PLoS ONE: Bioinformatik Viden Kort for Analyse af Beta-Catenin Funktion i Cancer

Abstrakt

I betragtning af den rigdom af bioinformatik ressourcer og den stigende kompleksitet af biologisk information, er det værdifuldt at integrere data fra forskellige kilder for at få indsigt i rollen af ​​gener /proteiner i sundhed og sygdom. Vi har udviklet en bioinformatik rammer, der kombinerer litteratur minedrift med oplysninger fra biomedicinske ontologier og kuraterede databaser for at skabe viden “kort” af gener /proteiner af interesse. Vi anvendte denne tilgang til studiet af beta-catenin, et celleadhæsionsmolekyle og transkriptionel regulator impliceret i cancer. Den viden kort indbefatter posttranslationelle modifikationer (PTMS), protein-protein interaktioner, sygdomsassocierede mutationer, og transkriptionsfaktorer co-aktiveret af beta-catenin og deres mål og fanger de store processer, hvor beta-catenin er kendt at deltage. Brug af kortet, genereret vi testbare hypoteser om beta-catenin biologi i normale og kræftceller. Ved at fokusere på proteiner, der deltager i multiple relationstyper identificerede vi proteiner, der kan deltage i returkredsene regulering beta-catenin transkriptionel aktivitet. Ved at kombinere flere netværksrelationer med PTM proteoform-specifikke funktionelle oplysninger, foreslog vi en mekanisme til at forklare den iagttagelse, at cyklin afhængige kinase

CDK5

positivt regulerer beta-catenin co-aktivator-aktivitet. Endelig ved at lægge cancer-associerede mutation data med sekvens funktioner, vi observerede mutation mønstre i flere beta-catenin PTM sites og PTM enzym bindingssteder, der varierede fra vævstype, hvilket tyder på flere mekanismer, som beta-catenin mutationer kan bidrage til kræft. Den beskrevne metode, som fanger rig information til molekylære arter fra gener og proteiner til PTM proteoforms, kan udvides til andre proteiner og deres involvering i sygdom

Henvisning:. Çelen ©, Ross KE, Arighi CN, Wu CH ( 2015) Bioinformatik Viden Kort for Analyse af Beta-Catenin Funktion i Cancer. PLoS ONE 10 (10): e0141773. doi: 10,1371 /journal.pone.0141773

Redaktør: Min Zhao, University of the Sunshine Coast, AUSTRALIEN

Modtaget: Juni 24, 2015; Accepteret: 13. oktober 2015; Udgivet: 28 Oktober 2015

Copyright: © 2015 Çelen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:. IC anerkender Republikken Tyrkiet Undervisningsministeriet for at finansiere hende under Master studier. Dette arbejde er blevet støttet af National Science Foundation (tilskud nummer: ABI-1.062.520 til CHW) og National Institutes of Health (tilskud nummer: 5R01GM080646 og P20GM103446 til CHW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser : COSMIC, Katalog af somatiske mutationer; EFIP, Udpakning Funktionel Virkning af phosphorylering; GO, Gene ontologi; PPI, Protein-protein-interaktion; PRO, Protein Ontologi; PTM, posttranslationel modifikation; RLIMS-P, Rule-baserede litteratur Mining System for Protein Phosphorylering; siRNA, lille interfererende RNA; STRING, Søg værktøj til søgning af Interacting Gener /Proteiner; TCF /LEF, T-celle Factor /Lymfoid Enhancing Factor; TcoF, Drage Database over transskription Co-faktorer og transkriptionsfaktor interagerende proteiner; TRED, Transcriptional Regulatory Element Database

Introduktion

Et væld af viden er relevant for de biologiske mekanismer i human sygdom, herunder oplysninger om protein-protein interaktioner (PPI), protein post-translationelle modifikationer (PTMS ), er genet /proteinekspression og sygdomsassocierede mutationer findes i den videnskabelige litteratur og bioinformatik-databaser. Selv om det er udfordrende at indsamle oplysninger om et gen /protein eller sygdom af interesse, der er spredt ud over den videnskabelige litteratur og opstaldet i specialiserede databaser med inkompatible formater, til udvikling af systematiske arbejdsgange integrere og analysere oplysninger fra forskellige kilder har potentiale til at afdække manglende links og føre til ny indsigt i sygdommen ætiologi og behandling.

Kombination af tekst mining-værktøjer til at udtrække oplysninger fra den videnskabelige litteratur, kuraterede databaser, og ontologier, der gør det muligt struktureret fremstilling af enheder, relationer og begreber er en stærk strategi for viden integration. I tidligere arbejde [1], udviklede vi en bioinformatik ramme for udarbejdelsen af ​​phosphorylering-centreret netværk, der beskæftigede det regelbaserede Litteratur Mining System for Protein Phosphorylering (RLIMS-P) tekst mining-systemet til at udtrække phosphoryleringsbegivenheder fra den videnskabelige litteratur og information fra phosphorylering og PPI-databaser (f.eks PhosphoSitePlus [2] og intakt [3]), samt protein Ontology (PRO) til at repræsentere phosphorylerede protein formularerne (proteoforms; [4]) og Gene Ontology (GO) [5] til funktionel annotation. Her vil vi udvide denne ramme til yderligere informationstyper og anvende det til beta-catenin, et højt studerede protein med en rolle i sygdom, for at udvide anvendeligheden af ​​tilgangen sygdom-driver mekanismer til.

Beta catenin (gen navn:

CTNNB1

) er en multi-funktionel protein, der fungerer både som celleadhæsionsmolekyle og transkriptionelle co-aktivator [6]. I metazoans, koordineret udførelse af disse funktioner er afgørende for embryonale udvikling og vedligeholdelse af væv integritet hos voksne organismer. På cellemembranen, beta-catenin er en kritisk komponent i adherensovergange, strukturer, der medierer celle-celle-kontakter i polariserede epitelvæv. I kernen, det virker som en transskription co-aktivator af T-Cell Factor /Lymfoid Enhancing Factor (TCF /LEF) familie transkriptionsfaktorer, kørsel transkription af målgener. Gratis beta-catenin i cytoplasmaet er hurtigt målrettet til ubiquitinmedieret nedbrydning. Den subcellulære lokalisering og stabilitet af beta-catenin er reguleret af ekstracellulære signaler samt et komplekst netværk af PTM begivenheder. Signalering gennem Wnt-vejen, udløses ved binding af Wnt ligand til celleoverfladereceptorer, stabiliserer beta-catenin og fremmer beta-catenin transkriptionel aktivitet. Omvendt phosphorylering af Ser-45 på beta-catenin ved caseinkinase I (CKI) efterfulgt af den sekventielle phosphorylering af Thr-41, Ser-37, og Ser-33 phosphorylering af glycogensyntasekinase,

GSK3b

, skaber et genkendelsessite for ubiquitinligase

BTRC

, som ubiquitinerer beta-catenin, målrette den til nedbrydning af proteasomet. Dysregulering af beta-catenin aktivitet er stærkt korreleret med kræft. Mutationer, der fører til beta-catenin disassociation fra adherens junction og flygte fra ubiquitinmedieret nedbrydning resultat i sin translokation til kernen, hvor det hyper-aktiverer transkriptionen af ​​dets målgener, hvoraf flere har onkogen aktivitet [7]. Salg

I denne rapport præsenterer vi en beta-catenin viden map konstrueret ved hjælp af vores viden integration tilgang, der omfatter molekylære relationer, protein sekvens funktioner, og proteoform specifikke funktionelle oplysninger. Ved at fokusere på forskellige undergrupper netværk og funktioner i kortet, vi rettet videnskabelige spørgsmål vedrørende den biologiske funktion af beta-catenin og dens rolle i kræft. Konkret har vi karakteriseret en gruppe af beta-catenin interagerende proteiner, hvis ekspression er potentielt kontrolleres af beta-catenin; vi foreslået en mekanisme til regulering af beta-catenin transkriptionel aktivitet af cyklin afhængige kinase

CDK5

, der blev identificeret som en beta-catenin regulator i en storstilet miRNA-baserede knock-down skærm kinome [ ,,,0],8]; og endelig, vi undersøgte beta-catenin cancer-associerede mutationer i forbindelse med anden sekvens funktioner at afgøre, hvordan beta-catenin aktivitet kan ændres i forskellige typer kræft.

Resultater

Konstruktion og karakterisering af Beta-Catenin Viden Kort

Udvidelse af vores tidligere arbejde, har vi udviklet en bioinformaticsframework at indfange og integrere vigtige molekylære relationer og attributter for proteiner af interesse for konstruktion af viden kort (Fig 1). Den overordnede tilgang indebærer tekst mining til at opdage molekylære relationer i den videnskabelige litteratur, integration af oplysninger fra curated databaser og ontologiske repræsentation af information. De litteratur mining værktøjer og databaser kan skræddersys til de kendte roller af proteinet under undersøgelse; flere eksempler på de ressourcer, der kan integreres, er vist i figur 1. Da PTMS er centrale regulatorer af beta-catenin aktivitet, vi understregede inkorporering af rige PTM information i beta-catenin viden map. Phosphorylering begivenheder, der involverer menneskelige beta-catenin blev påvist i den videnskabelige litteratur med RLIMS-P, et litteratur minedrift system, der identificerer omtaler af kinase, underlag og phosphorylering websted i teksten [9]. De beta-catenin PTM proteoforms er beskrevet i litteraturen var repræsenteret i PRO [10] og kommenteret med funktionel information ved hjælp af GO vilkår [5]. I alt identificerede vi 13 human beta-catenin proteoforms phosphoryleret på forskellige kombinationer af 15 forskellige steder (otte seriner, to threoniner, og fem tyrosiner). Yderligere oplysninger om beta-catenin fosforylering, acetylering, og ubiquitinering, herunder PTM enzymer og sites, blev opnået fra bioinformatiske databaser. Vi kun integreret information fra manuelt kuraterede databaser med eksperimentel validering (i modsætning til resultaterne af forudsigelsesværktøjer), sammen med klare forbindelser til dokumentation, helst til artikler i den videnskabelige litteratur. For fosforylering oplysninger, brugte vi vores nyligt udviklet iPTMnet database (https://proteininformationresource.org/iPTMnet/), hvilket giver en samlet præsentation af PTM information tekst-udvindes fra den videnskabelige litteratur og fra flere af høj kvalitet kuraterede databaser, herunder PhosphoSitePlus [2] -og Phospho.ELM [11]. At udvikle et omfattende overblik over den rolle, som beta-catenin i reguleringen af ​​genekspression og sygdomsudvikling, vi udvidet den viden kortet til at omfatte beta-catenin interagerende proteiner, herunder transkriptionsfaktorer co-aktiveret af beta-catenin og deres mål, som samt beta-catenin sekvens funktioner som PTM enzym bindingssteder og cancer associerede mutationer.

Et netværk af molekylære forbindelser beta-catenin er vist i fig 2. Den består af 727 forskellige proteiner, der deltager i 861 forbindelser (S1 tabel), herunder seks transkriptionsfaktorer co-aktiveret af beta-catenin (stiplede sorte kanter), 445 transskription faktor for målgruppen relationer (lilla kanter), 381 beta-catenin PPI og 29 PTM enzym-beta-catenin relationer ( 26 phosphoryleringer (blå kanter), to acetyleringer (lyserøde kanter), og én ubiquitinering (rød kant)). Integration af en sådan viden for proteinet af interesse ikke kun giver omfattende information, men også gør det muligt at bygge bro hullerne i viden om proteinet på systemniveau. For eksempel kan en forsker identificere de manglende dele af en potentiel signalvej, transkriptionsfaktor-target feedback-mekanismer, eller kompleks regulering af multi PTMS (se nedenfor). Hvis netværket omfattende indfanger biologisk relevante molekylære relationer beta-catenin, så de biologiske processer vedrørende netværksknudepunkterne bør være reflekterende af de kendte roller beta-catenin. For at kontrollere dette, vi udførte GO sigt berigelse og funktionel clustering analyse, hvilke grupper berigede vilkår baseret på den antagelse, at vilkår, der er forbundet med lignende sæt af gener er sandsynligvis at være relateret til hinanden [12]. Højt beriget udtryk fra de ti klynger er vist i treemap i Fig 3. De kanoniske biologiske processer, hvor beta-catenin er kendt at deltage-transkription, cellebevægelse, og celleadhæsions-er repræsenteret i top ti klynger. Klynger af phosphorylering og signaltransduktion vilkår sandsynligvis afspejler fokus i netværket på beta-catenin PTM, især fosforylering. De resterende klynger omfatter reaktion på hormon, sårdannelse /inflammation og apoptosis, som alle er forbundet med Wnt /beta-catenin signalering i litteraturen [13-15]. Således relationerne i netværket fange de mest iøjnefaldende molekylære relationer af beta-catenin.

Netværket viser forbindelser mellem beta-catenin (CTNNB1) PTM enzymer, interagerende proteiner og transkriptionsfaktorer co-aktiverede beta-catenin og deres mål.

Beriget vilkår blev inddelt i funktionelle klynger. De mest berigede vilkår for de ti bedste klynger vises i TreeMap, repræsenteret som forskellige farvede blokke. For hver term, box størrelse afspejler p-værdien af ​​udtrykket berigelse.

Identifikation af potentielle Beta-catenin Transkriptionelle feedbackmekanismer

Proteiner i netværket, der deltager i mere end én molekylære forhold er af særlig interesse, fordi de kan give indsigt i reguleringen af ​​beta-catenin og koordinering af dens mange funktioner. For at demonstrere denne idé, brugte vi beta-catenin netværk for at identificere proteiner, der kan være involveret i transkriptionel feedback-sløjfer med beta-catenin. Feedbackmekanismer, hvor produktet af et udtrykt gen stimulerer (positiv feedback) eller fortier (negativ feedback) transkriptionel program, der styrer det, spiller en kritisk rolle i cellulær transkriptionel regulering. For eksempel transkriptionsfaktoren

LEF1

, har vist sig at deltage i en positiv transskriptionel spiral med beta-catenin. I kolon kræftceller, beta-catenin /

LEF1

komplekser drive transskription af den fulde længde

LEF1

isoform, der kan binde beta-catenin på bekostning af en dominerende negativ isoform. Det udtrykte

LEF1

derefter forbinder med beta-catenin at drive yderligere udtryk for fuld-længde

LEF1

[16].

Som beskrevet i figur 4A, vi ræsonnerede, at potentielle mediatorer af feedback-mekanismer kunne findes blandt de proteiner, der er både beta-catenin transkriptionelle mål og beta-catenin interagerende proteiner. Vi identificerede en sub-netværk af 35-beta-catenin interagerende proteiner (herunder seks beta-catenin kinaser og to transkriptionsfaktorer co-reguleret af beta-catenin) samt beta-catenin sig, er mål for en beta-catenin reguleret transskriptionsfaktor (fig 4B). Således er disse proteiner, der potentielt kunne reguleres på ekspressionsniveauet af beta-catenin og også modulerer beta-catenin funktion. Vi vil henvise til disse proteiner som “target-interaktionskandidater” for at afspejle denne dobbelte rolle.

(A) Workflow til at identificere beta-catenin transkriptionelle mål, der påvirker beta-catenin transkriptionel aktivitet, og dermed deltage i positive og /eller negativ feedback loops. (B) Sub-netværk af beta-catenin interagerende proteiner, hvis udtryk er reguleret af en transkriptionsfaktor co-aktiveret af beta-catenin ( “target-interaktionskandidater”). Node fyldfarve indikerer virkningen af ​​de interagerende proteiner på beta-catenin transkriptionel aktivitet. Noder med tunge grænser repræsenterer gener, som der er eksperimentelt bevis for transkriptionel regulering af beta-catenin

Fem forskellige transkriptionsfaktorer regulere ekspressionen af ​​mål-interaktionskandidater:.

LEF1

, medlem af TCF /LEF familie transkriptionsfaktorer; androgen receptor

AR

; den CCAAT /enhancer binding protein C

EBPA

; østrogen-receptoren

ESR1

; og den nukleare faktor-kappa-B p105-underenheden (

NFKB1

). Med undtagelse af

LEF1

, disse transkriptionsfaktorer er ikke helt afhængige af beta-catenin for aktivitet; de kan arbejde med andre co-regulatorer eller iværksætte deres egen transskription. Hørte Således vi litteraturen at afgøre, hvad der vides om bidraget fra beta-catenin til transskription af målet-interaktionskandidater vi identificeret. Femten af ​​de mål-interaktionskandidater plus beta-catenin selv er enten blevet vist at være reguleret af beta-catenin i mindre undersøgelser (den Wnt hjemmeside (https://web.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt /target_genes);.. Herbst et al, tabel 1 [17], eller blev reguleret af beta-catenin i mindst to af tre kolon undersøgt i en nylig genom-dækkende undersøgelse [17] kræft cellelinjer Denne gruppe omfatter hovedparten ( 6/8) af det

LEF1

-regulated target-interaktionskandidater, og også flere mål i

ESR1

,

NFKB1

, og

CEBPA

(fig 4B, noder med fed grænser). Ti gener (

CCND1

,

Juni

,

CCND2

,

EGFR

,

LEF1

,

MET

,

MMP7

,

MYC

,

TCF3

,

TERT

, og beta-catenin selv (

CTNNB1

)) blev opreguleret af beta-catenin og to (

FOS

og

CDH1

) blev nedreguleret, for de resterende gener, retningen af ​​beta-catenin effekt blev ikke rapporteret.

ikke alle proteiner, der interagerer med beta-catenin nødvendigvis påvirke dens transkriptionsaktivitet. Derfor er det næste skridt i retning af at identificere potentielle transkriptionel feedback-mæglere var at bestemme hvilken virkning, om nogen, målet-interaktionskandidater havde på transskription regulering funktion af beta-catenin (fig 4A). Vi søgte efter oplysninger adressering effekten af ​​de mål-interaktionskandidater på beta-catenin transkriptionel aktivitet ved hjælp af tekst mining mulighed for STRING-databasen [18] og ved manuelt at gennemgå litteraturen ved STRING nævnt som bevis for interaktion. For målsat interaktionskandidater der er beta-catenin kinaser, vi søgte også den funktionelle annotation af beta-catenin proteoforms i PRO som fosforyleres af disse kinaser. Baseret på denne information, vi identificeret 14 mål-interaktionskandidater der øger (Fig 4B, røde noder) og fire, der sænker (Fig 4B, grønne noder) den transkriptionelle regulatoriske aktivitet af beta-catenin.

mål-interaktionskandidater der potentielt øge beta-catenin transkriptionel regulatorisk aktivitet omfatter beta-catenin selv og flere transkriptionsfaktorer co-reguleret af beta-catenin: tre TCF /LEF familiemedlemmer (

TCF3

,

TCF7L1

, og

LEF1

),

AR

, og

MITF

, som kontrollerer transkription af melanocyt-specifikke gener [19].

To beta-catenin kinases-

FYN

EGFR

-også øget beta-catenin transkriptionel aktivitet.

FYN

phosphorylerer beta catenin på Tyr-142 og

EGFR

phosphorylerer beta-catenin på Tyr-654. Proteoform specifik anmærkning i PRO viser, at Tyr-654-phosphoryleret beta-catenin har øget transskription-funktioner (PR: 000.044.478). Desuden Tyr-142-phosphorylering sænker beta-catenin associering i adherens junction, ved at inhibere binding til alpha-catenin (PR: 000.036.860) hhv. Reduktion af associering med adherens krydset forøger antallet af beta-catenin rådighed for transkriptionel regulering i kernen. Ligeledes to andre mål-interactors-

MET

MUC

-dissociate beta-catenin fra adherens krydset og fremme sin translokation til kernen [20,21].

De mål-interaktionskandidater der sænker beta-catenin transkriptionel regulatorisk aktivitet handle via flere mekanismer: i) ved at fremme beta-catenin nedbrydning (f.eks

GSK3b

phosphorylerer beta-catenin på N-terminale sites (PR: 000.035.772) at fremme sin associering med ubiquitinligase

BTRC

og efterfølgende nedbrydning); ii) via interaktion med “inhibitorer” i kernen (f.eks

TFAP2A

direkte inhiberer beta-catenin co-aktivator-aktivitet ved dannelse af et kompleks med beta-catenin og adenomatøs polypose coli (

APC

) protein i kernen [22]); og iii) ved at forøge beta-catenin associering i adherens junction, derved udskille den væk fra kernen (fx E-cadherin (

CDH1

) associerer med beta-catenin på adherens junction [6]). Det er vigtigt at bemærke, at beta-catenin transkriptionel aktivitet omfatter både dets co-aktivator og co-repressor funktioner. Således, eftersom beta-catenin er blevet vist at undertrykke

CDH1

transkription,

CDH1

beslaglæggelse af beta-catenin væk fra kernen kan faktisk resultere i en stigning i

CDH1

udtryk.

Interessant, kasein kinase II (

CSNK2A1

og

CSNK2A2

, fig 4B, blå noder) ser ud til at være i stand til at deltage i positiv eller negativ feedback afhængig af hvilke sites på beta-catenin det phosphorylerer. Phosphorylering af beta-catenin på Thr-393 øger sin co-aktivator-funktion (PR: 000.044.474), mens phosphorylering af beta-catenin på Ser-29, Thr-102, og Thr-112 (PR: 000.037.187) fører til dets associering med adherens krydset og destabilisering gennem øget samarbejde med kinase

GSK3b

.

Analyse af kinase Signaling for regulering af beta-Catenin transkriptionel aktivitet

Multiple kinome hele små interfererende RNA ( siRNA) knock-down-skærme er blevet udført for at forstå konsekvenserne af kinase signalveje på beta-catenin aktivitet og sub-cellulære fordeling. En sådan undersøgelse identificerede en gruppe af kinaser, der synes at have en positiv regulering af beta-catenin co-aktivator-aktivitet under normale [8] betingelser. En af kinaser identificeret, men ikke yderligere kendetegnet i undersøgelsen, var

CDK5

.

CDK5

er medlem af cyclin-afhængige kinase-familien af ​​proteinkinaser er impliceret i udviklingen af ​​nervesystemet og neuroncelleoverlevelse [23]. For nylig,

CDK5

har vist sig at deltage i talrige biologiske processer uden for nervesystemet, herunder nogle af de samme processer-transkription, celleproliferation og celleadhæsion-, der er reguleret af beta-catenin [24] . CDK5, ligesom beta-catenin, har også været impliceret i tumorigenese. F.eks CDK5 fremmer cellemigration og invasion i bugspytkirtelkræftceller, og inhibering af CDK5 undertrykker pankreatisk tumorvækst og metastase [25]. Aktivering af ERBB2 (HER2) og CDK5 og efterfølgende phosphorylering af STAT3 transkriptionel regulator er forbundet med celleproliferation i medullære skjoldbruskkirteltumorer [26]. Endelig phosphorylering af androgenreceptor ved CDK5 spiller en rolle som drivkraft prostatakræft vækst [27]. Således var vi interesserede i at bruge beta-catenin vidensnetværk for at identificere mulige forbindelser mellem

CDK5

og positiv regulering af beta-catenin co-aktivator-funktion, der kan være relevante for kræft.

CDK5

phosphorylerer beta-catenin på Ser-191 og Ser-246 (PR: 000.037.229); har dog ikke været rapporteret effekten af ​​denne phosphorylering på beta-catenin transkriptionel aktivitet. Selv om det stadig er muligt, at

CDK5

regulerer direkte beta-catenin transkriptionel aktivitet, vi kiggede efter beviser, at

CDK5

kan virke indirekte gennem fosforylering af et andet protein i beta-catenin biologisk netværk. Arbejdsgangen for denne analyse er præsenteret i fig 5A. Først identificerede vi alle proteinerne i beta-catenin netværk, der rapporteres at være cdk5 substrater i vores iPTMnet database. Der var 17 sådanne proteiner, herunder to beta-catenin kinaser (SRC og PAK1), og ErbB3, en co-receptor for to ekstra beta-catenin kinaser,

EGFR

ERBB2

. Desuden rotte

ERBB2

er rapporteret at være en

CDK5

substrat i PhosphoSitePlus [28]. Human og rotte-beta-catenin er 99% identiske og alle de kendte humane beta-catenin phosphoryleringssteder er konserveret; derfor er det plausibelt, at menneskelig

ERBB2

kan også phosphoryleres af

CDK5

. Disse resultater rejser muligheden for, at

CDK5

kan indirekte regulere phosphorylering af beta-catenin gennem dens indflydelse på andre beta-catenin kinaser.

(A) Workflow for at udforske virkningerne af CDK5 på beta- catenin transkriptionsaktivitet. (B) Sub-netværk af cdk5 substrater (blå noder) i beta-catenin netværk (Trin 1 af workflow) (C) Sub-netværk af cdk5 substrater udvalgt til yderligere undersøgelse (trin 2 af arbejdsgang). Veje hvorigennem CDK5-aktivitet påvirker beta-catenin (CTNNB1) phosphoryleringstilstand og transkriptionel aktivitet vises.

Vi næste foretaget en grundig undersøgelse af forholdet mellem CDK5, ERBB2, ErbB3, SRC, PAK1, og beta-catenin baseret på tekst minedrift resultater og PRO funktionelle annotation. Som vist i fig 5B, phosphorylering af beta-catenin af

CDK5

kinaserne det regulerer fører til produktion af fem phosphorylerede proteoforms: en Tyr-654 phosphorylerede form (PR: 000.044.478, produceret af

EGFR

,

ERBB2

, eller

SRC

); en Tyr-333 phosphorylerede form (PR: 000.037.192, produceret af

SRC

); en Tyr-86 /Tyr-654 dobbelt phosphorylerede form (PR: 000.037.194, produceret af

SRC

); en Ser-191 /Ser-246 dobbelt phosphorylerede form (PR: 000.037.229, produceret af

CDK5

); og en Ser-663 /Ser-675 dobbelt phosphorylerede form (PR: 000.030.192, produceret af

PAK1

). Med undtagelse af Ser-191 /Ser-246 phosphorylerede form, PRO annotation indikerer, at alle disse former er transkriptionelt aktiv. Vi brugte RLIMS-P til at identificere sætninger i litteraturen beskriver fosforylering af

ERBB2

,

SRC

, og

PAK1

af

CDK5

og manuelt gennemgået artiklen afsnit med sætningerne for at fastslå virkningen af ​​

CDK5

fosforylering på substrat aktivitet. To af de kinases-

PAK1

SRC

-er hæmmet af

CDK5

og en-

ERBB2

-er aktiveret [28-30]. Således

CDK5

kan tendens til at falde beta-catenin co-aktivator funktion gennem dens virkninger på

PAK1

SRC

og øge samarbejdet aktivator funktion gennem dens virkninger på

ERBB2

. Nettoeffekten af ​​

CDK5

vil afhænge af niveauet af disse tre kinaser, deres relative affinitet for beta-catenin og den cellulære kontekst. Det faktum, at

CDK5

fremmet beta-catenin transkriptionel aktivitet på skærmen siRNA tyder på, at dets rolle i

ERBB2

aktivering kan dominere. Interessant

CDK5

har vist sig at svække beta-catenin associering i adherens junction ved at fremme phosphorylering af Tyr-654 [31]. Da Tyr-654 er den

ERBB2

fosforylering site på beta-catenin, dette resultat er i overensstemmelse med vores hypotese om, at

Cdk5

aktiverer

ERBB2

, som igen phosphorylerer beta- catenin på Tyr-654, hvilket fører til en forskydning af beta-catenin væk fra adherens junction og ind i kernen, hvor den kan tjene som en transkriptionel co-aktivator. Desuden er der i kræftceller,

CDK5

,

ERBB2 /ErbB3

, og beta-catenin er forbundet via et andet medlem af beta-catenin netværk-androgen receptor (

AR

). I

ERBB2

-overexpressing brystkræftceller, beta-catenin co-aktiverer

AR

at drive transskription af flere tumorfremmende mål, herunder

ErbB3 {{}}

[ ,,,0],32]. Som nævnt ovenfor,

AR

aktivering af

CDK5

fosforylering er blevet identificeret som en kræft-kørsel mekanisme i prostata tumorer [27]. Taget sammen med resultaterne af vores kinase analyse, disse observationer tyder på, at CDK5 phosphorylering af både

ERBB2 /ErbB3

AR

kunne køre en feedback-sløjfe, hvor

ERBB2 /ErbB3

fremmer beta-catenin transkriptionel aktivitet, så bidrager til højere udtryk for

ErbB3

. Ved at kombinere kinase og substrat oplysninger i flere phosphoryleringsassays databaser med fosforylering-fokuserede udvinding af den videnskabelige litteratur, vi identificeret en sti forbinder beta-catenin til en opstrøms kinase,

CDK5

, vist sig at påvirke beta-catenin samarbejde aktivator aktivitet i en kinome hele siRNA-skærm.

Analyse af kræft-associerede beta-Catenin mutationer for Cancer Klassifikation

Vi indsamlede næsten 4.100 kræftrelaterede missense mutationer på 137 af 781 rester af beta catenin og kortlagt dem på beta-catenin sekvens kommenteret med sekvens funktioner såsom PTM steder og PTM enzym bindende motiver. Over 90% af kræftrelaterede mutationer forekom i regionen kodet af exon 3 af beta-catenin (resterne 20 til 60). De øverste seks hyppigst muterede steder på tværs af alle typer kræft, der tegner sig for 6-25% af alle kræft-associerede mutationer i beta-catenin (fig 6A, røde prikker) omfatter CKI og

GSK3b

phosphoryleringssteder (Ser -45, Thr-41, Ser-37, og Ser-33) og to særdeles konserverede rester i

BTRC

ubiquitinligase anerkendelse motiv (Asp-32 og Gly-34). Adskillige proteoforms phosphoryleres på forskellige kombinationer af de fire stærkt muterede phosphoryleringssteder er blevet beskrevet i litteraturen (Fig 6B). Mens tre af de fire proteoforms (Fig 6B danner 1, 2, og 3) binder

BTRC

, gør dem ustabile, den fjerde proteoform, fosforyleret på Ser-45 (Fig 6B, formular 4, PR: 000035774), er fundet på den adherens krydset i samarbejde med E-cadherin og i kernen, hvilket tyder på det kan spille i aktiv rolle i vedhæftning og /eller transkriptionel regulering [33].

PTM sites, PTM enzymbinding sites, og hyppighed for kræft-associerede mutationer ved enkelte steder er angivet. (B) Beta-catenin proteoforms phosphoryleret på kombinationer af de fire N-terminale phosphoryleringssteder Ser-33, Ser-37, Thr-41, og Ser-45 og deres funktionelle anmærkning.

For at undersøge mønstret for mutationsfrekvenser tværs enkelte typer kræft, vi udførte hierarkisk clustering analyse for 20 forskellige væv baseret på deres distribution af kræft-associerede mutationer på tværs af de seks hyppigst muterede steder i kræft samlet (Asp-32, Ser-33, Gly-34 , Ser-37, Thr-41, og Ser-45). Da den samlede hyppighed af mutationer af disse steder er ens antager vi tilsvarende frekvens af mutation i vævene i stikprøven. Vi fandt imidlertid to klynger med meget distinkte mutation profiler fremgik af denne analyse (figur 7A). Klynge 1 består af ni væv med mutationer overvejende Asp-32, Ser-33, og Ser-37 og relativt få mutationer i Thr-41 og Ser-45 (fig 7A, blå boks). I modsætning hertil Cluster 2 består af fire væv med mutationer i Thr-41 og især Ser-45 med få mutationer i

BTRC

bindende region (Asp-32, Ser-33, Gly-34, og tjeneste- 37, fig 7A, lyserød æske).