PLoS ONE: Hæmning af Mesothelin som en roman strategi for målretning Cancer Cells

Abstrakt

Mesothelin, en differentiering antigen til stede i en række maligniteter såsom lungehindekræft, ovarie-, lunge- og pancreascancer, er blevet undersøgt som en markør for diagnose og et mål for immunterapi. Men vi var interesserede i at vurdere virkningerne af direkte målretning af Mesothelin om levedygtigheden af ​​kræftceller som det første skridt i retning af at udvikle en ny terapeutisk strategi. Vi rapporterer her, at genet specifik nedregulering for Mesothelin ved forskellige metoder (siRNA og microRNA) faldt levedygtighed kræftceller fra forskellige oprindelser såsom lungehindekræft (H2373), kræft i æggestokkene (SKOV3 og Ovcar-5) og bugspytkirtelkræft (MiaPaCa2 og Panc-1 ). Derudover invasionsevne af cancerceller blev også signifikant reduceret ved en sådan behandling. Vi undersøgte derefter pro-onkogene signalveje karakteristika af celler efter mesothelin-dæmpning som viste et signifikant fald i phospho-ERK1 og PI3K /AKT-aktivitet. Den molekylære mekanisme af reduceret invasionsevne blev forbundet med reduceret ekspression af β-catenin en vigtig markør for EMT (epithelial-mesenchymal overgang). Ero1, et protein involveret i clearing ufoldede proteiner og et medlem af ER-Stress (endoplasmatisk reticulum-stress) pathway blev også markant reduceret. Endvidere Mesothelin lyddæmpning forårsagede en signifikant stigning i fraktion af cancerceller i S-fase. I næste trin, behandling af kræft i æggestokkene celler (OVca429) med et lentivirus udtrykker anti-mesothelin microRNA resulterede i væsentligt tab af levedygtighed, invasiv, og morfologiske ændringer. Derfor foreslår vi, at hæmning af Mesothelin som en potentiel ny strategi for at målrette menneskelige maligniteter

Henvisning:. Wang K, Bodempudi V, Liu Z, Borrego-Diaz E, Yamoutpoor F, Meyer A, et al. (2012) Hæmning af Mesothelin som en roman strategi for Målretning kræftceller. PLoS ONE 7 (4): e33214. doi: 10,1371 /journal.pone.0033214

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, USA

Modtaget: September 7, 2011; Accepteret: 5 feb 2012; Udgivet: 2 April, 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskning på F. Farassati laboratorium er støttet af “Alt i for Cure”, “Mesotheliom Applied Research Foundation (MARF)”, “Marsha Rivkin Institut for kræft i æggestokkene (MRC)” og “stewardesse Medical Research Institute (FAMRI)”. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mesothelin (MSLN), en plasmamembran differentiering antigen, udtrykkes markant høje niveauer i flere humane kræftformer, herunder næsten alle mesotheliomas [1] og pancreas adenokarcinomer [2], [3] som brønde som omkring 70 % af ovariecancere [4], [5] og 50% af lunge-adenocarcinomer [6], [7]. MSLN påvises i over 70% af finnåls-aspirater (FNA) af pancreas adenocarcinomer [2]. En anden nylig undersøgelse viste, pleural effusion MSLN som en nyttig markør til påvisning af malignt pleura mesotheliom [8]. MSLN udtrykkes også i spormængder i normale mesotelceller.

MSLN

gen koder for et 69 kDa-polypeptid indeholdende hydrofob sekvens ved carboxylenden, som fjernes og erstattes med phosphatidylinositol. MSLN genet indeholder 17 exoner på humant kromosom 16p13.3 og MSLN cDNA er 2138-bp lang, med en åben læseramme på 1884 basepar.

Mutant mus med inaktivering af begge kopier af genet MSLN blev dannet med det formål at studere funktionen af ​​dette protein, selv blev rapporteret ingen påviselige abnormiteter for denne fænotype [9] https://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/10/12/3937 – B8 # B8. Et andet sæt af undersøgelser har indført MSLN at være involveret i adhæsion siden NIH3T3-celler transficeret med en MSLN ekspressionsvektor var vanskeligere at fjerne fra dyrkningsskålene end ikke-transficerede celler [1]. Muligheden for en rolle for MSLN i adhæsion understøttes af en undersøgelse, der viser, at MSLN binder til CA125 (MUC16), et medlem af mucin-familien glycoproteiner, og at en sådan interaktion medierer celleadhæsion [4]. Baseret på disse resultater, forfatterne foreslog, at der kan være en vigtig rolle for CA125 og MSLN i metastatisk spredning af kræft [4]. Desuden blev mesothelin interaktion med MUC16 foreslået at lette peritoneal metastaser [10].

I modeller som kræft i æggestokkene, analyser af sammenhængen mellem MSLN udtryk, patologisk variabilitet og kliniske resultater viste, at høj MSLN udtryk var positivt associeret med kemo-modstand i epitel ovariecancer patienter og kort patient overlevelsestid [12]. MSLN og en anden markør HE4 er for nylig blevet undersøgt for deres værdi som markører til påvisning af ovariecancer [5], [11]. Fra andre maligniteter det homologe at MSLN gen, nemlig

Erc

viste sig at være over-udtrykt i rotte renal karcinom [12], [13]. I mavecancerpatienter, den MSLN positive gruppe havde signifikant mere lymfeknudeinvolvering og væsentligt dybere tumor invasion end MSLN negative gruppe [14]. Interessant nok blev den 5-årige overlevelsesrate sig at være højere i MSLN positiv gruppe i denne undersøgelse.

Flere undersøgelser har indikeret vigtige interaktioner mellem signalveje, der er involveret i udviklingen af ​​maligne fænotype og MSLN. For eksempel blev MSLN sig at inducere ekspression af matrixmetalloproteinaser 7 (MMP-7) [15] eller at øge ekspressionsniveauerne af interleukin 6 (IL-6) [16]. Ekspression af mesothelin hævdes også at give resistens over for apoptose som respons på tumornekrosefaktor-alfa (TNF-alfa) [17]. Den MSLN genet er forskelligt reguleret af medlemmer af Wnt signaltransduktionsvejen [18]. Også i C57MG musebryst epitelceller, MSLN var opreguleret af Wnt-1. Interessant tumorer med konstitutiv aktivering af Wnt signalvejen, såsom ovarie- og pancreascancer, har høj MSLN ekspression. Yderligere undersøgelser er nødvendige for fuldt ud at definere MSLN funktion samt rolle MSLN i carcinogenese. Den meget begrænsede fordeling af MSLN på normale væv skildrer MSLN en egnet kandidat til tumor-specifik terapi. Selvom strategier såsom anvendelse af monoklonale antistoffer rettet mod MSLN har været forsøgt før [19], [20], [21], [22], [23], [24], effekten af ​​direkte hæmning af MSLN om levedygtigheden af ​​kræft celler mangler at blive undersøgt. Foruden de translationelle udløbere af sådanne undersøgelser, de indhentede oplysninger er nyttige til at evaluere rollen som MSLN i cancer biologi. I dette arbejde har vi undersøgt effekterne af lyddæmpende MSLN om levedygtighed, invasionsevne og celle signalveje i cancerceller afledt af lungehindekræft, pancreascancer og ovariecancer. Desuden silencing MSLN af en lentivirus udtrykker anti-mesothelin microRNA (miRNA) viste sig også at reducere levedygtighed og invasiv af æggestokkene cancerceller. Vi har også undersøgt resultatet af silencing MSLN på cellesignalerende karakteristika cancerceller og cellecyklusprogression for yderligere at forstå de involverede veje i den biologiske rolle af dette antigen.

Materialer og metoder

cellelinjer og kemikalier

Bxpc3, H2373, Ovcar5, og SKOV3 celler (alle opnået fra American vævskultur indsamling, www.atcc.gov andet end H2373, som blev opnået fra national cancer Institute, NCI) blev dyrket i RPMI-1640 medium, der var suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma, St. Louis, MO). OVCAR3 er dyrket i RPMI-1640 med 10% FBS med tilsætning af 2 mM L-glutamin og 10 ug /ml insulin. NIH3T3, Panc1, Maipaca2 (fra ATCC), og OVca429 celler [25] blev dyrket i Dulbeccos modifikation af Eagles medium (DMEM) (Sigma) suppleret med 10% FBS. HUVEC-celler blev dyrket i F-12K-medium suppleret med 0,1 mg /ml heparin, 0,05 mg /ml endotelcellevækst supplement, og 10% FBS. HT1080-celler blev dyrket i MEME suppleret med 10% FBS. De ovennævnte medier blev suppleret med penicillin (100 IE /ml) og streptomycin (100 mg /ml) (Sigma). 293FT celler blev dyrket i DMEM (høj glucose) suppleret med 10% FBS, 0,1 mM MEM ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM L-glutamin og 1 mM MEM natriumpyruvat. HT1080, NIH3T3, og HUVEC-celler blev indkøbt fra ATCC (Manassas, VA). 297FT celler blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA).

Anti-mesothelin siRNA blev bestilt fra Qiagen (Valencia, CA). Den blev syntetiseret i dobbeltstrenget format med Alexa Fluor 488 (AF488) konjugeret til 3′-enden af ​​sin sense-strengen. Den siRNA oligo blev re-suspenderet i den medfølgende buffer ved den endelige lager koncentration på 20 uM.

SiRNA elektroporation

10

7 til 5 × 10

7 celler var re- suspenderet i 270 pi Opti-MEM og blandet med 30 pi 20 pM siRNA stamopløsning og elektroporeret (~240 V, en puls i 20 millisekunder), så slutkoncentrationen af ​​anti-mesothelin siRNA var 2 uM. De lyseste celler, dvs. cellerne med de mest mængden af ​​siRNA, blev udvalgt på grundlag af tilstedeværelsen af ​​Alexa Fluor 488 tag ved 3′-enden af ​​siRNA-molekyle under anvendelse af FACS.

Celleproliferationsassay

Cell proliferationsassay blev udført under anvendelse WST-1 kit fra Millipore (Billerica, MA) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev 2000 celler (Weaver FACS) udpladet i hver brønd i en 96-brønds mikroplade i et endeligt volumen på 100 pi. Derefter 10 pl /brønd af WST-1 reagens blev tilsat, og pladen blev inkuberet i 1 time i standard dyrkningsbetingelser. Under inkubation levedygtige celler konvertere WST-1 reagens i formazanfarvestof ved cellulær mitokondrie-dehydrogenase. Efter denne inkubation blev absorbansen målt ved 440/600 nm.

Cell invasion assay

matrigel invasion kamre og falcon companion vævskulturplade blev opnået fra BD Biosciences (San Jose, CA) . For siRNA eksperimenter kontrol og anti-Mesothelin siRNA-behandlede celler blev (30.000 celler /brønd) udpladet i 24-brønds plade og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2. Otteogfyrre timer senere blev cellerne fikseret i 100% methanol og farvet i 0,05% krystalviolet og fotograferet til visuelt tælle antallet af besatte celler. For lentivirus relaterede eksperimenter celler blev forbehandlet med lentivirus i 3 dage og derefter introduceret til Boyden kammer assay for ~21 timer.

Western blot-analyse

Celler blev lyseret ved 5, 24, og 48 timer efter elektroporering med 1 × cellelyse-buffer. Tredive mikrogram af proteiner for hver prøve blev sat på 4-20% SDS-polyacrylamidgel (Bio-Rad, CA). Proteiner blev derefter overført til en nitrocellulosemembran. Membranen blev blokeret, vasket og inkuberet med de forskellige primære antistoffer såsom mesothelin (Abcam, MA og LS Bio, WA) og β-actin (Cell Signaling Technology, MA), efterfulgt af HRP-konjugeret sekundært antistof. Efter en grundig vask blev blottet udsættes for ECL (GE Healthcare, NJ) og autoradiografi.

Cell cyklus assay

Cell cyklus assay blev udført ifølge producentens anvisninger. Kort beskrevet omkring 10

6 celler blev vasket to gange under anvendelse CycleTEST PLUS pufferopløsning (BD Biosciences, Cat. 340.242). Celler blev resuspenderet i 1 ml af den samme buffer. Til farvning af cellerne, blev 250 pi af opløsning A og 200 pi opløsning B tilsat og inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur. Kold opløsning C (200 pi) blev tilsat og inkuberet ved 4 ° C i 10 minutter. Cellerne blev filtreret gennem et 35 um cellefilter og analyseret ved FACS-sortering flowcytometer.

Konstruktion af vektor der udtrykker miRNA

Vi designede og syntetiserede tre miRNA efterligner målrettet den fulde længde af human mesothelin gen ( gen adgang nummer: NM_005823.4). Hver designet miRNA mimic var 64 nukleotider lange, herunder delvis flankerende sekvens, miRNA hårnålen, og modne miRNA (kursiv /understreget) afledt af target-gen som følger: 1-TGCTG

ATAGCAGCAGGTCCAATGGGA

GTTTTGGCCACTGACTGACTCCCATT GCCTGCTGCTAT; 2-TGCTG

TTCATGTTCTGGAAAGCAAGG

GTTTTGGCCACTGACTGACCCTTGCT TCAGAACATGAA; og 3-TGCTG

TTTACTGAGCGCGAGTTCTCT

GTTTTGGCCACTGACTGACAGAGA ACTCGCTCAGTAAA.

Brug af BLOCK-iT Pol II miR RNAi ekspressionsvektor (Invitrogen, CA), vi udglødet og klonede oligoerne koder for konstruerede pre-miRNA i kloningsstedet (ACGA og CAGG) pcDNA 6.2-GW /EmGFP-mir vektorer, som er flankeret på hver side for at tillade retningsbestemt kloning eller korrekt proces af præ-miRNA. Præ-miRNA blev indsat i 3′-UTR af EmGFP gen-drevet af Pol II promotorer. EmGFP tillader sporing udtryk for miRNA, hvilket giver en stærk korrelation mellem EmGFP og miRNA udtryk. Hvert plasmid blev sekventeret for at bekræfte de indsatte dobbeltstrengede miRNA oligoer. De udtrykker plasmider blev elektroporeret i Ovcar5 celler eller SKOV3 celler, og analyseret ved FACS for at sikre en korrekt udtryk for miRNA i æggestokkene cancerceller.

Generation af lentivirale partikler, der udtrykker miRNA

Punktet klon var genereres ved at kombinere pMSLNmiR3 med pDONR 221 konstrukt under anvendelse BP Clonase II-enzym. Den miRNA kassetten blev overført til pLenti6.3 /TO /V5-DEST vektor indeholdende attR1-attR2 websteder ved hjælp LR Clonase II til at skabe den endelige lentivirusvektor MSLNmiR3. Derudover skabte vi en lentiviral vektor kodning scrambled miRNA (negativ kontrol) (TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACCTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCAC GCGCAGTACATTT) (Invitrogen), der ikke er målrettet nogen kendt menneskelig gen. Ekspressionen af ​​miRNA drives af CMV-promotoren. De indsatte sekvenser af miR3 og scrambled miRNA blev bekræftet ved sekvensanalyse.

Produktion, titrering og infektion af lentivirale partikler

MSLNmiR3 eller negativ kontrol lentivirus blev transficeret med ViraPower pakning mix (Invitrogen, CA ) i humane 293FT celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 Opti-MEM i medium (Invitrogen, CA) og dyrket natten over. Cellerne blev anbragt under blasticidin (10 ug /ml) selektion i 72 timer. Supernatanten blev opsamlet og lentivirale partikler blev opkoncentreret ved anvendelse Lenti-X koncentrator (Clontech, CA). Lentiviral stock blev fortyndet i ti-fold seriel til infektion af HT1080 celler. Otteogfyrre timer efter infektion blev cellerne bedømt ved FACS og titreringen blev beregnet efter formlen [FXC /V] xD, hvor “F” er frekvensen af ​​GFP-positive celler; “C” er det totale antal celler i brønden ved transduktion; “V” er rumfanget af inoculums i ml; og “D” er lentivirus fortynding. Ovca429 celler blev inficeret med lentivirus partikler ved MOI~30 i nærvær af polybren (10 ug /ml) natten over. Den celleproliferationsassay blev udført efter infektion i de angivne tidspunkter.

Flowcytometri

Dyrkede celler blev dissocieret med celledissociering puffer (Sigma-Aldrich, MO) og vasket to gange i MACS buffer (PBS plus EDTA og 0,5% bovint serumalbumin) (Miltenyi Biotec, CA). I alt 2 × 10

5-celler (100 pi) blev inkuberet med mesothelin monoklonalt antistof (slutkoncentration, 1 ug /ml) (Cat # ab3362, Abcam, MA) på is i 1 time i mørke. Celler blev derefter vasket to gange med MACS buffer, resuspenderet i 100 pi af et sekundært antistof (1:200 fortynding APC konjugeret IgG, BD Biosciences, NJ), og inkuberet på is i 1 time i mørke. Celler blev vasket to gange og analyseret på LSRII analysator (BD Biosciences, NJ) ved hjælp af softwaren FACS Diva version 6.1. Celler farvet med sekundært antistof alene blev inkluderet for at bevise specificitet af antistof.

Resultater og Diskussion

Vi besluttede at vurdere virkningerne af lyddæmpende MSLN ved at bruge korte interfererende RNA (siRNA). Mekanistisk kan disse 19-21 oligomerer binde sig til en specifik matchning sekvens i deres target messenger RNA (mRNA’er) og afmærke dem til destruktion af et kompleks kaldet RNA-induceret tavshed kompleks (RISC). For at opnå dette, blev sekvensen af ​​MSLN mRNA analyseres med specialiseret software (Qiagen, CA) og sekvenser for siRNA oligomerer blev opdaget. En af disse sekvenser (5′-CTGGACGTCCTAAAGCATAAA-3 «) blev udvalgt på baggrund af højere grad af specificitet mod MSLN. Den anti-MSLN siRNA oligomer blev syntetiseret (i dobbeltstrenget format) og konjugeret til Alexa Fluor 488 i 3′-enden af ​​sin sense-strengen (Qiagen, CA). Figur 1A viser mRNA-sekvensen for humant MSLN og bindingsstedet for anti-MSLN siRNA.

(A) Anti-mesothelin siRNA designet til en midterste sekvens position i mesothelin mRNA. (B) Når elektroporeret med anti-mesothelin siRNA blev ekspressionsniveauerne af mesothelin betydeligt reduceret i H2373 celler. Negative kontrol siRNA forårsagede ikke en sådan reduktion. Nedre panel viser resultaterne af band-densitometri sammenligne intensiteten af ​​mesothelin ekspression ved elektroporering af H2373-celler med siRNA. (C) Anti-mesothelin siRNA påvirkede ikke ekspressionsniveauerne af β-actin, et hus-holde protein, som et bevis for specificiteten af ​​denne anti-mesothelin siRNA til sit mål. (D) proliferationshastighed af H2373-celler er signifikant (p 0,05) reduceret ved 48 timer efter elektroporering til 40% af værdierne for negative kontrol-behandlede celler. Et rebound til højere opformeringsrater observeres på grund af clearance af siRNA fra celler på senere tidspunkter i harmoni med vores tidligere undersøgelser. Forklaringstekstudvidelser paneler viser densiteten af ​​celler i hver gruppe af undersøgelsen ved 48 timer efter elektroporering. (E) NIH3T3 celler er ugyldige af mesothelin og deres spredning sats er ikke påvirket af udsættelse for anti-mesothelin siRNA (mus). Forklaringstekstudvidelser paneler viser tætheden af ​​celler ved 48 timer efter elektroporation.

For at undersøge effekten af ​​anti-MSLN siRNA på ekspression af MSLN, vi brugte H2373 menneskelige lungehindekræft cellelinje. Som vist i figur 1B, når elektroporeret med anti-MSLN siRNA blev ekspressionen af ​​MSLN især reduceret så tidligt som 24-48 timer efter elektroporering i forhold til den negative kontrol behandlede celler. Der blev ikke observeret nogen ændringer i ekspressionen af ​​β-actin (et hus-føring gen produkt) efter udsættelse af celler til den anti-MSLN siRNA (figur 1C).

Derefter besluttede vi at teste spredning på kræft celler under sådanne forhold. Som det ses i figur 1D, en signifikant reduktion (p 0,005) i proliferationen af ​​mesotheliom celler blev observeret så tidligt som 48 timer efter elektroporering. Det er vigtigt at bemærke, at proliferationshastighed af kontrol- siRNA-behandlede celler ved hvert tidspunkt blev målt og derefter skaleret som 100%. Spredningen på anti-MSLN siRNA behandlede celler blev beregnet og skaleres som en brøkdel af kontrolværdierne. Infoudvidelsen paneler repræsenterer celledensiteten af ​​test- og kontrol- behandlede populationer ved angivne tidspunkter efter elektroporation. Interessant proliferationshastigheden af ​​siRNA-behandlede celler begyndte at stige ved 72-96 timer efter elektroporering. Dette skyldes den forbigående karakter af transfektion ved elektroporation, som er den metode, der anvendes i disse forsøg til at indføre anti-MSLN siRNA til celler. Med andre ord, som tiden går, vil koncentrationen af ​​siRNA i behandlede celler mindskes muliggør en rebound af proliferation. Vi har observeret et sådant fænomen i vores andre undersøgelser med gen specifik lyddæmpning [26], [27]. Når den samme fremgangsmåde blev anvendt til NIH3T3-celler (void af MSLN), blev ingen statistisk signifikante ændringer i levedygtighed observeret (siRNA anvendt i dette forsøg kan binde til muse MSLN mRNA) (figur 1E).

næste skridt, besluttede vi at afprøve effekten af ​​lyddæmpende MSLN i andre MSLN-udtrykkende celler, herunder æggestokkene og kræft i bugspytkirtlen cellelinjer og sammenligne sådanne effekter med vores data om lungehindekræft celler. Niveauerne af ekspression af MSLN i et panel af pancreas og ovariecancerceller blev testet ved anvendelse western blotting som vist i figur 2A. MiaPaCa2, BxpC3 og Panc1 (bugspytkirtelkræft cellelinjer) og SKOV3 og OVCAR3 (æggestokkene kræft cellelinjer) viste øget niveauer af MSLN udtryk mens HUVEC (Humane navlestrengsveneendotelceller) og NIH3T3 celler forblev negative for MSLN som forventet. Elektroporation af alle ovennævnte cancer cellelinjer resulterede i en signifikant reduktion i deres levedygtighed (figur 2B-2D, resultater vist for SKOV3, BxPC3 og MiaPaCa2). Igen en rebound for spredning på grund af clearance af siRNA fra bugspytkirtlen og æggestokkene cancerceller blev observeret. Tidsrammen for denne rebound var variabel blandt disse cellelinjer grund af deres relative clearance rate af siRNA.

(A) Mesothelin protein blev påvist i bugspytkirtelkræft cellelinjer, Panc1, MiaPaCa2 og Bxpc3 og ovariecancerceller SKOV3 og OVCAR3. NIH3T3 og HUVEC celler, som er ugyldige af mesothelin blev brugt til at bevise specificitet mesothelin antistof. (B) SKOV3-celler havde reduceret proliferation på dag 3 post-elektroporation med anti-mesothelin siRNA til ca. 50% af den negative kontrol. Forklaringstekstudvidelser paneler viser densiteten af ​​celle ved hvert tidspunkt. (C-D) To bugspytkirtelkræft cellelinjer, Bxpc3 og MiaPaCa, blev testet for udfaldet af lyddæmpende mesothelin på deres spredning. I begge tilfælde blev der observeret et betydeligt tab af spredning, men for Bxpc3 faldet indleder på senere tidspunkter i forhold til MiaPaCa celler. For begge celler, igen observeres en rebound til højere spredning satser på længere tidspunkter på grund af clearance af siRNA fra celler. Forklaringstekstudvidelser paneler viser densiteten af ​​celle ved hvert tidspunkt.

Mens alle kræftceller viste signifikant tab af levedygtighed efter elektroporation med anti-MSLN siRNA, celler uden ekspression af MSLN såsom NIH3T3 ikke udviser væsentlige ændringer i deres spredning satser engang elektroporeret med anti-MSLN siRNA (målrettet mus MSLN). Derfor vil normale celler, med meget lav eller ingen udtryk for MSLN ikke blive påvirket af denne strategi indebærer specificiteten af ​​de biologiske resultater af MSLN dæmpende for maligne celler. Der kan derfor siges inhibering af MSLN som en potentiel strategi for målretning tumorer, såsom mesotheliom, ovarie- og bugspytkirtelkræft i en celle-specifik måde. Nylige kliniske forsøg med monoklonale antistoffer mod MSLN er også rapporteret at være veltolereret hos patienter bekræfter minimal in vivo bivirkninger for MSLN målretningsstrategier [28], [29]. Dette er af særlig betydning på grund af de begrænsede niveauer af mesothelin udtryk i pleural, perikardial og peritoneale membraner [30], [31].

Vi var også interesserede i at undersøge naturlig følge af tavshed MSLN på invasiv af cancerceller. Metastase som den mest ødelæggende resultat af maligniteter spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​cancer. Derfor er det et logisk skridt at studere resultatet af silencing mesothelin af mulighederne i kræftceller til at invadere. Dette er også en vigtig bekymring overvejer invasive karakter af maligniteter undersøgt i dette arbejde. Til sådanne formål anvendte vi en in vitro model baseret på at studere mulighederne i celler at invadere gennem et lag af matrigel som en model for metastase (modificeret Boyden kammer assay). Vi evaluerede invasiv af H2373, SKOV3 og BxPC3 celler engang behandlet med anti-MSLN og kontrol siRNA (figur 3A-3C). I alle tre tilfælde blev der observeret en signifikant reduktion i invasiv. Den reducerede invasivitet af alle testede kræftceller er af særlig klinisk betydning på grund af den høje metastatisk karakter af disse sygdomme.

(A) Når testet i et modificeret Boyden kammer assay invasivitet af H2373 mesotheliom celler reduceres betydeligt (p 0,05) efter mesothelin lyddæmpning. Elektroporerede celler blev introduceret til invasion kamre til dette eksperiment, og invaderede celler blev talt og fotograferet efter 48 timer. Forklaringstekstudvidelser paneler repræsenterer densiteten af ​​invaderede celler farvet med krystalviolet. (B-C) SKOV3 og Bxpc3 celler både udviser en signifikant (p 0,05) fald i deres invasivitet ved mesothelin silencing til værdier under 20% af den negative kontrol. Forklaringstekstudvidelser paneler repræsenterer densiteten af ​​invaderede celler farvet med krystalviolet. (D) Silencing mesothelin inducerer et signifikant fald i aktivering (phosphorylering) af ERK1 (men ikke ERK2) og phospho-AKT. Derudover er ekspressionen af ​​β-catenin, et kendt EMT markering, blev reduceret. Slug, anden transskription faktor involveret i EMT viste en lille stigning i denne tilstand. Fra ER-Stress markører blev Ero-1 faldt mens Bip var lidt forhøjet. (E) Progression af cellecyklus ændres ved mesothelin silencing hovedsagelig ved en stigning i procentdelen af ​​celler i S-fase. Procentdelen af ​​celler i hver fase er vist i øvre panel og repræsentative flowcytometri data tilbydes i det nederste panel. G1, S og G2 picks er anført på hver graf, der viser en stigning i S-fase population af celler.

Til dette formål havde vi observeret tab af levedygtighed og invasivitet i en række cancerceller ved silencing af MSLN. For at noget belyse den molekylære mekanisme bag sådanne fænotypiske ændringer evalueret vi aktiveringen /ekspressionsniveauet af nogle af de vigtigste signalsystemer proteiner involveret i neoplastisk transformation i H2373 celler (figur 3D). Effektor veje ned-strøm af proto-onkogen Ras [32], [33], [34], såsom aktivering af ERK1 /2 (ekstracellulært signal-relateret kinase), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K /AKT) og p38 (p38- kinase) blev undersøgt til dette formål. Vi observerede, at ved MSLN inaktivering, phospho-ERK1 og phospho-AKT aktivering niveauer var dybt faldet, mens niveauerne af phospho-p38 forblev uændret (figur 3D). Med inddragelse af ERK i proliferation og metastase [35], [36] og også inddrage PI3K /AKT pathway i beskyttelse mod apoptose [37], kan et fald i aktiveringen af ​​disse signalveje forklare de anti-proliferative virkninger af silencing MSLN . Imidlertid p38-pathway [38] (involveret i stress signalering, apoptose og senescens) syntes at forblive uforandret ved inhibering af MSLN. Da p38-kinase virker som en vækstinhiberende pathway, er det tænkeligt, at kapaciteten af ​​celler til at undergå vækstinhibering og /eller apoptose (dikteret af p38-kinase pathway) forbliver upåvirket af silencing MSLN.

Resultatet af siRNA-medieret knockdown af MSLN på epitel-mesenkymale overgang (EMT) [39], [40], et biologisk program for forbedring af metastatiske kapaciteter, blev også undersøgt af vores team. EMT er et vigtigt biologisk etape i gennemførelsen af ​​en metastatisk fænotype ved cancerceller [41]. Beta-Catenin, en af ​​Wnt nedstrøms signalmolekyler og også en vigtig aktør i EMT, viste sig at være væsentligt reduceret ved lyddæmpende MSLN (figur 3D, den midterste panel). Slug, anden transskriptionsrepressor involveret i EMT fandtes at være noget forøget ved MSLN silencing [42]. Med hensyn til den rolle, Slug i undertrykkelse af E-Cadherin [43] det ville være et logisk næste skridt at vurdere ekspressionsniveauerne af E-Cadherin på mesothelin lyddæmpning. Der blev imidlertid ikke mærkbar ændring observeret i niveauerne af E-cadherin (data ikke vist). Derfor den trinvise stigning i niveauer af dette protein kan ikke positivt påvirke EMT kapaciteter af kræftceller, når mesothelin er bragt til tavshed.

Vi var også interesseret i at undersøge niveauerne af ekspression af markører, der er involveret i reguleringen af ​​ER- stress. Stress situationer afbryder ER funktion føre til ophobning af foldede proteiner i ER, der er nævnt som ER-Stress [44], [45]. Ved sådanne betingelser en integreret panel af signalveje bliver aktiveret resulterer i udfoldet protein reaktion (UPR) [46], [47]. Efter fortsættelse af UPR respons og hvis udfoldede proteiner ikke blokerede mekanisme vil blive aktiveret til at inducere celledød. Eksistensen af ​​kroniske ER-Stress betingelser bliver mere og mere tydelig i cancerceller [47]. Derfor vil det være nye og spændende at se, om ændringer i ER-Stress vej vil bidrage til resultatet af MSLN tavshed i kræftceller.

ER-bosiddende protein endoplasmatiske oxidoreductin-1 (Ero1), en af ​​molekylerne involverer i ER-stress pathway, oxiderer protein (PDI), som igen, introducerer disulfid bånd til ER-proteiner [48]. Det betydelige fald observeret i Ero1 på MSLN lyddæmpning kan resultere i en nedsat evne til kræftceller til at folde og klare proteiner fører til deres eventuelle død (figur 3D, nederste panel). Også, en øget ekspression blev observeret i Bip (Luminal bindende protein precursor), en molekylær chaperon involveret i forebyggelse proteinaggregering [49]. En sådan observation kan være tegn på forhøjede niveauer af protein udfoldning på MSLN lyddæmpning som Bip niveauer normalt er rejst i cellen for at bekæmpe aggregering af ufoldede proteiner [50].

Den sidste fænotypisk træk undersøgt i MSLN-lyddæmpede celler var progression af cellecyklus. Den største ændring observeret i disse celler var en betydelig stigning (-50%) i den del af celler i S-fasen portrættere en blokade i progression fra S til G2 fase (figur 3E).

Den nuværende fremgangsmåde for fremrykkende hæmmende RNA terapi til prækliniske og kliniske studier primært afhængig af hjælp lentivira for at udtrykke og levere siRNA-molekyler på en kontinuerlig måde [51], [52], [53]. Til et sådant formål, og at frembringe en translatorisk værktøj til målretning cancerceller på grundlag af inhibering af MSLN, besluttede vi at udvikle et lentivirus udtrykker anti-MSLN miRNA. Sådan værktøj kan bruges i fremtiden for yderligere at vurdere det prækliniske værdi MSLN genspecifik silencing som en terapeutisk fremgangsmåde.

Så kort ribonukleinsyre (RNA) molekyler (-22 nucleotider) findes i alle eukaryote celler, miRNA er post-transkriptionelle regulatorer, som binder til komplementære sekvenser på mål mRNA-transkripter. Dette resulterer i translationel undertrykkelse og gen-specifik inaktivering [54], [55]. Når en serie af tre miRNA sekvenser (miR1, miR2 og miR3, er relative positioner vist i figur 4A, øvre panel) blev udvalgt, hver af dem blev klonet i et ekspressionsplasmid (pcDNA6.2-GW /EmGFP, Invitrogen) og elektroporeret ind Ovcar5 celler. Alle plasmider blev effektivt elektroporeret ind i cellerne (baseret på GFP-ekspression) (figur 4A, midterste panel). To af de designede miRNA (miR1 og miR3) ud af tre tavshed MSLN effektivt som blev afsløret ved western blotting (figur 4A, nederste panel).