påvist nye rapporteringspligtige kimbane varianter.

mutagenese

enkelt nukleotid mutagenese blev udført i overensstemmelse med producentens protokol (Stratagene). Kort fortalt blev primere med de målmutationer anvendt i PCR til at generere GGAP2 ekspressionskonstrukter indeholdende 9 forskellige missense mutationer. Anvendte primere er vist i tabel 4. Dpn1enzyme blev tilsat til PCR-produkter i 1 time ved 37 ° C for at fordøje skabelon plasmid DNA før transformation. Kloner blev sekventeret for at verificere mutationerne.

Luciferase transkriptionel reporterassays

Luciferase transkriptionelle reporter assays blev udført som tidligere beskrevet [11] under anvendelse af 293T-celler. Både AP-1 luciferase reporter vektor og pRL Renilla Luciferase vektor blev opnået fra Stratagene (Cat # 219.077 og # E2810). PRL Renilla luciferasereporteren Vektorer er beregnet til brug som en intern kontrol reportere i kombination med AP-1 til cotransficere 293T-celler. Transient transfektion blev udført i triplikat i 24-brønds plader. Luciferaseaktivitet blev bestemt og normaliseret til Renilla luciferase signal for hver prøve. Uafhængige analyser blev udført fra 3-9 gange.

Statistisk analyse

For at sammenligne satserne for mutation mellem grupperne chi kvadratiske eller Fisher eksakt analyse blev udført. Luciferaseaktivitet af mutante kloner blev sammenlignet ved anvendelse af variansanalyse (ANOVA). For alle tests p 0,05 blev betragtet som signifikant

Tak

Bistand fra Patricia Castro er taknemmeligt anerkendt

..