Abstrakt
Nul tyngdekraft forårsager flere ændringer i metaboliske og funktionelle aspekter af den menneskelige krop og eksperimenter i rumfart har vist ændringer i cancervækst og progression. Denne undersøgelse rapporterer genomet brede udtryk profilering af en colorektal cancer cellelinje-DLD-1, og en lymfoblast leukæmisk cellelinie-MOLT-4 efter simuleret vægtløshed i et forsøg på at forstå centrale processer og cellulære funktioner, der er dysreguleret blandt begge cellelinier . Ændret cellemorfologi, reduceret cellelevedygtighed og en afvigende cellecyklus profil i sammenligning med deres statiske kontroller blev observeret i begge cellelinier under vægtløshed. Processen med cellecyklus i DLD-1-celler blev mærkbart påvirket med reduceret levedygtighed, nedsat kolonidannende evne, en apoptotisk befolkning og dysregulering af cellecyklus gener, oncogener, og cancer progression og prognostiske markører. Mikromatrice analyse afslørede 1801 (opreguleres) og 2542 (nedreguleret) gener ( 2 gange) i DLD-1 kulturer under vægtløshed mens MOLT-4 kulturer differentielt udtrykt 349 (opreguleres) og 444 (nedreguleret) gener ( 2 gange) under vægtløshed. Tabet i celleproliferativ kapacitet blev bekræftet med nedregulering af cellecyklusprocessen som påvist ved funktionel gruppering af DNA microarray data ved hjælp gen ontologi vilkår. Genomet brede udtryk profil viste også signifikant dysregulering af post transkriptionel gen lyddæmpning maskiner og flere microRNA vært gener, der er potentielle tumorsuppressorer og proto-onkogener, herunder
MIR22HG
,
MIR17HG
MIR21HG
.
MIR22HG
, en tumor-suppressor gen var en af de højest opregulerede gener i microarray data, der viser en 4,4 log fold opregulering under vægtløshed. Real time PCR valideret dysregulation i værten genet ved at demonstrere en 4,18 log fold opregulering af miR-22 microRNA. Microarray data viste også dysregulering af direkte mål for miR-22,
SP1
,
CDK6
CCNA2
Henvisning:. Vidyasekar P, Shyamsunder P , Arun R, Santhakumar R, Kapadia NK, Kumar R, et al. (2015) Genom Bred Expression Profilering af kræft cellelinier dyrket i Microgravity afslører Betydelig dysregulering af Cell Cycle og miRNA Gene Networks. PLoS ONE 10 (8): e0135958. doi: 10,1371 /journal.pone.0135958
Redaktør: Zheng Li, Peking Union Medical College Hospital, KINA
Modtaget: Februar 26, 2015; Accepteret: 28 Juli 2015; Udgivet: 21 August, 2015
Copyright: © 2015 Vidyasekar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Defense Research Development Organization (DLS /81/48222 /LSRB-189 /id /2009 og DLS /81/48222 /LSRB- 273 /SH DD /2013) til RSV. url: https://www.drdo.gov.in/drdo/boards/lsrb/fplsrb.htm
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Microgravity på rumflyvninger har vist sig at påvirke fysiologien af en celle betydeligt [1]. Normal tyngdekraft (1 g) påvirker 2-Dimensional kultur ved aflejring celler på overfladen af vævskulturpladen (TCP) hvor forankringsafhængige celler klæber og prolifererer som et monolag med meget begrænset celle-celle interaktioner. Vægtløshed og reduceret acceleration (mindre end 1 g) i rummet, fjerner virkningen af tyngdekraften, så cellekulturer i rummet til at have uhindret bevægelse af dyrkningsmediet, en forskydning frit miljø og, som cellerne ikke er bundet af nogen retningsbestemt kraft, ubegrænset bevægelse af celler i mediet. Under sådanne betingelser celler tendens til at flyde sammen og danne aggregater skaber tredimensionelle (3D) miljøer, hvor de interagerer på flere planer [2]. Effekten af reduceret tyngdekraft er ikke begrænset til ændringer i dyrkningsbetingelser som den unikke miljø kan producere ændringer i den grundlæggende fysiologi af cellen. Mens virkningsmekanismen for hvordan tyngdekraften, eller mangel på samme, påvirker molekylære og cellulære funktioner er stadig uklart, er det blevet fastslået, at vægtløshed eller nul tyngdekraft påvirker vitale processer i cellen og vigtigere er det, vægtløshed vist påvirkning cancervækst og progression [3-5]. Men forskellige kræftformer reagerer forskelligt på vægtløshed ved at miste eller forbedre cellulære processer og funktioner. I denne undersøgelse dyrkes vi cellelinjer repræsenterer faste og hæmatologiske tumorer-DLD-1, MOLT-4 og HL-60 i en roterende cellekultursystem (RCCS), som simuleret vægtløshed. Den RCCS er et mekanisk system, der simulerer reduceret tyngdekraft på jorden ved at annullere den retningsbestemte vektor gennem konstant rotation af en High Aspect Ratio Vessel (HARV). Dette opretholder celler i en konstant frit fald og en forskydningshastighed frit miljø tillader celler at vokse sammen og danne 3D aggregater [2]. Disse aggregater er fastholdt i frit fald og erfaring betingelser med reduceret tyngdekraft i den resterende del af dyrkningsperioden. Vi antager, at fysiologiske ændringer af cellefunktioner såsom celleproliferation og levedygtighed kunne bekræftes med ændringer i de grundlæggende processer i cellen, såsom genekspression. At relatere fysiologiske ændringer såsom en ændret cellecyklus Profilen med dysregulering af genekspression, blev real time PCR-analyse for cellecyklus gener, onkogener og cancerudvikling og progression markører gennemføres. Genom ekspression profilering ved mikromatrice af disse cellelinier dyrket under vægtløshed afslørede dysregulering af flere veje i cancer og vigtigst underbygges med observerede fysiologiske ændringer i cellen. Vi brugte også genekspressionsprofilen at undersøge dysregulation i veje centrale til kræft såsom Notch signalsystem og dysregulation i post transkriptionel gendæmpning maskiner. Genekspressionsprofilen afslørede også dysregulering af microRNA værtsgener i vægtløshed herunder betydelige tumor suppressor, MIR-22 i DLD-1.
Materialer og metoder
Cellekultur
DLD-1 er en epitelcelle, adhærerende cellelinje afledt af en colorektal adenocarcinom (Dukes type C). MOLT-4 er en T lymfoblast, suspension cellelinie afledt af en akut lymfoblastisk leukæmi, mens HL-60 cellelinien er en promyeloblast afledt af akut promyelocytisk leukæmi. Cellelinjer blev indkøbt fra det nationale center for celle videnskab, Pune, Indien og blev opretholdt i DMEM-F12 (DLD-1) eller RPMI1640 (MOLT-4, HL-60) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Life Technologies, USA) ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 inkubator i 25 mm
3 vævskulturplader (TCP) og i 10ml
3 højdimensionsforhold fartøjer (harv) i en roterende cellekultursystem (RCCS). Cellelinierne blev indført i 10 ml HARV gennem 5 ml sprøjter og en rotationshastighed på 27 omdrejninger i minuttet (RPM) blev standardiseret baseret på aggregeringen af DLD-1 celler indlæst ved 0,5 x 10
6 celler inden 24 til 48 timer . Celler blev dyrket i HARV i højst 72 timer med yderligere medium injiceres i HARV hver 16 til 24 timer for at forhindre skumdannelse eller luftbobler. Indholdet af HARV blev overført til 60mm TCP, uden at ophæve celle aggregater, til rutinemæssig mikrografisk observation og andre cellebaserede assays ved hjælp af 10 ml pipetter. 0,25% trypsin-EDTA blev anvendt til dissociation af celleaggregater og monolagskulturer når det er påkrævet.
Total RNA-ekstraktion og cDNA konvertering
Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af RNeasy kittet (Qiagen, Tyskland) . 2 × 10
6 celler blev centrifugeret og vasket to gange med PBS. RNA blev isoleret fra disse celler i henhold til fabrikantens anvisninger. 1,5 ug totalt RNA blev omdannet til cDNA under anvendelse af MMLV-RT (Thermo Scientific, USA) og Oligo-dT-primere (NEB, USA). miRNA omdannelse til cDNA blev udført ved anvendelse af hårnåle-revers transkriptase (RT) -primere uden dithiothreitol (DTT) og RNA denatureringstrin til at opretholde integriteten af hårnåle-primer.
microarray analyse
Microarray analyse blev udført med RNA-prøver fra DLD-1 og MOLT-4 cellelinjer dyrket under vægtløshed og under statiske forhold i gentagelser. Expression data for hver prøve blev opnået på Affymetrix GeneChip menneskelige Primeview Array. Hybridisering blev udført i en varighed på 16 timer ved 60 rpm ved 48 ° C og scannes på GeneChip microarray Scanner 3000 7G. Rå data blev ekstraheret efter scanning af dias og rå datasæt blev analyseret ved hjælp GeneSpring GX 12.6 software efterfulgt af differential genekspression (DE), fold forandring klyngeanalyse.
Gene ontologi analyse
DE gener blev undersøgt for deres overflod i forskellige Gene ontologi (GO) vilkår samt veje ved hjælp af microarray analyse software DAVID (The Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery) [6]. To værktøjer i DAVID-programmet blev brugt, gen funktionel klassificering værktøjet og funktionelle annotation clustering værktøj. Den DAVID funktionelle annotation værktøj blev brugt til at fremhæve relevante GO vilkår forbundet med det indsendte gen listen ved at gruppere lignende, redundante, og heterogene anmærkning indhold fra den samme eller forskellige ressourcer i annotation grupper baseret på den hypotese, at lignende anmærkninger skal have lignende gen medlemmer. Gene berigelse er baseret på sæt af indgivne gener, der er stærkt forbundet med visse udtryk, som er statistisk målt ved Fisher Exact i DAVID system. I denne undersøgelse, brugte vi gruppen berigelse score, som er det geometriske gennemsnit af alle p-værdier for de enkelte medlemmer i en tilsvarende anmærkning klynge. En højere score indikerer en højt beriget klynge, der igen giver den biologiske betydning af klyngen på listen.
Fast time PCR forstærkning
Real time PCR blev udført ved hjælp af SYBR grøn Real time PCR kit fra Qiagen på en Eppendorf Mastercycler, ep realplex (Eppendorf, Tyskland). Relativ mRNA-ekspression blev bestemt ved normalisering til ekspressionen af et housekeeping-gen, beta-actin og U6 til microRNA genekspression. Primer liste i S1 tabel.
Western blotting
Celler blev lyseret med Radio Immuno Nedbør Assay (RIPA) buffer, blandet med Laemmli prøve buffer (1 ×) og kogt. Proteiner blev underkastet 12% SDS-PAGE og elektroblottet på BioRad, 0,22 uM nitrocellulosemembran (BioRad Laboratories, USA). Membranen blev blokeret med Tris-bufret saltvand plus 0,2% Tween 20 (TBS-T) indeholdende 3% BSA (Sigma-Aldrich, USA) efterfulgt af primære antistof inkubering natten over og vask med TBS-T puffer. Sekundært antistof (anti-muse, HRP-konjugat, 1: 10000 Sigma Aldrich USA) fortyndet i blokeringspuffer blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur og vasket igen med TBS-T. Antistof-reaktive proteiner blev opdaget ved hjælp af forøget kemiluminescens, Amersham ECL Plus western blotting afsløring reagenser (GE Healthcare, UK). Antistof-oplysninger findes i S1 tabel.
Flowcytometri for cellecyklusanalyse
Cellerne blev høstet og vasket i PBS før fiksering i koldt 70% ethanol, som blev tilsat dråbevis til pelleten, mens vortexing. Celler blev fikseret i 30 min ved 4 ° C. Fikserede celler blev vasket to gange i PBS og centrifugeret ved 250 g i en centrifuge. Celler blev inkuberet med 50 pi af en 100 ug /ml stamopløsning af RNase og 200 pi propidiumiodid (fra 50 ug /ml stamopløsning). A BD FACSCalibur (USA) flowcytometer blev anvendt til at analysere cellepopulationen for cellecyklus ændringer.
CFU- assay Salg
Celler blev dyrket i methylcellulose ved 10X af slutkoncentration (0,3 ml celler til 3 ml Methylcellulose). Rør blev hvirvlet for at sikre celler og komponenter blev blandet grundigt. Methyl cellulose blev dispenseret ved hjælp af en 3 ml sprøjte og jævnt fordelt i skålen ved forsigtig hvirvlende. Kulturer blev inkuberet ved 37 ° C, 5% CO2 i luft og ≥95% fugtighed. Kolonier blev derefter farvet med krystalviolet (0,5 mg /ml i 1% methanol) i 20 minutter og lufttørret efter vask i destilleret vand. Farvede kolonier blev visualiseret under et Nikon Eclipse Ti fasekontrastmikroskop.
Statistisk analyse
Alle eksperimenter blev udført i replikater og resultater blev udtrykt som middel ± S.D. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af student t-test med Prism 5-programmet (GraphPad software, USA).
Resultater og Diskussion
Kultur af celler i vægtløshed
Tilgængelighed af en overflade til at klæbe til celler på TCP er et incitament for vækst for adhærente celler såsom DLD-1 og derfor statiske kulturer i TCP var sammenflydende (fig 1A). Langsomme omdrejninger i minuttet (RPM) af HARV (16 RPM, Fig 1B) ikke lade cellerne vokse sammen, men celler kunne danne aggregater ved 27 RPM (Fig 1C). Farvning med AO /EB viste ingen celledød i statiske TCP kulturer (Fig 1D), men afslørede celledød i vægtløshed kulturer af DLD1 ved 16 RPM (Fig 1E). Cellernes levedygtighed blev forbedret, når celler aggregeres på 27 RPM (Fig 1F). Når disse celle aggregater blev enzymatisk dissocieret og dyrket i et TCP efter 48 timer i vægtløshed, celler tog 48 timer til at klæbe (Fig 1G, dag 2), mens celler fra statiske kulturer overholdes indenfor 24 timer (Fig 1G, Dag 1) og produceret sammenflydende kulturer ved dag 4. Microgravity har vist sig at påvirke flere cellefunktioner [7] og ekspressionen eller funktionen af celleadhæsionsmolekyler kunne påvirkes [8] reducere antallet af DLD-1-celler, der kunne holde sig til TCP. Når sådanne celleaggregater blev udpladet i TCP uden enzymatisk dissociation, blev morfologien af DLD-1-celler ændret (fig 1H og 1I). Crystal violet farvning af celler dyrket i statisk monolagskultur viser den typiske morfologi af DLD-1-celler (fig 1H), mens celleaggregater antager en vækstmønster ligner en eksplantat kultur og perifere celler indeholdt en stor cytoplasmaet og kernen (figur 1I). Det udvidede celle måske på grund af de cytoskeletale ændringer i løbet af vækst i vægtløshed [9] eller celler, der har mistet kontrollen over cellecyklussen, kan ophobes pre-mitotisk protein i cytoplasmaet med polyploidi i kernen [9] vokser i størrelse. En kolonidannende assay (CFA) på DLD-1 kulturer i vægtløshed flyttet til statisk TCP efter enzymatisk dissociation (fig 1J og 1K) afslørede reduceret potentiale for DLD-1 celler til at danne kolonier (Fig 1k) sammenlignet med statiske celler (Fig 1J). Den reducerede proliferative kapacitet af kulturer i vægtløshed blev bekræftet af en celleviabilitetstest hjælp MTT. Statiske kulturer var 41% mere levedygtige end 27 RPM kulturer og 75% mere levedygtige end 16 RPM kulturer i vægtløshed (Fig 2A). Når disse resultater er taget sammen, synes vægtløshed væsentligt påvirker levedygtigheden og spredning af DLD-1 celler. Flowcytometrianalyse af PI indlæst DLD-1 celler dyrket under vægtløshed blev sammenlignet med cellecyklus profil af kulturer i statisk TCP og statisk suspension på agar underlag (fig 2B, 2C og 2D). Fra mangel på forankring, statiske suspension cellekulturer på agar også aggregere ligner RCCS imidlertid simulering af vægtløshed er fraværende. DLD-1 kulturer i vægtløshed havde en væsentlig population af celler i sub G0 fase, selv om en stor population af celler stadig var levedygtige i vægtløshed (fig 2C). Statisk monolag, TCP kulturer var helt levedygtige (Fig 2B) og væsentligt, gjorde de statiske suspensionskulturer ikke demonstrere en sub G0 fase og havde profil ligner den statiske kontrol (Fig 2D). Fig 2E viser den gennemsnitlige sub G0 fase befolkning på tværs af de tre dyrkningsbetingelser i replikater af cellecyklus analyse, som bekræftede, at reduceret levedygtighed var en eksklusiv effekt af vægtløshed i DLD-1 celle aggregater. Den MOLT-4-cellelinje vokser som en suspension kultur og det ikke sammenlægge positivt i vægtløshed ved høje eller lave omdrejninger, som viser de enkelte celler i HARV (Fig 2F, 16 RPM HARV). Imidlertid blev cellelevedygtighed reduceret med 20% sammenlignet med den statiske kontrol i både rpm ved 48 timer (fig 2G), som korrelerede med reducerede celleantal ved mikroskopisk observation efter 48 timer (fig 2F, 16 RPM Harv). Flowcytometri opdaget en lille apoptotisk befolkning (Sub G0 fase) i cellecyklus analyse af MOLT-4 kulturer i vægtløshed ved 16 RPM (Fig 2H og 2I)
A DLD-1 cellekulturer.; Statisk kultur (kontrol) B DLD-1 Microgravity kultur ved 16 RPM C DLD-1 Microgravity kultur på 27RPM Differential farvning at opdage apoptotisk population D DLD-1Static monolagskulturer E Vægtløshed kulturer af DLD1 på 16 RPM F Vægtløshed kulturer af DLD1 på 27 RPM G Cell vedhæftning og spredning assay Top panel-statiske kulturer, nederste panel-vægtløshed kulturer flyttet til statiske TCP H Morfologiske ændringer i DLD-1; Crystal violet farvning af DLD-1 celler i statisk monolagskultur I Crystal violet farvning af DLD-1 celler efter overførsel af celle aggregater fra vægtløshed til TCP J Colony danner evne assay; Statiske kulturer K Kolonidannelseseffektivitet evne assay; DLD-1 celler efter overførsel af celle aggregater fra vægtløshed til TCP
En celle levedygtighed assay for DLD-1 celler; Levedygtighed målt for vægtløshed kulturer (16 RPM og 27 RPM) og statiske kulturer ved hjælp MTT B-celle cyklus analyse for DLD-1 celler; Statisk C Cell cyklus analyse; Vægtløshed D Cell cyklus analyse; Statiske suspensioner på agar underlag E Den gennemsnitlige sub G0 befolkning i replikater af cellecyklus analysemetoder til vægtløshed, statisk og statiske suspensionskulturer af DLD-1 celler F MOLT-4 cellekultur Statiske og Vægtløshed kulturer af MOLT-4 G Cell levedygtighed assay Levedygtighed målt for vægtløshed kulturer (16 RPM og 27 RPM) og statiske kulturer ved hjælp MTT H Cell cyklus analyse; Statisk Jeg Cell cyklus analyse; Vægtløshed kulturer af MOLT-4.
Real Time PCR for genekspression analyse
For at påvirke centrale processer for kræft, såsom celledeling og cellecyklus, skal vægtløshed væsentligt påvirke grundlæggende funktioner den celle, såsom genekspression. Vi målte mRNA-niveauerne af væsentlige gener involveret i cellecyklus og cancer progression at kontrollere for deres fejlregulering under vægtløshed. Cyclin genekspressionsniveauer væsentlig indflydelse cancer progression og metastase, da de kan dirigere celleproliferation eller apoptose. Cdk er afgørende for G1 /S og G2 /M faseovergange af cellecyklus og deres dysreguleret genekspression kan påvirke progression af cellecyklus. Den transskription af
er CDK1
reguleres sådan, at det fungerer under den mitotiske profase og metafase [10].
CDK1
udtryk blev nedreguleret i MOLT-4 og opreguleret i DLD-1 (5 gange over statisk kontrol) (figur 3A). Ekspressionen af gener grundlæggende til kræft udviklingen og progressionen, som omfatter onkogener og potentielle cancer stamcellemarkører blev dysreguleret i vægtløshed.
CD117
(receptortyrosinkinase-c-kit) ekspression blev opreguleret med 11,2 gange i MOLT-4 og nedreguleres med 0,2 fold i DLD-1 under vægtløshed (Fig 3A). Høj c-kit-ekspression beskytter coloncarcinomaceller mod apoptose og øger deres invasive potentiale [11]; derfor kan c-kit nedregulering i DLD-1 under vægtløshed være betydelige. DLD-1 konstitutivt løbet udtrykker
MYC
gen [12] under normale forhold. Overekspression af
MYC
sensibiliserer celler til apoptose og under vægtløshed
MYC
genekspression blev yderligere forøget i DLD-1 med 3 gange (figur 3A). MOLT4 udtrykt sænket niveauer af
MYC
(0,4 gange) i vægtløshed (Fig 3A).
JunB
koder en transkriptionel regulator af celleproliferation gener og er en del af den umiddelbare tidlige gen familie [13]. En af de mest betydningsfulde gener, der skal dysreguleret i begge cellelinier i vægtløshed,
JunB
opreguleres i vægtløshed med 2,1 og 1,2 fold i MOLT-4 og DLD-1 (fig 3A).
En
CDK1
-Cell cyklus-genet,
CD117
-proto-onkogen,
JunB
-transcription faktor og umiddelbar tidlig gen,
MYC
-proto-onkogen ekspression i DLD-1 og MOLT-4 B Real time PCR-analyse i HL-60
CCNE1
og
CDK2
,
CCNB1
CDK1
, Onkogener:.
CD117
og
MYC
, Cancer prognostiske markører
CD105
,
CD90
CD71
genekspressionsanalyse i HL-60, en promyelocytleukæmi cellelinje
Som en ekstra kontrol for blod tumor (og suspension) kulturer, vi kontrollerede genekspressionsniveauer af cellecyklus gener og onkogener i en promyelocytisk leukæmi cellelinje, HL-60. Real time PCR afslørede op regulering af
CCNE1
og
CDK2
i Harv kulturer med
CDK2
være betydeligt opreguleret (1,1 og 1,8 fold henholdsvis) (Fig 3B) .
CCNB1
CDK1
genekspression blev dysreguleret med
CDK1
bliver op reguleret 1,5 gange og
CCNB1
nedreguleret med 0,8 gange (figur 3B). Betydeligt, de proto-onkogener
CD117
og
MYC
var meget op reguleret i vægtløshed med 4,7 gange og 10,8 fold (fig 3B). Svarende til DLD-1-cellelinien, HL-60 også i løbet udtrykker
MYC
gen konstitutivt under standardbetingelser. De prognostiske markører
CD71
,
CD105
CD90
blev dysreguleret under vægtløshed med 0,75 gange (nedreguleret), 1,4 gange (opreguleres) og 2,1 gange (opreguleret) henholdsvis ( fig 3B). Endoglin (
CD105)
hjælpemidler neovaskularisering i kræft [14] og
CD90
udtryk indikerer en positiv prognose som leukæmiske stamceller i AML, der er i stand til at opretholde sygdommen in vitro og in vivo ikke gør udtrykker CD90 [15]. Real time PCR-analyse af en kandidat cellecyklus, onkogen, transskription faktor og kræft progression markør viste både opregulering og nedregulering. Som cellecyklus reguleres af en lang række faktorer, hvoraf mange kunne blive påvirket af vægtløshed, en ‘kollektiv’ nedregulering eller dysregulering af processer i forbindelse med cellecyklus kunne validere observerede fysiologiske stop eller reduktion i celledeling under vægtløshed. Hen imod dette mål, blev et genom bred ekspressionsprofil hjælp mikromatrice udført. Den genomiske profilering også tilladt os at spekulere på effekten af vægtløshed på centrale veje i kræft såsom Notch signalsystem, og ekspressionsniveauerne af nye regulatorer såsom microRNA.
Microarray analyse af DLD-1 og MOLT- 4 celler dyrket i vægtløshed
Microarray analyse viste 1801 og 2542 gener op og ned reguleres mere end to gange i DLD-1 celler dyrket i vægtløshed i forhold til statisk kontrol. MOLT-4-kulturer under vægtløshed differentielt udtrykt i alt 349 og 444 gener op og ned reguleret over 2 gange. Tabel 1 viser en kort liste over almindelige gener dereguleret blandt begge cellelinier. En komplet liste over højt deregulerede gener blandt begge cellelinier findes i S2, S3 og S4 Tables. De stærkt dysreguleret gener repræsenteret i de understøttende information tabeller indeholder interessante kandidatgener såsom ribonukleotidreduktase M2 (
RRM2
) underenhed, som er den mest nedreguleres gen i DLD-1 under vægtløshed. RRM2 overekspression kan være forbundet med Colo Rektal cancer (CRC) progression, og kan spille en vigtig rolle i infiltration og metastase af CRC [16]. Det tjener som en prognostisk biomarkør og forudser dårlig overlevelse tarmkræft [17]. Mens begge cellelinier udviste ændringer i cellecyklus og cellelevedygtighed, vægtløshed fremkaldte en større respons fra den faste tumorcellelinie DLD-1. Sub dødelig stress kan skubbe en celle i en tilstand, der ligner replikativ senescens [18]. Stressinduceret præmatur aldring (SIPS) kan forekomme efter DNA beskadigelse, oxidativt stress og behandling med histondeacetylaseinhibitorer [18]. Fænomenet SIPS kan forklare tabet i cellelevedygtighed i begge cellelinier. Microarray analyse afslørede nedregulering af retinoblastomgenet (
RB1
; -0,42 log fold ændring) i DLD-1-celler under vægtløshed og som tilstedeværelsen af RB1-proteinet er nødvendig for SIPS [19], reaktion DLD-1 celler til vægtløshed kan ikke være gennem SIPS og dens relaterede veje. Omvendt MOLT-4-celler viser opreguleret RB1 udtryk (0,47 log fold ændring) under vægtløshed og tabet i celle levedygtighed kan tilskrives SIPS. Dette kan også forklare den forholdsvis mindre antal af gener, som blev differentielt udtrykt i MOLT-4-celler sammenlignet med genekspressionsprofilen af DLD-1-celler under vægtløshed. Andre biomarkører for SIPS, apolipoprotein J og fibronectin, som er overudtrykt i replikativ senescens og SIPS [19], blev ikke udtrykkes forskelligt i DLD-1 eller MOLT-4 under vægtløshed. Mekanismen af SIPS ikke klart forstået endnu, og om vægtløshed kan være en udløsende faktor for SIPS veje skal bekræftes. De data, der behandles i denne publikation er deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus og er tilgængelige via GEO Series tiltrædelse nummer GSE69271 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69271) . De differentielt udtrykte gener fra microarray data blev undersøgt for deres overflod i forskellige Gene ontologi (GO) vilkår samt veje ved hjælp af microarray analyse software DAVID. Den berigelse score på de enkelte GO vilkår, at generne forbundet med blev brugt til at identificere processer, der var betydeligt dysreguleret. GO eller funktionelle berigelse analyse blev udført med over 2 fold-differentielt udtrykte gener i begge cellelinier. Funktionel klassifikation af gener baseret på lighed i funktion eller familie blev udført.
Validering af kandidatgener udvalgt fra microarray data
Microarray analyse viste opregulering af
CCNB1
og nedregulering af
ROMO1
HES1
gener når MOLT-4-celler blev dyrket under vægtløshed (fig 4A). Ligeledes microarray analyse viste nedregulering af
CDK2
genet og opregulering af
STAT3
HEY1
gener i DLD-1 celler dyrket under vægtløshed (Fig 4B). Microarray analyse afslørede, at begge cellelinier almindeligt viste nedregulering af
CCNE1
og opregulering af
CD71
CD44
gener (Fig 4C, Fig 5A). Betydeligt, dereguleringen af microRNA-22 host gen og dens mål var også under vægtløshed (Fig 5B). mRNA-ekspression af disse kandidatgener repræsentative for cellecyklus, transkriptionel regulering og cancer progression blev valideret ved kvantitativ realtids-PCR. Cyclin B1, som er indberettet som konstitutivt overudtrykt i humane kolorektal kræft [20] er over udtrykt i MOLT-4 celler, som viste en 7,5 gange forøgelse af
CCNB1
mRNA ekspression under vægtløshed (Fig 4A). Sænket ekspression af
ROMO1
fører til hæmning af cellevækst [21] og MOLT-4-celler udtrykte 0,5 gange mindre
ROMO1
end det statiske kontrol (Fig 4A). Transkriptionel og replikation controllere regulere onkogener og prognostiske markører og indflydelse cellecyklus begivenheder.
HES1
er en transkriptionel repressor og er involveret i DNA-reparation [22] og
HES1
genekspression styres af Notch og Jun signalsystemet [23].
HES1
genekspression nedreguleret med 0,7 gange i MOLT-4 (Fig 4A) under vægtløshed.
CDK2
genekspression i DLD-1 celler var 0,5 gange lavere i forhold til statisk kontrol (Fig 4B), mens
HEY1
, en transkriptionel regulator var stærkt op reguleret med 10,3 gange (figur 4B). Signal transducer og aktivator af transkription 3 (
STAT3
) er et onkogent transkriptionsfaktor som aktiveres og udtrykkes afvigende i mange kolorektale cancere [24] og gener opregulering valideres ved RT-PCR (figur 4B). Cyclin E1-genekspression nedreguleres i begge cellelinier under vægtløshed (Fig 4C). Cyclin E1 styrer progressionen af cellecyklussen gennem G1-fasen ved dets interaktion med cyclin-afhængig kinase 2 [25]. Ligeledes udtrykte begge cellelinier sænkede niveauer af
CD71
, som koder for et transmembrant glycoprotein, der er ansvarlig for cellulær jernoptagelse (Fig 4C). DLD-1 udtrykt signifikant lavere niveauer (0,42 gange) i vægtløshed. Højere udtryk for
CD71
er forbundet med negative prognose for mange solide tumorer og nogle lymfomer [26,27], og talrige undersøgelser har fundet en positiv sammenhæng mellem jern opbevaring og risikoen for tumorer, såsom i kolorektal cancer [28 ]. Betydeligt,
CD44
genet blev opreguleret i begge cellelinier (figur 4C, fig 5A). Mens de fleste isoformer af
CD44
er forbundet med den maligne form af sygdommen, nogle former for
CD44
forhindre tumorceller i at sprede ud af det primære sted [29]. Som
CD44
udtrykkes i både kolon og lymfoide kræft og da mRNA analyse ville indebære flere varianter, vi undersøgte sine protein niveauer i DLD-1 og MOLT-4 kulturer i vægtløshed. Western blotting for standard isoform af
CD44
viser højere niveauer af proteinet i begge cellelinier end statisk kontrol (Fig 5A). Densitometrisk analyse af bands og normalisering med p-actin værdier viser signifikant opregulering af
CD44
protein i vægtløshed. microRNA er blevet identificeret som potentielle onkogener eller tumor undertrykkere [30]. MIR-22 host-genet,
MIR22HG
var stærkt opreguleret i DLD-1 (Log fold 4.4), men ikke udtrykkes forskelligt i MOLT-4 (fig 5B). MIR-22 fungerer som en tumorsuppressor ved post-transkriptionel regulering af p21 til at bestemme celleskæbne [31]. Det undertrykker cancer progression ved at inducere cellulær aldring [32] og styrer EVI-1 onkogen ekspression i metastatiske brystkræftceller [33]. Nogle mål for miR-22, såsom
SP1
,
CDK6
CCNA2
blev også signifikant nedreguleret (Fig 5B), mens andre, såsom p21 (
CDKN1A
) blev ikke signifikant dysreguleret. Den farnesoid X receptor regulerer miR-22, der er rettet mod
CCNA2
i colon og lever kræftceller [34]. Real time PCR for miR-22 microRNA viste også en 4,18 log fold opregulering i DLD-1 celler under vægtløshed (Fig 5B) bekræftelse af fold ændring observeret i microarray analyse. Real Time PCR for miR-22 targets-
CCND1
CDKN1A
dog viste ikke signifikant dysregulering med -0,09 log fold (nedregulering) og 0,11 log fold (opregulering) ændring, (fig 5B).
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.