PLoS ONE: Outlier Analyse Definerer Zink Finger Gene Family DNA-methylering i tumorer og spyt af hoved- og halscancer patienter

Abstrakt

hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) er den femte mest almindelige kræftform, årligt påvirker over en halv million mennesker verden over. I øjeblikket er der ingen accepterede biomarkører for klinisk påvisning og overvågning af HNSCC. I dette arbejde blev en omfattende genom-dækkende analyse af epigenetiske ændringer i de primære HNSCC tumorer anvendes i forbindelse med kræft-specifikke outlier statistik til at definere nye biomarkør gener, som er forskelligt methylerede i HNSCC. De 37 identificerede biomarkør kandidater var top-scoring outlier gener med fremtrædende forskellen methylering i tumorer, men med noget signal i normale væv. Disse formodede kandidater blev valideret i uafhængige HNSCC kohorter fra vores institution og TCGA (The Cancer Genome Atlas). Brug de øverste kandidater,

ZNF14

,

ZNF160

, og

ZNF420

, et assay blev udviklet til påvisning af HNSCC kræft i primære væv og spytprøver med 100% specificitet, når sammenlignet med normale kontrolprøver. I betragtning af den høje afsløring specificitet, kan analysen af ​​ZNF DNA methylering i kombination med andre DNA methylering biomarkører være nyttige i kliniske omgivelser for HNSCC detektion og overvågning, især hos patienter med høj risiko. Flere yderligere kandidater identificeret gennem dette arbejde kan blive undersøgt nærmere mod fremtidige udvikling af en multi-gen panel af biomarkører for overvågning og påvisning af HNSCC

Henvisning:. Gaykalova DA, Vatapalli R, Wei Y, Tsai HL, Wang H, Zhang C, et al. (2015) Outlier Analyse Definerer Zink Finger Gene Family DNA-methylering i tumorer og spyt af hoved- og halscancer patienter. PLoS ONE 10 (11): e0142148. doi: 10,1371 /journal.pone.0142148

Redaktør: Kwok-Wai Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 10. februar, 2015; Accepteret: 18 oktober 2015; Udgivet: November 6, 2015

Copyright: © 2015 Gaykalova et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Affymetrix Expression data . til rådighed i GEO33205 og Illumina Methylering data i GEO33202

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af National Institute of Dental og kraniofacial Forskning og National Institute of Health Challenge Grant (RC1DE020324); National Institute of Dental og kraniofacial Forskning og National Cancer Institute tilskud (P50 DE 019.032 hoved- og halscancer SPORE) til JAC. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) påvirker en anslået 60.000 personer i USA og 600.000 personer på verdensplan årligt [1, 2]. HNSCC skyldes sædvanligvis tobak og eksponering alkohol, såvel som af human papillomavirus (HPV) [1]. Trods fremskridt i forståelsen af ​​HNSCC biologi, omkring halvdelen af ​​alle patienter med HNSCC bukke under for sygdommen inden for fem år efter diagnosen [2-4].

Det er nu almindeligt observeret, at hel-genom hypometylering, ledsaget af gen-promotor-hypermethylering, er en generel egenskab ved faste tumorer [5, 6]. Promotor hypermethylering er blevet beskrevet for et omfattende antal gener, og almindeligvis resulterer i tumor-suppressor gen transkriptionel repression [3]. På grund af den høje DNA methylering abnormaliteter i kræftceller samt DNA methylering signal stabilitet under celledeling, påvisning af DNA methylering er et værdifuldt redskab i udviklingen af ​​biomarkører for kræft afsløring og prognose [7-9]. Adskillige hel-genom methylering assays er blevet udført for at definere DNA methylering underskrift HNSCC [5, 10-14]. DNA methylering af

DCC

,

EDNRB

,

DAPK

,

CCNA1

,

p16

,

HoxA9

og

er blevet detekteret KIF1A

gener i primære væv og biologiske væsker, herunder spyt og plasma [7, 10, 15, 16], der stammer fra HNSCC patienter. DNA methylering af flere andre gener, herunder

MINT31

,

MGMT

,

NID2

,

ERCC1

, og

TIMP3

, har blevet foreslået som biomarkører for HNSCC der kan påvises i en patients kropsvæsker [11, 16]. Andre gener, ligesom

CYGB

,

RASSF1A

,

SPARC

,

GSTM1

,

cyclinA1

,

MX1

,

WIF1

,

GNG7

,

CYP1A1

,

ZNF132

,

ZNF154

, og

ZNF447

har vist høje DNA methylering i primære HNSCC tumorer [13, 14, 16-23] og er kandidater til yderligere validering af detektion DNA methylering i kropsvæsker. Genom-dækkende identifikation af epigenetisk ændrede gener i HNSCC øger forståelsen af ​​mekanismerne i carcinogenese. Derudover kan disse tilgange afdække hidtil ukendte cancer-specifik DNA methylering begivenheder, der kan anvendes til molekylær påvisning strategier i kirurgiske margener eller legemsvæsker [7, 24-27].

Nylige data antyder, at detektion af promotor-methylering af

EDNRB

og

DCC

hos patienter med høj risiko orale læsioner har en lignende præstation i diagnose som ekspert klinisk evaluering [25]. Ikke desto mindre prøver at udnytte

DCC

og

EDNRB

promotor methylering er begrænset til 46% sensitivitet og 72% specificitet for kræft opdagelse i spyt skyller [25]. Mens lav følsomhed kan være begrænset af den få tilfælde af cancer-relaterede ændringer [11, 25, 28], lav specificitet anledning tekniske problemer. Selvom øge tærsklen for test opdagelse kan øge specificitet [10, 25], dette kræver yderligere cut-off værdi manipulationer, der ikke er praktisk i kliniske omgivelser. Derfor påvisning af nye DNA-markører med absolut specificitet til kræft væv kan forbedre de nuværende biomarkør paneler og øge potentialet kliniske anvendelse af molekylære detektion strategier [7, 24-26]. Lav følsomhed enkelte biomarkører, der er meget specifikke for kræft væv kan overvindes ved at kombinere flere meget specifikke gener i panelerne uden at ofre den samlede specificitet [11].

I betragtning af den omfattende karakter højkapacitetsmetoder, tusindvis af varierende kan detekteres methylerede regioner mens sammenligne tumor og normale prøver [10]. Den heterogenitet genetiske og epigenetiske ændringer i solide tumorer har fremlagt udfordringer i at bruge traditionelle statistiske metoder, såsom t-test eller signal-til-støj tests. Disse vanskeligheder kan minimeres ved anvendelse af outlier-baserede analyser for at tilvejebringe et mål for statistisk signifikans for heterogene forandringer i tumorer. Outlier-baseret analyse har givet en mekanisme til at definere væsentlige, men forskelligartede, ændringer i kræft. Standarden metode, der anvendes i kræftforskning for outlier analyse er Cancer Outlier Profil Analyse (COPA [29]), der sammenligner outliers til en empirisk null. For at eliminere lav signal outliers, dette arbejde implementeret COPA-baserede statistikker med en rang sum outlier tilgang samt fastsætte et minimumsniveau for udskrivelse af en outlier [30]. Dette er den første papir udnytte outlier analyse [30] for biomarkør opdagelse.

Materialer og metoder

Vævsprøver

Primære tumorvæv og matchede spyt skyl prøver blev indsamlet fra HNSCC patienter på Johns Hopkins Hospital efter informeret, blev opnået skriftlig tilladelse. Denne undersøgelse blev godkendt af Johns Hopkins Medicine Intern Review Board (JHM IRB) og udføres under forskningsprotokol NA_00036235. Samlet set blev der to uafhængige kohorter af HNSCC patientprøver og normale kontrolprøver anvendes. Alle forsøgspersoner, der deltog i denne undersøgelse blev de-identificeret efter den kliniske dataindsamling. Opdagelsen kohorte bestod af 44 primære HNSCC væv og 25 normale slimhinder prøver fra uvulopalatopharyngoplasty (UPPP) operationer af ikke-cancer påvirket kontrolpatienter fra tidligere publicerede undersøgelser [31-33]. Den uafhængige validering kohorte inkluderet primære tumorvæv og matchede spyt skyl prøver fra 59 HNSCC patienter, 31 normale UPPP vævsprøver og 35 spyt skyl prøver fra ikke-kræft patienter. Alle primært væv og kropsvæske prøver blev opbevaret ved -140 ° C indtil anvendelse. Alle primære vævsprøver blev analyseret af efterforskere fra Patologi Institut for Johns Hopkins Hospital (WHW og JAB). Tumorprøver blev bekræftet at være HNSCC og blev efterfølgende mikrodissekeres hvilket gav mindst 75% tumor renhed. Kliniske træk i de to kohorter er anført i S1 og S2 Tables. Fordelingen af ​​HNSCC undertyper i begge kohorter repræsenterer hele fordelingen af ​​hoved- og halscancer både i USA og på verdensplan, herunder ~ 30% af HPV-relaterede (HPV +) svælg SCC tilfælde. Gyldigheden af ​​denne opdagelse kohorte, og dets egnethed til flere analyser er blevet demonstreret i flere tidligere publikationer [31-34]. I et forsøg på at reducere fordomme og få robuste kræft upåvirket kontroller, blev patienterne kontrol tilfældigt udvalgt fra tilgængelige UPPP vævsprøver og spyt skylninger, men de kliniske karakteristika var ikke i stand til at blive matchet.

DNA forberedelse

Mikrodissekterede tumor vævsprøver eller 250 pi alikvoter af spytprøver blev fordøjet i 1% natriumdodecylsulfat (SDS) opløsning (Sigma) og 50 ug /ml proteinase K (Invitrogen) opløsning ved 48 ° C i 48-72 timer. DNA blev oprenset ved phenol-chloroform-ekstraktion og ethanoludfældning som beskrevet tidligere [35]. DNA blev resuspenderet i Lote puffer, og DNA-koncentrationen blev kvantificeret ved anvendelse af NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific).

RNA-præparat

RNA blev isoleret fra de Mikrodissekterede vævsprøver med Mirvana miRNA Isolation Kit ( Ambion) pr producentens anbefalinger, og RNA-koncentrationen blev kvantificeret ved hjælp af NanoDrop.

Arrays

Ti mikrogram RNA og DNA blev indgivet til Johns Hopkins Core Facility for kvalitetskontrol forespørgslen og prøve analyse af high-throughput arrays. Prøver blev kørt på Affymetrix HuEx1.0 GeneChips (indeholdende 1,4 millioner sonder) til udtryk analyse og Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChips (sondering 27,578 CpG-dinukleotider) for methylering analyse følgende bisulfit konvertering. Alle arrays blev kørt i henhold til producentens protokoller og dataene blev rapporteret tidligere [31-33]. Affymetrix Expression Data er tilgængelige i GEO33205 og Illumina Methylering data er tilgængelig i GEO33202. Begge datasæt er tilgængelige i GEO superSeries GSE33232. Data kan findes på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE33232.

HPV-analyse

Patologi rapporter om HPV status svælg SCC tumorer blev opnået fra Johns Hopkins Hospital Pathology Department. Desuden blev HPV status for alle svælg SCC primære tumorvæv uafhængigt bekræftet ved kvantitativ PCR (qPCR) under anvendelse HPV16 primere og prober på real-time PCR-maskine [7] i forhold til CaSki (ATCC) cellelinie, kendt for at have 600 kopier af HPV16 pr genom. Prøver med HPV kopi nummer ≥ 1 kopi /genom /celle blev identificeret som HPV positiv.

bisulfitbehandling og Bisulfite Genomisk sekventering

EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) blev anvendt til at omdanne umethylerede cytosiner i genomisk DNA til uracil. Bisulfit behandlede DNA blev amplificeret med primere designet ved hjælp MethPrimer [36, 37] (S3 tabel). Primerpar blev konstrueret i CpG øen omkring promotorregionen med nærheden til de methylering array-prober. Den repræsentative prøve fra opdagelsen kohorten blev udvalgt på grundlag af højeste forskelle i methylering og samtidig udtryk som beregnet under outlier analyse for hver enkelt gen. Bisulfit sekventering blev valgt til denne fase med henblik på at fastslå den absolutte (ikke relativ eller normaliseret) methylering status af flere CpG-dinukleotider i CpG ø nær promotor af hvert gen. Touch-down PCR blev udført [38]. PCR-produkterne blev oprenset ved anvendelse af QIAquick 96 PCR Purification Kit (Qiagen) og oprensede PCR-produkter blev sekventeret (Genewiz). Gene methylering status blev bestemt som en trichotomous variabel (umethyleret, hemimethyleret eller hypermethyleret) i henhold til rækkefølgen læser.

Kvantitative methylering-specifik PCR (QMSP)

For QMSP, primere var designet til at inkluderer specifikt CpG-dinukleotider, der viste ændringer i methylering som set af bisulfit sekventering. QMSP blev udført på real-time PCR-maskine med normalisering til umethyleret

β-actin

henvisning kontrol [39]. Taqman PCR-maskine blev sat på maksimal 38 cyklusser for at eliminere falske positive signaler. Bisulfit omdannet leukocyt DNA fra en sund person blev anvendt som en negativ kontrol. Det relative niveau af methyleret DNA i hver prøve blev bestemt som et forhold af det amplificerede gen til

β-actin

[40] og multipliceret med 100. Sekvenser af primerne og proberne anvendt kan findes i S3 tabel.

Reverse Transcription og kvantitativ Real Time PCR

Et ug RNA fra valideringen kohorten var omvendt transskriberet ved hjælp af High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. Kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse af genspecifikke ekspressionsassays (S3 tabel) og Universal PCR Master Mix på 7900HT real-time PCR-maskine (alle fra Applied Biosystems) ifølge producentens anbefalinger. Ekspression af genet af interesse blev kvantificeret i tre eksemplarer i forhold til

GAPDH

18S

udtryk ved hjælp af 2-ΔΔCT metoden [41].

Statistisk analyse

methylering data normalisering.

for methylering data promotor-, p værdier (andel af methylering) blev estimeret ud fra umethyleret (U) og methylerede (M) målinger på en sonde plan basis. estimater Gene niveau blev produceret ved at vælge den højeste methylering niveauer blandt alle sonder knyttet til det samme gen (14.477 gener i alt).

Betydelig kerne sonde beslutsomhed.

Gene udtryk data blev normaliseret med robust multi -array gennemsnit (RMA) analyse ved hjælp af BioConductor oligo pakke [42, 43]. Gene niveau estimater blev produceret af RMA hjælp de centrale sonder, hvilket giver 22,011 gener for analyse [31, 32].

Outlier Analysis.

Den standard metode, der anvendes i kræftforskning for outlier analyse er Cancer outlier Profil Analyse (COPA), som sammenligner vildskuddet udlodninger til en empirisk null genereret ved permutation af klasse etiketter [29]. En modificeret rang sum outlier tilgang, modificeret fra Ghosh [44], blev anvendt, hvor minimum ændre niveauer blev sat for definitionen af ​​en outlier [30]. This elimineret mange outliers, hvor ændring var ikke biologisk meningsfuld (fx methylering ændring på under 10% mellem to prøver). Disse statistikker blev anvendt til opdagelsen DNA-methylering datasæt indeholdende 14.477 gener for 44 tumorvæv, i hvilket signaler fra 25 normale prøver blev anvendt til at etablere basislinjen cut-off point for hvert gen. Venstre-hale og højre hale outliers blev bestemt ved hjælp af rang-sum-metoden [45]. Outlier scoringer blev beregnet for både højre-hale og venstre-hale sager, som tillod definitionen af ​​outliers, der blev hypermethyleret og hypomethylated på tumorer henholdsvis [30, 45]. Eftersom outlier analyse ikke har en score cut-off, blev en tærskel udvalgt for at give cirka 50 top-scorer gener. Denne score cut-off på 13,2 identificerede 37 topkandidater til yderligere validering (S4 tabel).

Expression-methylering korrelation.

Normaliseret genekspression data var korreleret med promoter methylering niveauer i methylering kandidater hjælp Spearman rang korrelation (tabel 1).

korrelation og overensstemmelsen mellem DNA-methylering Detection.

Korrelationer af ZNF DNA methylering signaler mellem primære tumorvæv og spyt skylninger (opdaget af QMSP assay ) blandt HNSCC patienter fra valideringen kohorten blev evalueret via Spearman s koefficient og kappa koefficient. Aftale konkordans blev beregnet under anvendelse kappa statistik.

sensitivitet og specificitet Kvantificering.

QMSP methylering værdier for spytprøver blev beregnet under anvendelse af en standardkurve fremgangsmåde og blev normaliseret til en methylering-uafhængig DNA ladningskontrol (

β-actin

). Methylering niveau af hvert gen blev behandlet som en binær variabel (methylerede vs. umethyleret) ved dichotomizing methylering ved DNA-detektion nul methylering af QMSP. Individer med en diagnose af HNSCC blev defineret som “forekomst af sygdom”, og “fravær af sygdom” emner blev defineret ved normale kontroller. Sandt positive, sande negative, falsk positive og falsk negative blev derefter bestemt for de enkelte gener. For kombinationen af ​​markører blev patienten klassificeret som “test positiv”, hvis nogen af ​​markørerne var positive, og “test negativ”, hvis alle markørerne var negative. Følsomhed blev estimeret som andelen af ​​patienter, der var test positiv blandt dem med sygdom, og specificitet blev vurderet som andelen af ​​patienter, der var test negativ blandt dem uden sygdom. De 95% konfidensinterval (CI) for sensitivitet og specificitet blev beregnet under antagelse binomialfordeling [46].

Resultater

Identifikation af differentielt methylerede gen outliers

Fra genom-dækkende differential DNA methylering analyse af 44 primære tumorer og 25 normale kontroller væv, blev biomarkør kandidater vælges baseret på ordningen vist i figur 1. på grundlag af antallet af afvigende prøver og den relative signal intensitet, 37 af de øverste rangerende kandidater blev valgt til yderligere analyse (S4 tabel). Korrelation af ekspression og methylering array-data tilladt for opdagelsen af ​​24 kandidatgener (ud af 37 oprindelige gener) med biologisk relevant negativ korrelation mellem DNA-methylering og genekspression (tabel 1). Især udviste alle 24 kandidatgener hypermethylering og reduceret ekspression i tumorprøver. Endvidere viste alle kandidater minimal DNA-methylering signal i normale væv, med maksimal middelværdi af β-værdi for normale prøver af 0,058 eller 6% methylering (S1 Fig og S5 Table). Standard t-test viste, at 23 ud af 24 gener (96%) havde statistisk signifikant forskel i DNA-methylering mellem normale og alle tumorprøver og mellem normale og HPV tumorprøver. Et gen,

CCND2

, ikke nåede statistisk signifikans er baseret på en t-test, men det gjorde demonstrere en forskel mellem tumor og normale prøver af en Fisher Exact test baseret på tilstedeværelsen af ​​hypermethyleret outliers i tumorprøver.

Skematisk oversigt over den integrerende fremgangsmåde brugt i dette studie, som kombinerer high-throughput screening af DNA-methylering og genekspression for opdagelsen kohorte HNSCC: beskæftigelse af methylering af DNA-array-data med 27,578 prober af total; normalisering af data i R, 14.477 gener i alt; outlier analyse og cut-off for at modtage cirka 50 top gener (13.2 outlier score, 37 højest rangerede gener bestået, se Metoder til detaljer); Integration af de normaliserede data fra ekspressionsassayet (22,011 gener); Spearman korrelationskoefficient beregninger (24 gener bestået); 7 ZNFs bisulfit sekventering validering; QRT-PCR, 5 ZNFs genekspression validering; Validering af tre ZNF QMSP detektering i spyt og tumor prøver i forskellige årgange.

Øget methylering og faldt genekspression ændringer i de HPV patienter

Det er kendt, at HPV + og HPV HNSCC sager er forskellige i deres landskab af genetiske og epigenetiske forandringer [5, 12, 47, 48]. Ved at adskille 44 HNSCC patienter efter HPV-status, blev det bestemt, at 92% (22 af 24) gener havde signifikant højere methylering i HPV HNSCC, sammenlignet med normale prøver (S5 Table). Kun 4% (1 af 24) kandidater havde DNA methylering i HPV + HNSCC prøver signifikant højere i forhold til normale prøver (S5 tabel). Hovedparten, 54% (13 af 24) gener havde signifikant højere methylering i HPV HNSCC, sammenlignet med HPV + prøver, i overensstemmelse med publicerede data [12]. Tumorprøverne havde et tilsvarende fald i kandidat-gen-ekspression (S1 Fig og S6 tabel). Således, 71% (17 af 24) gener viste en signifikant fald i genekspression i alle HNSCC prøver sammenlignet med normale prøver; 75% (18 af 24) gener viste et signifikant fald i genekspression i HPV prøver sammenlignet med normale prøver; og 21% (5 af 24) gener havde signifikant nedsat genekspression i HPV prøver sammenlignet med HPV + prøver. Den faldt genekspression i tumorprøver var i overensstemmelse med den overordnede øget promotor methylering i tumor prøver (S1 Fig og tabel 1).

Validering af promotor hypermethylering af kandidatgener

For at validere den differentierede methylering status for CpG-øer nær promotorregionen af ​​de 24 udvalgte kandidatgener blev bisulfit sekventering udført på 5 repræsentative prøver af normale mucosale prøver og 5 primære HNSCC tumorprøver fra den indledende opdagelse kohorte. Af de 24 gener, 22 (92%) viste øget methylering i tumorer i forhold til normale prøver (fig 2). Tyve kandidatgener (84%) viste methylering i mere end 50% af den primære tumor, herunder

ADFP

,

fuz

,

ZNF71

,

ENPP5

,

ZNF211

,

og ZNF14

(figur 2). Bisulfit sekventering data stærkt korreleret med resultaterne fra array-data, hvor minimal DNA-methylering blev påvist i normale prøver (S1 Fig og fig 2).

bisulfit sekventering resultater er vist i 5 HNSCC tumorprøver og 5 normale væv fra den oprindelige opdagelse kohorte for de 24 top-scorer kandidatgener (tabel 1). Skraverede sorte bokse repræsenterer helt denatureret initiativtagere, grå kasser repræsenterer hemimethyleret initiativtagere, og hvide bokse repræsenterer umethylerede initiativtagere.

zinkfingerprotein kandidater

Det blev bemærket, at 7 ud af 24 kandidatgener var medlemmer af Zinc Finger Protein (ZNF) gruppe, og yderligere analyse blev udført i denne gruppe. For at uddybe ZNF kandidater blev DNA methylering analyseret i en særskilt validering kohorte af 59 tumorer og 31 normale væv (S2 tabel). Brug af bisulfit sekventeringsmetoder, blev signifikant stigning i DNA-methylering i fem af de gener påvist i denne kohorte (S7 tabel). Men faldt DNA methylering af

ZNF141

promotor i valideringen kohorte modsagde opdagelse kohortedata, og blev der ikke DNA methylering påvist i

ZNF211

i prøver fra valideringen kohorte. Af alle resterende fem ZNF protein gener,

ZNF14

,

ZNF160

,

ZNF71

,

ZNF420

og

ZNF585B

, DNA methylering var signifikant højere i tumorprøver, sammenlignet med normale kontroller (S7 tabel).

ZNF nedregulering er forbundet med promoter methylering

for at validere den hypotese, at ekspressionen af ​​individuelle ZNF protein gener påvirkes af methylering af deres initiativtagere blev QRT-PCR-analyse efterfølgende udført for

ZNF14

,

ZNF71

,

ZNF160

,

ZNF420

og

ZNF585B

udtryk på prøverne fra en uafhængig validering kohorte (S2 fig). Alle men

ZNF71

viste signifikant nedregulering af udtryk i tumorprøver sammenlignet med normale væv, hvilket var i overensstemmelse med forhøjet methylering niveauer. Adskillelse af tumor prøver efter HPV tumor status viste, at ZNF udtryk ikke var signifikant forskellig i HPV og HPV + patientgrupper (S2 Fig og S7 tabel).

ZNF detektion DNA methylering er meget specifik for primære HNSCC væv

Baseret på DNA methylering resultater blev det antaget, at ZNF methylering potentielt kunne anvendes som en klinisk anvendelig biomarkør for HNSCC. Således blev QMSP primere og probe assays designet til

ZNF14

,

ZNF160

og

ZNF420

. En yderst specifik QMSP assay for

ZNF585B

ikke kunne udformes på grund af sin høje CpG densitet.

QMSP assays blev først valideret for alle tre ZNF gener i vævsprøver. Svarende til bisulfit sekventering resultater, har QMSP analyser ikke registrere DNA methylering i nogen normale prøver, men DNA-methylering blev påvist i

ZNF14

,

ZNF160

og

ZND420

i 44,1% , 39% og 32,2% af tumorer henholdsvis. Mindst én ZNF blev methyleret i 57,6% af tumorvæv. (Tabel 2). Især 17% af patienterne (10 af 59) havde methylering fundet på alle tre ZNF initiativtagere. Lidt højere DNA methylering blev set i HPV-gruppen, men forskellen var ikke statistisk signifikant (figur 3).

Vist er ZNF QMSP resultater i 59 HNSCC primær tumor og spyt skyl prøver sammenlignet med normalt plasma og spyt skyl prøver fra valideringen kohorte. ZNF promotor methylering blev kvantificeret i forhold til BACT methylering og ganget med 100. Plus (+) eller minus (-) henviser til deres HPV status kræftpatienter. NS = normal spyt skylning prøve (n = 35), N = normale primære væv (n = 31), TS = spyt skylning fra HNSCC patienter (n = 59, 41 af HPV + [TS +] og 18 i HPV [TS] ), T = primær tumor prøver fra HNSCC patienter (n = 59). Der var ingen påviselig ZNF DNA-methylering i normale prøver. Signifikant (p 0,05). Forskellen mellem grupperne er angivet med en stjerne (*), som beregnet af Fisher eksakt test

ZNF DNA methylering opdagelse i TCGA kohorte

for at validere ZNF DNA methylering og dens sammenhæng med udtryk i forskellige HNSCC kohorter blev Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip array og RNA-Seq data downloades og analyseres fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) HNSCC kohorte, som indeholder 279 HNSCC tumorer, herunder 36 HPV +, med matchede normale prøver. ZNF DNA methylering var minimal i TCGA normale prøver (S3 Fig og S10 tabel) efter aftale med opdagelsen og validering kohorte data. Alle tre ZNFs havde stærk negativ korrelation af DNA methylering og udtryk, især

ZNF420

(S3 Fig). Især ud af alle DNA methylering sonder til rådighed fra TCGA, sonder inden

ZNF420

promotor havde den højeste rate af DNA methylering i HNSCC prøver med minimal methylering påvisning i normale prøver. Samlet set har vi observeret en høj overensstemmelse mellem opdagelsen, validering og TCGA kohorter til påvisning af ZNF promotor methylering med fire forskellige teknikker til DNA methylering detektion (S9 tabel).

ZNF DNA methylering detektion som potentielle HNSCC biomarkører

for at teste effektiviteten af ​​de udviklede QMSP analyser til ZNFs til påvisning af DNA methylering i kropsvæsker, matchede spyt skyl prøver fra HNSCC validering kohorte patienter blev anvendt. Sammenligning af DNA-methylering signalerne i spyt skyl prøver af HNSCC og ikke-kræft patienter viste, at specificiteten af ​​den kombinerede ZNF panelet til påvisning HNSCC i disse kropsvæsker var 100% (95% CI: 89,9% – 100%), og den sensitivitet var 22% (95% CI: 12,3% – 34.73%) (tabel 3). Især har udforskningen af ​​ZNF methylering korrelation med kliniske data fra forskellige statistiske analyser ikke vist signifikante associationer.

Diskussion

På trods af udviklingen af ​​høje gennemløb teknologier og identifikation af lovende DNA methylering markører, har ingen HNSCC biomarkør i øjeblikket blevet godkendt til klinisk detektion og overvågning. Et centralt problem i nyligt foreslåede HNSCC biomarkører er den høje falsk-positive sats. Som HNSCC er en stærkt heterogen sygdom, er det udfordrende at definere en enkelt biomarkør med både høj sensitivitet og specificitet [10, 11, 25]. Mange foreslåede biomarkører har rimelig følsomhed, men relativt lav specificitet, og kombinationer af disse biomarkører vil sandsynligvis føre til øget hyppighed af falske positiver [25]. Anvendelse af traditionelle statistiske metoder kan undervurdere heterogene ændringer i malignitet; dog kan disse udfordringer overvindes ved hjælp nylig udviklet outlier analyse tilpasset fra COPA. Så vidt vi ved, er dette den første offentliggjorte arbejde, der udnytter outlier analyse for DNA methylering biomarkør udvikling. Mens ZNF gruppe af kandidater undersøgt i dette arbejde forudsat 100% specificitet, supplerende undersøgelser kan øge følsomheden ved at validere mere methylerede gen kandidater til udvikling af en multi-gen DNA methylering-baserede panel af HNSCC biomarkører.

Der er en række publikationer, der udnytter high throughput DNA-methylering analyse, men mange har begrænset kohorte størrelser [11-13]. Denne undersøgelse var i stand til at bruge en tidligere publiceret kohorte bestående af 44 tumor og 25 normale kontroller for opdagelsen af ​​potentielle denatureret biomarkører. Desuden blev biomarkører desuden valideret i en større selvstændig kohorte (med 59 tumorprøver) og i TCGA (279 tumorprøver). Brugen af ​​Illumina 27 DNA methylering array, der med succes har været anvendt af andre [10-14], tilladt for definitionen af ​​meget specifikke potentielle biomarkører for HNSCC. Det er dog erkendt, at mere omfattende DNA methylering platforme kan gøre det muligt opdagelsen af ​​større antal kandidat ændringer.

Korrelation af methylering og udtryk er et andet magtfuldt værktøj, der blev brugt i denne undersøgelse for at identificere biologisk relevante methylering ændringer, sandsynligvis forekomme tidligere i udviklingen af ​​kræft [10, 14]. Kun methylering forandringer, der sker tidligere i tumorudvikling vil give mulighed for udvikling af efterfølgende genekspression ændringer. DNA methylering ændringer, som ikke korrelerer med genekspression blev elimineret at definere en mere fokuseret panel af 24 kandidat methylerede gen biomarkører. Endvidere korrelation af DNA-methylering med ekspression fra tilgængelige genekspression arrayet hjælper til at reducere enkelt platform bias. Multiple validering trin blev udført i denne undersøgelse, som omfattede i alt tre kohorter af HNSCC prøver, samt fire forskellige metoder til påvisning DNA-methylering (Illumina arrays 27 og 450, bisulfit sekventering og QMSP) og tre forskellige teknikker til genekspression (Affymetrix array, RNA-Seq fra TCGA og QRT-PCR). Ensartede resultater blev observeret mellem forskellige kohorter og teknikker (S9 tabel). Disse validering trin bekræftet høj specificitet og pålidelighed af de detekterede ZNF DNA methylering-baserede biomarkører for HNSCC.

Højere niveauer af promotor methylering blev observeret i HPV patienter i flere formodede tumorsuppressorgener herunder Zink Finger familiemedlemmer, konsekvent