PLoS ONE: Tetrandrine inducerer Mitokondrier-medieret apoptose i Human Gastric Cancer BGC-823 Cells

Abstrakt

Tetrandrine, en bis-benzylisoquinoline alkaloid isoleret fra den tørrede rod Hang-Fang-Chi (

Stephania

tetrandra

S. Moore), er blevet rapporteret at have anti-cancer effekter på mange tumorer. I denne undersøgelse undersøgte vi tetrandrine-induceret apoptose på menneskers mavekræft BGC-823 celler

in vitro

in vivo

. Resultaterne viste, at tetrandrine signifikant inhiberede cellelevedygtighed på en dosis- og tidsafhængig måde og induceret apoptose. Det øgede apoptose; opregulering af Bax, Bak og Bad; og nedregulering af Bcl-2 og Bcl-xl i BGC-823 celler. Desuden tetrandrine øget aktivering af caspase-3 og -9, frigivelse af cytochrom

c

, og opregulering af Apaf-1, hvilket antyder, at tetrandrine apoptose var relateret til det mitokondrielle pathway. I mellemtiden, forbehandling med den pan-caspaseinhibitoren z-VAD-FMK i BGC-823 celler reducerede tetrandrine-induceret apoptose ved at blokere aktivering af caspaser. Endvidere tetrandrine inhiberede effektivt tumorvækst via apoptose induktion, hvilket blev verificeret ved hjælp af immunhistokemisk analyse i en nøgen mus xenograft model. Tilsammen, konkluderede vi, at tetrandrine betydeligt hæmmet udbredelsen af ​​gastrisk kræft BGC-823 celler gennem mitokondrier-afhængig apoptose, der kan spille en lovende rolle i gastrisk kræftbehandling

Henvisning:. Qin R, Shen H, Cao Y, Fang Y, Li H, Chen Q, et al. (2013) Tetrandrine inducerer Mitokondrier-medieret apoptose i Human Gastric Cancer BGC-823 celler. PLoS ONE 8 (10): e76486. doi: 10,1371 /journal.pone.0076486

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA

Modtaget: 16. december 2012; Accepteret: August 27, 2013; Udgivet: 1 oktober 2013

Copyright: © 2013 Qin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud: tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81070423 og 81101677), tilskud fra Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (BK 2.010.332). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i Kina, gastrisk cancer, en af ​​de mest almindelige ondartede tumorer, som skyldes en akkumulering af genetiske og epigenetiske begivenheder, har stadig en høj forekomst og dødelighed [1-3]. Der er flere faktorer, der forårsager udbrud af mavekræft, såsom

Helicobacter Pylori

infektion, kost, rygning, og så videre [4]. Afhængig af omstændighederne, de fleste patienter med gastrisk cancer brug for kirurgi, kemoterapi og /eller strålebehandling [5]. Tidligere undersøgelser har vist, at mavekræft er en kompleks genetisk sygdom relateret til onkogener eller tumor undertrykkere [6].

Tetrandrine (C

38H

42n

2O

6, MW 622,730 ) er et bis-benzylisoquinoline alkaloid isoleret fra den tørrede rod Hang-Fang-Chi (

Stephania

tetrandra

S. Moore). For nylig er de forskellige biologiske aktiviteter af tetrandrine blevet undersøgt intensivt på grund af dets brede anvendelse ved arthritis, arytmi, inflammation, silikose, forskellige typer af tumorer, og omvendt multiresistens [7,8]. Det forlyder, at tetrandrine har væsentlig indvirkning på tumorer, herunder aftagende tumor vækst og stigende dyr overlevelsestid og overlevelse [9-12]. Tetrandrine forårsager en G1 cellecyklus-blokade og inducerer apoptose i forskellige celletyper. Men de præcise mekanismer, hvormed tetrandrine indleder apoptose og hæmmer cellevækst i gastriske tumorceller fortsat uklare [13]. Det er rapporteret, at codelivery af paclitaxel (Ptx) og tetrandrine af nanopartikler effektivt kan øge cytotoksiciteten af ​​Ptx ved sekventiel inhibering af ROS-afhængige Akt pathway og aktivering af apoptotiske veje baseret på oxidation terapi mod mavekræft [14]. Men som et terapeutisk middel, Ptx uundgåeligt har alvorlige bivirkninger på grund af dens ikke-specifikke toksiske virkninger og specielle opløsningsmidler og tumorceller kan blive mere resistente over for Ptx-induceret apoptose [15-17]. En tidligere undersøgelse har vist, at tetrandrine har en synergistisk virkning med kemoterapeutiske midler på apoptose af gastriske cancercellelinier [18]. Endvidere et derivat (H1) af tetrandrine udøver god anti-multilægemiddelresistens aktivitet ved at initiere intrinsiske apoptose pathway og inhibere aktiveringen af ​​ERK1 /2-og Akt1 /2 [19]. Disse resultater tyder på, at tetrandrine kunne erstatte Ptx som den første linje kemoterapi for mavekræft.

Da tetrandrine har et stort potentiale i anti-cancer terapi, er det vigtigt at studere det systematisk at forstå dens mekanisme. Derfor, i dette studie undersøgte vi de mulige mekanismer tetrandrine på humane gastriske kræftceller

in vitro

in vivo

.

Materialer og metoder

Materialer og reagenser

Tetrandrine blev opnået fra Jiangxi Yintao Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, Kina). Antistoffer blev opnået fra de følgende kilder: antistoffer mod Bcl-2, Bax, Bcl-xl, caspase-3, -8, -9, cytochrom

c

, Apaf-1, og β-actin var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); anti-Bad og Bak var fra Bioworld Technology (St. Louis Park, MN, USA). Den Trizol reagenskit blev købt hos Invitrogen (Grand Island, NY, USA). MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Cellekultur

Den menneskelige mavekræft cellelinje BGC-823 blev købt fra Shanghai Cell Biology, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT, USA), 1% penicillin og 1% streptomycin i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2 ved 37 ° C.

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev målt ved MTT-assayet. Kort fortalt blev celler podet i 96-brønds plader ved en densitet på 1 x 10

4 celler /brønd. Efter 36 timer blev celler behandlet med eller uden tetrandrine i forskellige koncentrationer i 24, 48 og 72 timer; og phosphatbufret saltvand (PBS) tjente som en negativ kontrol. Derefter, 20 pi MTT farveopløsning (0,5 mg /ml, opløst i PBS og filtreret gennem et 0,2-mm membran) blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Derefter blev 150 pi dimethylsulfoxid tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i yderligere 10 min. Absorbans blev målt ved 490 nm under anvendelse af en 96-brønds mikropladelæser. IC

50 værdi blev defineret som koncentrationen af ​​lægemiddel, der inhiberer 50% cellevækst sammenlignet med kontrolgruppen.

Western blotting

mavekræft celler blev vasket to gange med PBS, og derefter 100 pi RIPA Lysis Buffer (Beyotime, Kina) blev tilsat til hver brønd for at lysere celler i ca. 20 minutter. Dernæst blev blandingen centrifugeret ved 12.000

g

i 15 minutter, og supernatanten blev opsamlet. Proteinkoncentration blev detekteret ved anvendelse af et BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kina) ifølge producentens instruktioner. Totalt protein blev separeret ved SDS-PAGE på 8%, 10% og 12% polyacrylamidgeler og overført elektroforetisk på polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, Bedford, MA, USA). Efter blokering i 2 timer eller natten over med 5% fedtfri tørmælk (opløst i Tris-saltvand-Tween 20 buffer, TBST) blev membranerne inkuberet med primære antistoffer (1: 500-1: 1000 fortynding) i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C og derefter vasket tre gange med TBST (5 mM Tris-HCI, pH 7,4, 136 mM NaCl, 0,1% Tween 20) før omsætning med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer (1: 5000 -1: 10000) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask tre gange i 10 minutter hver med TBST blev membranerne behandlet med ECL Western Blotting Detection Reagent.

Kvantitativ real-time polymerasekædereaktion

Totalt cellulært RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol-reagens ( Invitrogen) ved at følge producentens protokol og opløst i DEPC-behandlet vand. Koncentrationen af ​​total RNA blev målt ved UV-absorbans spektroskopi. Revers transkription blev udført under anvendelse af en RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas MBI, Waltham, MA, USA) ved at følge fabrikantens protokol. Den nyligt syntetiserede cDNA blev amplificeret ved polymerasekædereaktion (Fermentas). Sekvenserne af hver primer anvendt i denne undersøgelse er vist i tabel 1. Polymerasekædereaktionen betingelser er som følger: 95 ° C i 3 minutter, 95 ° C i 5 min, 58 ° C i 30 minutter, og 72 ° C i 30 minutter efterfulgt af 40 cyklusser ved 94 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Alle tests blev udført tre gange.

Gene

Sense primer (5 ’til 3′)

antisense-primer (5 ’til 3’)

bcl-2GGATCCAGGATAACGGAGGCCCAGATAGGCACCCAGGGTbaxACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTACAAACATGGTCACGGTCTGCbclxlGGCAGGCGACGAGTTTGACCCATCCCGGAAGAGTTCATβ-actinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCATable 1. Sekvenser af primere for generne anvendt i denne undersøgelse.

CSV download CSV

Annexin V-propidiumiodid bindingsassay

Kort fortalt blev cellerne podet i 6-brønds plader og behandlet med forskellige koncentrationer af tetrandrine i 24 timer, og PBS tjente som en negativ kontrol. Derefter blev cellerne resuspenderet i 500 pi kold bindingsbuffer. Cellesuspensioner blev farvet mod Annexin-V og propidiumiodid (BD Pharmingen

TM, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) ifølge producentens instruktioner, og derefter flowcytometri-analyse blev udført ved en FACS (Coulter, Becton Dickinson).

Caspase-3-aktivitet assay

Kort fortalt celler blev inkuberet i en 6-brønds plade ved en koncentration på 4 x 10

5 /brønd og behandlet med den angivne koncentration af narkotika. et tilsvarende volumen PBS blev anvendt som en negativ kontrol. Caspase-3-aktivitet blev målt ved anvendelse af et caspase-3-aktivitet assaykit (Beyotime, Kina) ifølge producentens instruktioner. Absorbansen blev derefter målt ved 405 nm under anvendelse af en mikropladelæser. Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer.

Etik erklæring

Procedurer, der involverer dyr og deres pleje blev udført i overensstemmelse med NIH retningslinjer (NIH Pub. No.85-23, revideret 1996) og blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg for Affiliated Folkets Hospital, Jiangsu Universitet.

Dyreforsøg

Female nøgne mus (BALB /c nu /nu), 4-6 uger gamle, blev opnået fra Experimental Animal center of the Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) og holdt under specifikke patogenfrie betingelser i et biologisk skab på Laboratory Animal Facility i Jiangsu Universitet. Dyrene blev holdt i en 12 timers lys-mørke cyklus. Rumtemperatur holdes på omkring 20 ° C, og fugtigheden blev holdt på omkring 50% i et rum med en filtreret lufttilførsel.

Tetrandrine behandling af subkutane BGC-823 tumorer hos mus

At etablere en BALB /c-mus xenograft model af human gastrisk cancer, BGC-823-celler ved en koncentration på 5,0 × 106/150 pi blev injiceret i den højre flanke af hver BALB /c nøgne mus. Ca. 10 dage senere (tumorstørrelsen nåede 120-150 mm3) blev nøgne mus tilfældigt opdelt i tre grupper (n = 5) og givet følgende behandlinger: kontrol (behandlet med normalt saltvand), Gruppe lavdosis (behandlet med 40 mg /kg tetrandrine), og høj dosis (behandlet med 120 mg /kg tetrandrine). BALB /c-mus blev injiceret intraperitonealt med tetrandrine (200 pi, 40 mg /kg eller 120 mg /kg) eller et tilsvarende volumen af ​​normalt saltvand, en gang om dagen i 3 uger hhv. Tumorstørrelsen blev målt hver 3. dag i to på hinanden vinkelrette dimensioner med skydelære, og tumorvolumen (TV) blev beregnet ved formlen: TV = længde (mm) x bredde

2 (mm

2) × 0,5 . Relative tumorvolumen (RTV) blev beregnet efter følgende formel: RTV = TV

t /TV

0, hvor TV

0 er tumorvolumen på dag 0 og TV

t er tumoren volumen på en given dag t. I mellemtiden blev dyrene vejet to gange om ugen. Ved slutningen af ​​forsøget blev tumorer skåret ud og fikseret i formalin til yderligere analyse.

Immunohistokemisk analyse

paraffinindlejrede prøver udskåret fra BGC-823 nøgne mus blev farvet under anvendelse af de følgende antistoffer : Bcl-2 og Bax (Boster), Bcl-xl, aktiverede caspase-3, og aktiveret Caspase-9 (Santa Cruz) til immunhistokemi. Billeder blev taget med et fluorescensmikroskop (Carl Zeiss).

Statistisk analyse

Alle forsøg blev udført mindst tre gange, og alle data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Statistiske forskelle bestemtes ved envejs ANOVA under anvendelse af SPSS 16.0 software. En P-værdi mindre end 0,05 blev anset for at være betydelig.

Resultater

Cytotoksisk effekt af tetrandrine på BGC-823 celler

Den kemiske struktur af tetrandrine er vist i figur 1A. Den anti-proliferative effekt af tetrandrine blev undersøgt i BGC-823 celler under anvendelse af MTT-assayet. Som det er vist i figur 1B, blev cellerne behandlet i 24, 48 og 72 timer med forskellige koncentrationer af tetrandrine. Tetrandrine fandtes signifikant at hæmme væksten af ​​BGC-823 celler på en dosis- og tidsafhængig måde. BGC-823 celler blev signifikant hæmmet af tetrandrine på 10 pg /ml (

P

0,05). IC

50 værdien var 6,104 ± 0,786, 4,471 ± 0.650 og 3,744 ± 0,573 følgende 24, 48 og 72 timer af tetrandrine behandling hhv. Således blev 6, 8, og 10 ug /ml bestemt som de repræsentative koncentrationer i følgende undersøgelser.

(A) Den kemiske struktur af tetrandrine. (B) Celleproliferation blev bestemt ved en MTT assay og BGC-823 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af tetrandrine ved 24, 48 og 72 t. Inhiberingen sats for kontrolgruppen var sat til 0. Data er udtrykt som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg udført in triplo. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001 versus kontrolgruppen henholdsvis.

Induktion af apoptose ved tetrandrine

Der er rapporteret Tetrandrine-medierede anti-cancer evner til at være forbundet med apoptose [9-12]. Derfor undersøgte vi evnen hos tetrandrine-induceret apoptose af BGC-823-celler under anvendelse af en flowcytometriassayet. Som målt ved flowcytometri, er virkningerne af tetrandrine på BGC-823 celle apoptose vist i figur 2A og B, med de 24-h tetrandrine behandlinger ved 0, 6, 8, og 10 ug /ml resulterede i 4,35%, 11,4% , 17,72%, og 32,34% af apoptotiske celler, henholdsvis og tetrandrine (8 ug /ml) i 0, 12, 24 og 48 timer resulterer i 3,4%, 6,64%, 19,15% og 25,85% af apoptotiske celler, henholdsvis (Figur 2C og D). Disse data viste klart, at tetrandrine induceret apoptose i BGC-823 celler på en dosis- og tidsafhængig måde. Antallet af apoptotiske celler steg sammen med tetrandrine koncentration og behandlingstiden.

En PI-Annexin V-FITC binding assay blev anvendt til at detektere apoptose af BGC-823 celler. (A) Celler blev behandlet med tetrandrine i 24 timer ved 0, 6, 8, og 10 ug /ml. (C) Celler blev behandlet med 8 ug /ml tetrandrine i 0, 12, 24 og 48 timer. (B, D) Søjler repræsenterer middelværdier ± SD af apoptotiske celler opnået fra tre uafhængige forsøg. **

P

0,01; ***

P

0,001 versus kontrolgruppen.

Tetrandrine-medieret udtryk af Bd-2 familiemedlemmer

For at undersøge mere specifikke mekanisme på induktion af apoptose i BGC-823 celler ved tetrandrine, vi har registreret ekspressionen af ​​apoptose-relaterede proteiner ved Western blotting og deres mRNA-niveauet af real-time (RT) -PCR. Her, studerede vi ekspressionen af ​​Bax, Bad, Bak, Bcl-2, og Bcl-xl i BGC-823 celler behandlet med tetrandrine. Efter 24 timers eksponering for tetrandrine, Bax, Bad, og Bak-protein-ekspression blev dosisafhængigt forøget, hvorimod Bcl-2 og Bcl-xl proteinekspression var dosisafhængig reduceret (figur 3A). Vi fandt også, tetrandrine kunne opregulere ekspressionen af ​​Bax og nedregulere ekspressionen af ​​Bcl-2 i en tidsafhængig måde (Figur 3B). For at bestemme om tetrandrine ville påvirke gentranskription af bcl-2, bcl-xl, og Bax, blev deres mRNA-ekspression undersøgt ved RT-PCR (figur 3C). RT-PCR resultater viser klart falder sammen med de præsenteret i figur 3A.

(A) Western blot-analyse af ekspressionen af ​​apoptose-relaterede proteiner i BGC-823-celler behandlet med 6, 8, og 10 ug /ml tetrandrine i 24 timer. (B) Western blot-analyse af bcl-2 og Bax behandlet med 8 ug /ml tetrandrine til 12, 24, 48 og 72 timer. (C) Virkninger af tetrandrine på ekspressionsniveauerne af bcl-2, bcl-xl, og Bax blev bestemt ved anvendelse real-time PCR (1), kontrol (2) 6 ug /ml (3) 8 ug /ml (4) 10 ug /ml. p-actin-ekspression blev anvendt som en intern kontrol. Data rapporteres som middelværdier ± SD af mindst tre eksperimenter. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001 versus kontrolgruppen.

Tetrandrine-induceret apoptose via en mitokondrie vej hos BGC-823 celler

For at undersøge, om tetrandrine-induceret apoptose var forbundet med aktiveringen af ​​caspase medlemmer, målte vi ekspressionen af ​​caspaser i BGC-823-celler behandlet med forskellige koncentrationer af tetrandrine ved Western blotting. Resultaterne viste en dosisafhængig stigning af spaltet caspase-3 og spaltes caspase-9 i tetrandrine- behandlede celler (figur 4A). Imidlertid nondetectable niveauer af spaltet caspase-3 og spaltet caspase-9 blev fundet i celler i fravær af tetrandrine behandling (data ikke vist). For yderligere at bestemme den rolle, caspaseaktivering i tetrandrine-induceret apoptose, blev BGC-823 celler forbehandlet med pan-caspaseinhibitor z-VAD-fmk (10 uM) i 4 timer og derefter behandlet med 8 ug /ml tetrandrine i 24 h. Sammenlignet med kontrollen, blev de relative aktiviteter af caspase-3 steg i BGC-823 celler behandlet med tetrandrine kun (figur 4B). Hertil kommer, at frigivelse af cytochrom

c

blev forøget i en dosisafhængig måde ved tetrandrine. Et repræsentativt flowcytometri Resultatet viste, at celler forbehandlet med z-VAD-fmk stærkt reduceret tetrandrine-induceret apoptose og der blev detekteret kun et lille antal apoptotiske celler (figur 4C). Dernæst undersøgte vi ekspressionsniveauet af cytoplasmatisk cytochrom

c

, der frigives fra mitokondrierne i cytoplasmaet under apoptose, handlede på apoptotisk protease aktiverende faktor-1 (Apaf-1) ved at øge bindingen af ​​Apaf- 1 til ATP /dATP, og induceret caspase-9-afhængig aktivering af caspase-3 [20-22]. Det konstateredes, at tetrandrine signifikant forøgede ekspression af cytoplasmatiske cytochrom

c

og Apaf-1 i BGC-823 celler på en dosisafhængig måde (figur 4D). Tilsammen viser disse resultater viste, at en mitokondrier-medieret caspasekaskaden pathway var involveret i tetrandrine-induceret apoptose.

(A) Western blot-analyse af ekspressionen af ​​procaspase-3, spaltet caspase-3, og spaltede caspase- 9 i BGC-823-celler behandlet med tetrandrine på 6, 8, og 10 ug /ml i 24 timer. (B) Cellerne blev forbehandlet med eller uden pan-caspaseinhibitor z-VAD-fmk (10 uM) i 4 timer efterfulgt af behandling med tetrandrine på 8 ug /ml i 24 timer, og den relative aktivitet af caspase-3 blev målt ved anvendelse af en caspase-3-aktivitet assay. (C) BGC-823-celler blev forbehandlet med eller uden z-VAD-fmk (10 uM) i 4 timer efterfulgt af behandling med tetrandrine på 8 ug /ml for 24 timer. En PI-Annexin V-FITC binding assay blev anvendt til at detektere apoptose af BGC-823 celler. (D) Western blot-analyse af ekspressionen af ​​cytoplasmatiske cytochrom

c

og Apaf-1 i BGC-823 celler behandlet med tetrandrine på 6, 8, og 10 ug /ml for 24 timer. p-actin-ekspression blev anvendt som en intern kontrol. Data rapporteres som middelværdier ± SD af mindst tre eksperimenter. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001 versus kontrolgruppen.

Anti-tumor effekt af tetrandrine på BGC-823 nøgen mus implanteret

Da tetrandrine blev fundet signifikant at hæmme væksten af ​​BGC-823 celler

in vitro

, vi evalueres yderligere anti-tumor effekt af tetrandrine

in vivo

med etablerede xenograftmodeller. Som vist i figur 5A, kunne tetrandrine effektivt at hæmme tumorvækst efter en 24-dages behandling. Ved udgangen af ​​24 dage, den gennemsnitlige tumorvolumener var 493.06 mm

3 og 1243.00 mm

3 i højdosisgruppen og gruppe lav dosis, henholdsvis svarende til 80,52% og 50,9% hæmning sats sammenlignet med kontrolgruppen gruppe. Desuden blev tumorvægt reduceret som følge af behandling med tetrandrine ved begge koncentrationer (figur 5B tabel 2). Dette resultat viste, at en høj dosis af tetrandrine havde en stærkere antitumorvirkning end en lav dosis på BGC-823 xenograft model.

BGC-823 celler blev subkutant inokuleret i BALB /c nøgne mus til at fastslå xenograftmodel. (A) Tumorvækst blev overvåget ved de angivne tidspunkter, og tumorvolumen blev målt hver 3. dag. Den første dag i lægemiddelbehandling blev defineret som dag 0. Dataene repræsenterer middelværdier ± SD af relative tumorvolumen for hver gruppe. (B) Tumor vægt blev målt ved afslutningen af ​​forsøget. Data repræsenterer middelværdier ± SD af tumoren vægt for hver gruppe. ***

P

0,001 versus kontrolgruppen.

Group (n = 5)

Tumor volumen (mm

3)

Hæmmende Rate (%)

Tumor vægt (g)

Hæmmende rate (%)

control2531.78 ± 153.251.194 ± 0.10Tet (40 mg /kg) 1243.00 ± 55,19

*** 50.900.641 ± 0,06

*** 46.31Tet (120 mg /kg ) 493,06 ± 145,63

*** 80.520.298 ± 0,09

*** 75.04Table 2. Hæmning af tetrandrine (Tet) på tumorvækst af nøgne mus.

***

P

0.001

versus

kontrolgruppen. CSV Hent CSV

Tetrandrine-induceret apoptose i BGC-823 xenotransplantater

Immunhistokemi analyse af tumorvæv udskåret fra BGC-823 xenotransplanteret nøgne mus bekræftede, at apoptose havde fundet sted i tetrandrine-behandlede tumorer, og at mitokondrielle pathway spillede en væsentlig rolle under apoptose. Der var fem nøgne mus i hver gruppe. Vi observerede, at ekspressionen af ​​Bcl-2 og Bcl-xl blev reduceret, hvorimod de proteinniveauer af Bax, aktiverede caspase-3, og aktiveret caspase-9 blev forbedret betydeligt ved tetrandrine (figur 6). Alle disse resultater kraftigt underbygget at tetrandrine kan inducere apoptose, i overensstemmelse med den

in vitro

undersøgelse

Immunohistokemisk farvning for apoptose-relaterede proteiner:. Bcl-2, Bcl-xl, Bax, aktiveret caspase -3, og aktiveret Capase-9. Forstørrelse er 200 ×. Repræsentative mikrofotografier af tre grupper er vist. DAB farvede immunoreaktive celler (mørk brun).

Diskussion

mavekræft, den fjerde mest almindeligt diagnosticeret neoplasme bag kræft i lunge, bryst, colon og rektum, forårsager næsten en millioner årlige dødsfald og har været den anden årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [23-26]. Kirurgi, kemostråleterapi, og molekylær målrettet terapi har været de vigtigste behandlingsstrategier i behandlingen af ​​gastrisk kræft [27]. Selvom kirurgisk resektion har været den mest effektive helbredende behandling, er resultaterne usammenhængende og begrænset af tumor tilbagefald og kemoresistens. Konventionelle kemoterapeutiske lægemidler, såsom Ptx, 5-fluoruracil og cisplatin ødelægger tumorceller ved at inducere apoptose og autofagi; men tumorceller kan blive resistente over for narkotika-induceret apoptose [17,28,29].

Det forlyder, at tetrandrine har stærke anti-tumor aktivitet både

in vitro

i vivo

i mange cancerceller, såsom A549 humane lunge carcinomceller, blære cancerceller, colon cancerceller, hepatomaceller og så videre [9-12]. En tidligere undersøgelse viste, at tetrandrine kan spille en lovende rolle synergistisk interaktion med kemoterapeutiske midler eventuelt ved deres synergistiske virkninger på induktion af apoptose og nedregulering kemoterapeutiske middel-associerede gener i MKN-28-celler og BGC-823-celler [18]. Imidlertid har den mekanisme af tetrandrine på humane mavekræft BGC-823 celler ikke blevet identificeret. I denne undersøgelse viste vi, at tetrandrine udviste potent antitumoraktivitet mod human mavekræft

in vitro

in vivo

, belyse de underliggende virkningsmekanismer.

For det første, vores resultaterne viste, at tetrandrine inhiberes effektivt BGC-823 celleproliferation analyseret ved MTT på en dosis- og tidsafhængig måde. I mellemtiden, IC

50’erne i tetrandrine var ca. 6,1, 4,5, og 3,7 pg /ml i BGC823 celler i 24, 48 og 72 t. Ifølge tidligere undersøgelser, kemoterapeutiske lægemidler dræbe faste tumorer primært ved at inducere apoptose [30-32]. Vi fandt, at apoptose blev induceret ved tetrandrine i en koncentrationsafhængig måde gennem flowcytometrianalyse med forøget tidlig apoptotiske celler og sene apoptotiske celler i gastrisk cancer BGC-823 celler.

I pattedyrceller, apoptose kan udløses af den ydre vej aktiveres af død receptoren og indre vej reguleret af Bcl-2-familiemedlemmer og caspase kaskader i mitochondriet [33,34]. I vores undersøgelse tetrandrine øgede ekspressionen af ​​de pro-apoptotiske proteiner Bax, Bad, og Bak og reducerede proteinniveauer af Bcl-2 og Bcl-XL. Derfor er en forøget forhold af anti- og pro-apoptotisk protein ekspression, såsom Bax /Bcl-2-forhold, ville føre til tab af mitochondriemembranpotential. Funktionsforstyrrelser mitochondrier udgivelser cytochrom

c

, som akkumuleres i cytosolen og danner et kompleks med Apaf-1. I indre vej, som en effektor, caspase-3 spaltes ved aktivering af caspase-9 [35-37]. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at caspase-9 og caspase-3 blev aktiveret ved tetrandrine. Den pan-caspaseinhibitor z-VAD-FMK reduceret apoptose i BGC-823 celler, hvilket indikerer, at mitokondrier vej spiller en central rolle i tetrandrine-induceret apoptose.

Det forlyder, at tetrandrine kunne vende modstanden til mange kemoterapi narkotika, såsom Ptx og doxorubicin i KBv200 og K562 nude mus xenograftmodeller [38,39]. Tetrandrine også besidder en stærk evne til at inhibere angiogenese i gliomer i rotter [40]. Endvidere vore resultater viste, at tetrandrine udviste stærk antitumoraktivitet ved at hæmme tumorvækst og inducere apoptose i det etablerede BGC-823 nøgne mus xenograftmodel.

Som konklusion demonstreret vores data, at tetrandrine signifikant apoptose i human gastrisk cancer BGC-823-celler og dets nøgne mus xenograftmodeller. Tetrandrine apoptose var forbundet med aktivering af den indre apoptose pathway. Baseret på disse resultater, kunne tetrandrine har et stort potentiale i behandlingen af ​​menneskets mavekræft i fremtiden.

Tak

Vi vil gerne takke medlemmerne af Klinisk Medicin Institut for Jiangsu University for deres teknisk bistand.